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天花粉蛋白通过下调p－ERK及Cyclin D1表达抑制PC3细胞增殖
目的：探讨天花粉蛋白（TCS）体外对前列腺癌细胞（PC3）生长的抑制作用及可能机制。方法采用噻唑蓝（MTT）检测TCS对PC3细胞的抑制作用。流式细胞术（ FCM）检测TCS对PC3细胞周期的影响，Western印迹检测TCS对ERK、p－ERK及细胞周期调节蛋白Cyclin D1表达的影响。结果 MTT 结果显示 TCS 能有效抑制 PC3细胞的生长，具有时间及剂量依赖性。流式细胞检测发现 TCS能够将 PC3细胞阻滞于 G1期， Western 印迹检测TCS能抑制ERK磷酸化及细胞周期调节蛋白Cyclin D1的表达。结论 TCS对PC3细胞的增殖具有明显的抑制作用，其作用机制可能与抑制丝裂原活化蛋白激酶（ MAPK）细胞增殖信号通路及降低Cyclin D1表达，从而诱导细胞发生G1期阻滞有关。
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天花粉蛋白对绒癌细胞JEG-3体外增殖和HLA-G、HLA-E表达的影响
目的 探讨天花粉蛋白对绒癌细胞JEG-3体外增殖及对HLA-G、HLA-E表达的影响,为临床应用天花粉蛋白抗肿瘤治疗提供理论依据.方法 体外培养高表达HLA-G、HLA-E的绒癌细胞株JEG-3,采用MTT法检测天花粉蛋白对细胞增殖的影响,通过RT-PCR技术和流式细胞分析技术观察其对该细胞中HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白水平表达的影响.结果 实验组不同浓度天花粉蛋白对JEG-3细胞均表现出一定程度的抑制作用,呈浓度依赖性.同100 μg/ml组和对照组相比,1 000μg/ml组天花粉蛋白能明显下调JEG-3细胞中HLA-G mRNA和蛋白水平(均P＜0.01).各组之间HLA-E mRNA和蛋白水平有统计学差异(分别为P=0.014,P=0.028).进一步组间比较,1 000μg/ml组HLA-E mRNA和蛋白水平明显低于对照组(分别为P=0.004,P=0.009).结论 天花粉蛋白能显著抑制绒癌JEG-3细胞的增殖,并能下调该细胞系HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白水平,提示天花粉蛋白抗肿瘤的另一机制可能是其可以打破机体对肿瘤的免疫耐受,从而遏制肿瘤的生长.
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天花粉蛋白抑制Hela细胞增殖的临床作用
目的 探讨天花粉蛋白对宫颈癌细胞株Hela细胞增殖抑制作用的机制.方法 用不同浓度的天花粉蛋白处理人宫颈癌细胞株Hela细胞,采用CCK-8法测定天花粉蛋白对Hela细胞增殖的抑制作用,使用MDC荧光染色观察细胞自噬水平的变化,Western印迹法检测细胞Beclin1和LC3蛋白的表达.结果 天花粉蛋白可显著抑制Hela细胞的增殖,且此作用呈现明显的时间和剂量依赖性;TCS给药后3 h可诱导Hela细胞发生自噬,且这一效果持续到24 h后.结论 天花粉蛋白能够诱导Hela细胞自噬水平的提高,且自噬活化与Beclin1和LC3蛋白的激活有关.
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天花粉蛋白突变体TCSKR173-174CG的构建、表达与纯化
目的 构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化.方法 应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变.以栝楼基因组DNA为模板,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Ni-NTA层析纯化.结果 目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白.结论 已成功构建了TCS突变体基因,并获得高效表达.
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天花粉蛋白的定点突变及聚乙二醇修饰
目的 对天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)进行定点突变及聚乙二醇(PEG)修饰,并对修饰产物进行DNA酶活性分析.方法 选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83和KR173-174)进行定点突变,将所构建的两个突变体(TCSYFF81-83ACS和TCSKR173-174CG)在大肠杆菌中表达,并纯化表达产物.通过第82位和173位引入的半胱氨酸残基,分别对突变体蛋白进行PEG定点修饰.通过与突变型TCS比较,分析两个PEG修饰型TCS的DNA酶活性.结果 突变的TCS经酶切鉴定及测序分析,证明质粒构建正确,表达的目的 蛋白相对分子质量约为30 000,经PEG修饰后,相对分子质量约为40000.初步分析显示,与突变型TCS相比,所构建的两个PEG修饰型TCS也显示出类似DNA酶活性.结论 成功进行了TCS的定点突变及PEG修饰,为基因工程及化学修饰方法改造TCS提供了一条可行的途径.
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天花粉蛋白对结肠癌SW-620细胞株增殖、黏附和迁移的实验研究
目的 研究天花粉蛋白对结肠癌SW-.620细胞株增殖、黏附和迁移的影响.方法 采用MTT比色法检测天花粉蛋白对SW-620细胞的增殖影响；Hochest33258观察天花粉蛋白诱导SW-620细胞凋亡；流式细胞术检测天花粉蛋白对细胞周期和细胞凋亡的影响；细胞黏附和划痕实验检测天花粉蛋白作用后细胞黏附和迁移的改变.结果 1.天花粉蛋白对SW-620细胞的生长具有明显的抑制作用,并呈时间和质量浓度依赖性；2.天花粉蛋白可将SW-620细胞阻滞于S期,并能诱导其凋亡；3.天花粉蛋白具有改变SW-620细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的黏附作用,并使其迁移能力下降.结论 天花粉蛋白能抑制SW620细胞的增殖、诱导其凋亡,并能改变其黏附和迁移能力.
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天花粉蛋白抗肿瘤作用及其机制的研究进展
天花粉蛋白是从栝楼块根中提取出的一种Ⅰ型核糖体灭活蛋白,临床上用于异位妊娠、葡萄胎等疾病的治疗.近年来,关于天花粉蛋白抗肿瘤作用的研究日益增多,并且发现它对肺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞的生长有明显抑制作用.本文将对天花粉蛋白抗肿瘤作用及其机制进行概述.
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天花粉蛋白引起Caski细胞的形态学变化
人子宫颈癌是导致妇女死亡的一种常见恶性肿瘤,严重威胁妇女的健康和生命.天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是从葫芦科植物栝楼(trichosanthin kirilouii maxim)的块根中提取的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP),具有多种生物学效应,主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用[1].目前,TCS的抗肿瘤研究主要集中在绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤,白血病和子宫颈腺癌等方面[2-3].本实验旨在研究TCS对人子宫颈磷癌Caski细胞生长的抑制作用及形态学变化,从细胞凋亡的角度探讨其抗癌作用,为药物的进一步研究提供实验依据.
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天花粉蛋白抑制同种异体混合淋巴细胞反应与诱导IL-9+IL-10/IL-24+Th9细胞间关系的初步探讨
建立同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)体系,采用同位素3H-TdR掺入、FACS、Real-time PCR、ELISA、Western blot等方法研究低剂量Tk抑制细胞增殖反应的效果及作用机制.FACS及同位素掺入检测结果显示,低剂量Tk通过非RIP的方式显著抑制MLR的增殖；Real-time PCR及ELISA结果表明,天花粉抑制的增殖体系中较对照组IFN-γ表达水平降低,IL-4、IL-9、IL-10、IL-24表达水平增强；Western blot显示,Tk使得JNK磷酸化增强.以上结果说明Tk显著抑制人同种异体混合淋巴细胞增殖反应,其负向免疫调节作用可能由多种细胞因子、信号通路及T细胞亚群的介导参与.
关键词： 天花粉蛋白 混合淋巴细胞增殖反应 细胞因子 负向调节 -
天花粉蛋白合成肽通过诱导CD8抑制性T细胞治疗实验性自身反应性脑脊髓炎
为了探讨天花粉蛋白合成肽(M-Tk)治疗实验性自身反应性脑脊髓炎(EAE)的可能性及其作用机制,应用自身抗原MBP衍生肽MOG35-55免疫C57BL/6小鼠成功地诱发EAE后,以流式细胞术测定小鼠淋巴结细胞及脾细胞T亚群及细胞因子的表达,并通过临床评分观察M-Tk治疗EAE的有效性,包括以HE和LFB染色观察髓鞘病变.结果发现,M-Tk可抑制MOG35-55特异性T细胞的增殖反应,选择性诱导CD8+CD28-T调节细胞的扩增,明显提高IL-10的分泌和降低IFN-γ的产生,并有效改善EAE小鼠神经功能评分.采用M-Tk诱导的CD8 T细胞作体内输注可取得相似甚至更好的治疗效果(P>0.01).提示M-Tk在体内诱导产生CD8+CD28-抑制性T细胞并上调IL-10分泌降低IFN-γ产生,是对EAE取得疗效的关键.
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天花粉蛋白合成肽通过激活抑制性CD8+T细胞诱导免疫抑制
为了探讨天花粉蛋白合成肽(M-Tk)诱导免疫抑制的机制,应用小鼠针对可溶性抗原OVA的增殖系统,检测M-Tk处理后对淋巴细胞增殖的抑制作用和细胞因子格局的变化,以及M-Tk激活的T淋巴细胞亚群的表型及功能.结果表明,M-Tk可诱导一群CD8+T抑制性细胞,其表型为CD8+CD28-CTLA4+,采用双层非接触共培养系统发现,该群抑制性细胞主要依赖于细胞因子IL-10、IL-4和细胞间接触发挥免疫抑制作用.
关键词： 天花粉蛋白 CD8+抑制性T细胞 免疫抑制 -
天花粉蛋白联合CD40信号激发的人MoDC介导Th2细胞分化的研究
探讨天花粉蛋白(Tk)联合CD40信号诱导人单核细胞来源DC(MoDC)的成熟活化及其介导Th2细胞分化的作用和机制.采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导人MoDC,并利用鼠抗人CD40激发型单抗(5C11)刺激负载了Tk的DC制备成熟DC.采用免疫荧光标记和流式细胞术分析DC表型(CD80、CD83、CD86、CD14、PDL1)及其摄取FITC-Dextran的能力;ELISA法测定DC上清中IL-12p70的含量;胞内染色和流式细胞术检测经成熟DC活化的T细胞中CD4+IFN-γ+T和CD4+IL-4+T的比例.实验结果显示单独Tk不能刺激DC完全成熟,用Tk负载DC后必须联合外源性成熟刺激信号(如5C11),才能有效促进DC成熟,表现在CD80、CD83、CD86的上调表达,CD14下调表达,DC摄取FITC-Dextran的能力降低.与CD40信号单独诱导组相比,Tk联合CD40信号诱导的成熟DC表面PDL1分子呈下调表达,分泌IL-12的能力显著降低,明显提高T细胞中CD4+IL-4+T的比例.由此表明负载了Tk的成熟MoDC体外能有效介导Th2细胞分化.
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天花粉蛋白及其肽段诱导的免疫抑制依赖APC表面Notch配体的表达
新近发现,Notch信号途径参与调节外周成熟T细胞及其亚群的分化和功能发挥.本研究应用天花粉蛋白及其衍生肽处理骨髓来源的小鼠树突状细胞(DC),检测Notch配体家族分子的表达及DC对CD8+T细胞分泌细胞因子的影响.结果表明,天花粉蛋白或其衍生肽PB处理DC可使Notch配体Jagged1、Delta1分子表达明显增加,并改变CD8+T细胞细胞因子分泌格局,明显抑制Th1相关细胞因子IFN-γ的分泌,而Th2相关细胞因子IL-4和IL-10分泌明显增加.Notch信号的阻断剂可以部分逆转Tk及肽段的抑制作用.表明天花粉蛋白及其衍生肽可诱导一群具有抑制能力的CD8+T细胞,该作用依赖于DC表面Notch配体的表达.
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天花粉蛋白免疫抑制作用的功能性肽段筛选及其作用机制
在人工合成天花粉蛋白(Tk)多个重叠肽段的基础上,采用前期工作中筛选出的天花粉蛋白高敏感(C57BL/6)和低敏感(C3H/He)小鼠近交系,建立OVA特异的体外二次应答增殖系统,检测各肽段抑制能力,并通过细胞剔除及过继试验确认发挥作用的细胞,采用ELISA方法检测细胞因子分泌格局的改变.结果筛选到5条具有明显免疫抑制功能的Tk衍生肽,其中PE和PS对两个品系皆显示抑制活性,而PQ、PB及PJ仅在C57BL/6小鼠中诱导抑制.Tk衍生肽段改变了OVA特异性增殖系统中细胞因子分泌的格局,使得以Th1/Tc1型细胞因子为主状态向Th2/Tc2偏移,表现为IL-4和IL-10分泌增加,而IFN-γ分泌减少.剔除CD8+ T细胞明显解除Tk及其肽段的抑制作用.表明Tk的某些肽段与全蛋白一样具有免疫抑制功能,其机制可能与诱导T细胞向CD8+Tc2方向偏移有关.
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天花粉蛋白对不同小鼠品系T细胞亚群分化的影响
为进一步探讨不同品系小鼠对天花粉蛋白(Tk)免疫抑制敏感性不同的机制,选择Tk高敏感品系(C57BL/6)和低敏感品系(C3H/He)小鼠,建立OVA特异性体外增殖系统,应用流式细胞术胞内细胞因子染色技术分析Th和Tc细胞亚群,real-time PCR检测细胞因子及相关转录因子的mRNA水平.发现Tk作用下,高敏感品系小鼠C57BL/6 IL-4阳性T细胞明显增多,表达IFN-γ阳性T细胞则显著减少.而低敏感品系C3H/He相关变化不明显.T细胞分化相关细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ及转录因子T-bet、gata-3的基因表达水平也呈现类似的格局.提示Tk发挥免疫抑制作用可能与其诱导的以Th2/Tc2为主的T细胞亚群有关,且这种诱导特定细胞亚群的作用在小鼠中和H-2b基因型相关.
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天花粉蛋白通过激活CD8 Tc2亚群诱导人体免疫抑制
为了探讨天花粉蛋白(Tk)诱导免疫抑制的机制,采用抗原非特异性T淋巴母细胞增殖系统,筛选了37个Tk致敏的抑制性T细胞系.分析表明,健康人体内Tk相关抑制性T细胞的频率为5.0×10-7～10.8×10-7,该细胞系属CD8+TCRαβ+,细胞因子表达格局呈现向IL-4和IL-10明显偏移和IFN-γ分泌明显下降的格局.结合我们已有关于CD8+T细胞介导Tk相关应答而不显示细胞毒性的工作,可从表型和功能分析上确认,Tk针对体外人体淋巴细胞增值的免疫抑制,由CD8 Tc2细胞介导.
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天花粉蛋白诱导小鼠Th2/Tc2亚群分化与MHC背景相关
为阐明天花粉蛋白(Tk)诱导免疫抑制和基因调控的机制,应用ELISA方法动态测定小鼠OVA特异性T淋巴细胞培养上清液中T细胞亚群相关细胞因子的含量,观察Tk对高、低易感品系小鼠T细胞分泌细胞因子格局的影响.发现Tk作用下,高易感品系C57BL/6 (H-2b) IL-4、IL-10分泌量大幅度增高,IFN-γ显著下降;而低易感品系C3H/He (H-2k)相应的细胞因子变化极小.上述结果表明:(1)Tk可诱导功能性T细胞亚群向Th2/Tc2方向分化,并导致OVA特异性T细胞增殖受抑;(2)T细胞亚群分化与MHC背景密切相关.提示Tk作用下T细胞亚群的分化受MHC基因调控.
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不同小鼠品系对天花粉蛋白诱导免疫抑制易感性的差异
为了解不同品系小鼠对天花粉蛋白(Tk)诱导的免疫抑制应答能力的差异,应用OVA特异性T细胞体外增殖抑制试验,发现8种近交系小鼠对Tk相关免疫抑制的敏感性不同.根据抑制幅度,C57BL/6 (H-2b)被判为高易感品系(HS, high susceptible),同属H-2k的C3H/He和AKR为低易感品系(LS, low susceptible).Tk浓度为50 ng/ml时的T细胞增值抑制百分率对HS为47.8%±3.4%;对两个LS分别为15.9%±3.0%和18.9%±3.5%,两组间差异显著(P＜0.001).这一差异可持续出现在50～200 ng/ml的Tk剂量范围内.其余5个品系(BALB/c、615、 T739、A、DBA/2)的抑制幅度介于HS和LS之间.这一结果有助于研究相应免疫抑制的基因调控.
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天花粉蛋白引起个体间CD8细胞负调节功能差异性表达的免疫学机制
在天花粉蛋白(Tk)作用下,正常人群可因CD8细胞是否显示负向调节作用而分为介导型(M+)和非介导型(M-)两类,并作为一对遗传性状受HLA-DQ基因调控.本研究表明,M-个体CD8细胞丧失抑制活性是因为激活了一群CD8VV+反抑制T细胞(Tcs),而Tcs的激活可能依赖于CD4阳性诱导细胞的存在.由于Tk可以在M-个体中却不能在M+个体中激活这一诱导细胞,造成只有前者出现CD8Tcs及特定的应答格局.由此推论,DQ基因对Tk相关免疫抑制的调节点在Tcs的诱导水平.
关键词： 天花粉蛋白 反抑制诱导细胞 人体免疫抑制的基因控制 HLA-DQ -
天花粉蛋白对T淋巴细胞功能的调节作用
天花粉蛋白是从中药天花粉中提取纯化的一种活性蛋白,具有引产、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性.近年来的研究发现,天花粉蛋白对免疫系统具有调节作用.本文从细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡三个方面就其对T淋巴细胞功能的调节作用作一综述.
