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CaMKⅡ在8-Br-cAMP诱发的脊髓背角LTP中的作用
目的:探讨钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在8-Br-cAMP诱发的脊髓背角长时程增强(LTP)中的作用.方法:采用SD大鼠,常规细胞外记录技术记录脊髓背角腰膨大部位浅层C-纤维诱发电位.结果:①8-Br-cAMP(1 mmol/L)诱发的脊髓背角LTP咬合(occlude)强直刺激诱导的LTP;②CaMKⅡ选择性抑制剂KN-93(100μmol/L)或AIP(200μmol/L)阻断8-Br-cAMP诱导的脊髓背角LTP;③蛋白质合成抑制剂茴香霉素(200μmol/L)抑制8-Br-cAMP诱发的脊髓LTP.结论:CaMKⅡ参与8-Br-cAMP诱导的脊髓背角C-纤维诱发的LTP;8-Br-cAMP诱导的LTP与强直电刺激诱导的LTP在机制上至少存在部分相同的步骤或途径.
关键词： 长时程增强 钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶 8-Br-cAMP 脊髓背角 病理性疼痛 -
8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞生长相关基因表达的影响
目的探讨8-Br-cAMP对人Eca-109细胞与生长相关基因表达的影响. 方法体外培育的人食管癌Eca-109细胞受8-Br-cAMP处理后,用原位杂交、免疫组织化学及RNA、蛋白质斑点印迹技术研究了与细胞生长相关的几种基因的表达变化. 结果 8-Br-cAMP可减弱EGFR、H-ras、c-myc、突变型p53等基因的表达,增强野生型p53基因表达和p21WAF1蛋白的表达. 结论 8-Br-cAMP可通过影响有关信号传递和细胞周期进程基因表达而抑制细胞生长.
关键词： 8-Br-cAMP 基因表达 Eca-109细胞系 -
8-Br-cAMP诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的实验研究
目的探讨以8-Br-cAMP体外诱导Hela细胞凋亡中,相关基因及蛋白质表达与凋亡之间的关系,为使用无毒性8-Br-cAMP治疗宫颈癌提供依据.方法采用TUNEL法检测凋亡细胞,采用原位杂交和完整细胞原位斑点印迹技术检测凋亡相关基因及蛋白质的表达.结果8-Br-cAMP试验组细胞凋亡率为(40.0±1.32)%,对照组(5.2±0.74)%;8-Br-cAMP可上调wp53,iNOS基因表达,下调mp53,bc1-2,c-myc基因表达,可增强iNOS和FasL的酶活性,降低Fas免疫反应性.以上各结果,试验组与对照组相比P＜0.01.结论8-Br-cAMP能诱导Hela细胞凋亡,可作为一种治疗宫颈癌的新途径.
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8-Br-cAMP提高HSV-TK/GCV自杀基因系统旁观者效应的研究
目的探讨8-Br-cAMP对单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)系统旁观者效应的增强作用及机理.方法应用FCM、透射电镜检测8-Br-cAMP对口腔鳞癌细胞(Tca8113)、间隙连接蛋白43(Cx43)及间隙连接的诱导分化作用;采用析因分析法分析8-Br-cAMP对HSV-TK/GCV系统旁观者效应的影响.结果口腔鳞癌细胞经10-4mol/L 8-Br-CAMP处理后:FCM检测显示Cx43表达阳性的细胞由治疗前的(4.8±0.26)%上升到(21.3±0.65)%,两组比较P＜0.001;透射电镜显示细胞超微结构出现分化,细胞间出现间隙连接;MTT检测显示增强了HSV-TK/GCV系统治疗时的旁观者效应,两者间存在协同关系.结论8-Br-cAMP可诱导分化口腔鳞癌细胞并显著提高HSV-TK/GCV系统治疗时的旁观者效应.
关键词： 单纯疱疹病毒胸苷激酶 8-Br-cAMP 旁观者效应 间隙连接蛋白 -
8-Br-cAMP联合槲皮素对人食管癌Eca-109细胞的逆转化作用
目的 探讨8-Br-cAMP与槲皮素联合用药对人食管癌Eca-109细胞逆转化的作用.方法 将培养的Eca-109细胞随机分为4组:①8-Br-cAMP组(Br):加终浓度为2×10-5mol/L 8-Br-cAMP;②槲皮素组(Q):加槲皮素终浓度为43μmol/L;③8-Br-cAMP和槲皮素共同作用组(Br+Q):加终浓度为2×10-5mol/L8-Br-cAMP和终浓度为43μmol/L的槲皮素;④对照组(C):仅加DMEM培养液(含10%胎牛血清).同时培养48h后分别对以上4组细胞制备细胞滴片及硝酸纤维素膜滴膜两种标本,进行Caspase-3和PCNA的免疫组化和免疫斑点印迹实验;应用完整细胞原位斑点印迹杂交技术检测c-myc、野生型p53(wtp53)、p16和EGFR的基因表达;并进行分化细胞,增殖细胞计数.结果 8-Br-cAMP与槲皮素联合或单独应用均可上调Caspase-3免疫反应信号的表达,下调PCNA免疫反应信号的表达;同时上调wtp53和p16基因的表达,下调c-myc和EGFR基因的表达:且分化细胞的比率显著提高.结论 8-Br-cAMP与槲皮素联合用药或单独用药均可通过调控人食管癌Eca-109细胞癌基因和抑癌基因的表达对Eca-109细胞起到生长抑制和促分化的作用.
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纳米脂质体槲皮素联合8-Br-cAMP对人Rb44细胞组蛋白脱乙酰化酶抑制效应的探讨
目的 探讨纳米脂质体槲皮素(nanoliposomal quercetin,nLQ)联合8-Br-cAMP对培养的人Rb44细胞组蛋白脱乙酰化酶的抑制效应.方法 将培养的Rb44细胞分为4组:nLQ组,以40 μmol·L-1 nLQ培养；8-Br-cAMP组:以20 μmol·L-1 8-Br-cAMP培养;nLQ+ 8-Br-cAMP组；以40 μmol·L-1 nLQ和20 μmol·L-1 8-Br-cAMP共培养；对照组:不加nLQ或8-Br-cAMP.应用MTT实验检测细胞生长抑制率(GSR).应用免疫斑点印迹检测脱乙酰化酶抑制物、NF-κB p65、磷酸化IκBα及c-myc的表达.对表达的靶信号以图像分析仪扫描灰度值.结果 与对照组相比,nLQ组和8-Br-cAMP组GSR达44％±1％和40％±1％,均为P＜0.05；nLQ+ 8-Br-cAMP组GSR达60％±1％,P＜0.01.nLQ组、8-Br-cAMP组、nLQ+ 8-Br-cAMP组与对照组相比,脱乙酰化酶抑制物、NF-κB p65及c-myc的表达均减低,均为P＜0.05;而磷酸化IκBα的表达均增强,均为P＜0.05.结论 nLQ联合8-Br-cAMP可下调脱乙酰化酶抑制物表达,上调磷酸化IκBα的表达同时可抑制NF-κB p65的表达.
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8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤株增殖的影响
目的从细胞水平上探讨8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤株增殖的影响.方法采用8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤株HXO-Rb44细胞进行体外实验,通过蛋白斑点印迹方法检测HXO-Rb44细胞PCNA-IR的OD值,观察其增殖情况,流式细胞术检测细胞周期变化.结果HXO-Rb44细胞增殖受抑制,PCNA OD值与药物作用时间呈显著负相关(P＜0.01),且细胞周期发生改变,被阻滞于G0/G1期,S期比率下降,亦与药物作用时间有关.结论8-Br-cAMP具有抑制Rb44细胞增殖作用,使其阻滞于G1期,为临床治疗视网膜母细胞瘤提供了新的途径.
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纳米脂质体槲皮素联合8-Br-cAMP对Rb44细胞凋亡的影响
目的:探讨纳米脂质体槲皮素(nLQ)和8-Br-cAMP(Br)对人视网膜母细胞瘤Rb44细胞凋亡和p53、p21waf1 mRNA表达及Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响.方法:Rb44细胞分为4组:nLQ组给予终浓度为40 μmol/L nLQ;Br组给予终浓度为2×10-5 mol/L Br,联合用药组给予同上浓度的nLQ和Br,对照组不给药.采用TUNEL法检测各组细胞的凋亡率.采用原位杂交技术检测p53、p21 waf1 mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达.结果:与对照组相比,单用nLQ或Br均可增高凋亡率,上调p53和p21waf1 mRNA的表达及Bax和Caspase-3蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达(P<0.001);.LQ及Br联用呈现协同效应(P<0.001).结论:nLQ和8-Br-cAMP可能通过上调p53和p21 waf1基因的表达,诱导线粒体途径和Caspase-3的终共同凋亡途径而诱导Rb44细胞趋向凋亡,且两药联用呈现协同效应.
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8-Br-cAMP诱导人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞系的凋亡效应
目的:探讨8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞系的凋亡效应.方法:以8-Br-cAMP体外作用HXO-Rb44细胞,分为3个实验组和3个对照组,分别进行24 h,48 h和72 h培养.应用RNA斑点印迹、免疫组化斑点印迹及原位杂交技术,分别对HXO-Rb44细胞的bcl-2杂交信号和PCNA、Fas、FasL表达信号进行检测.采用TUNEL法检测HXO-Rb44细胞的凋亡率.结果:在不同培养时间的实验组中HXO-Rb44细胞的凋亡率明显高于各自的对照组(未经8-Br-cAMP处理);而PCNA、Fas、bcl-2杂交信号扫描数值低于对照组,FasL杂交信号扫描数值高于对照组,尤以48 h的作用显著.结论:8-Br-cAMP可能是通过下调细胞内的bcl-2基因、Fas和PCNA的表达和上调FasL的表达而诱导HXO-Rb44细胞系凋亡.
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槲皮素和8-Br-cAMP对Eca-109细胞抑癌基因表达的影响
目的:探讨槲皮素和8-Br-cAMP对Eca-109细胞抑癌基因表达的影响.方法:将培养的Eca-109细胞随机分成3组:①Br组,加8-Br-cAMP至终浓度为2×10-5 mol/L;②Q组,加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;③C组,不加任何药物,只加入新培养液培养.3组细胞同时培养48 h后,分别提取mRNA.将野生型(wt)p53、p16和p21WAF1 cDNA分别制备成生物素标记的探针,以mRNA斑点印迹阵列显示Eca-109细胞wtp53、p16和p21WAF1基因的表达.将3组细胞分别滴片,同时进行分化染色,记数分化和增殖细胞比率.结果:与C组相比,Br组和Q 组wtp53、p16和p21WAF1mRNA信号增强,P<0.01;Br组和Q 组分化细胞比率显著提高,P<0.01.结论:槲皮素和8-Br-cAMP皆可通过上调wtp53、p16和p21WAF1基因的表达,抑制Eca-109细胞增殖,诱导Eca-109细胞分化.
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8-Br-cAMP对Eca-109细胞凋亡的影响
目的:探讨8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞凋亡的影响及其相关基因表达的变化.方法:采用TUNEL法检测细胞凋亡,应用原位杂交、组织化学、免疫组织化学以及RNA和蛋白质斑点印迹技术相对定量,观察8-Br-cAMP对Eca-109细胞凋亡相关基因及凋亡效应分子表达的影响.结果:8-Br-cAMP作用48 h后可显著诱导Eca-109细胞凋亡,并见到野生型(wt)p53及iNOS基因表达上调,bcl-2、c-myc基因表达下调,iNOS活性增强,Fas-IR减弱.结论:8-Br-cAMP通过调控凋亡相关基因及凋亡效应分子的表达,使之相互作用、相互协同,诱导人食管癌Eca-109细胞的凋亡.其中,wtp53在该凋亡的诸多因素中起着关键作用.
关键词： 细胞凋亡 8-Br-cAMP Eca-109细胞系 原位杂交 斑点印迹 -
8-Br-cAMP对人肺腺癌细胞P53蛋白表达和端粒酶活性的影响
目的:探讨8-Br-cAMP对人肺腺癌细胞株A549细胞端粒酶活性和P53蛋白表达的影响.方法:用终浓度分别为20 μmol/L及60 μmol/L的8-Br-cAMP处理人肺腺癌细胞株A549细胞,以未处理者为空白对照.采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性,用免疫荧光标记法测定P53蛋白的表达.结果:8-Br-cAMP作用后的A549细胞,端粒酶活性明显降低,P53蛋白表达明显减少.结论:8-Br-cAMP能抑制肺腺癌细胞的端粒酶活性和P53蛋白的表达.
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8-Br-cAMP对肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因表达的影响
目的:观察8-Br-cAMP对人肺癌NSCLC-3细胞凋亡相关基因表达的影响.方法:将体外培育的NSCLC-3细胞分为实验组和对照组,采用原位杂交方法观察8-Br-cAMP对NSCLC-3细胞c-myc、bcl-2基因表达的影响.结果:8-Br-cAMP处理后的实验组较未加8-Br-cAMP的对照组c-myc、bcl-2基因表达降低(P＜0.01).结论:8-Br-cAMP可下调与NSCLC-3细胞凋亡相关的c-myc、bcl-2基因表达.
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8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞DNA polβ基因及相关基因表达的影响
目的:探讨8-Br-cAMP及槲皮素等分化诱导剂对Eca-109细胞DNA polβ基因及相关基因表达的影响.方法:将培养的Eca-109细胞分为3组:①加8-Br-cAMP组(Br组);②加槲皮素组(Q组);③不加任何药物对照组(C组).同时培养48 h,将野生型DNA polβ的cDNA, EGFR cDNA,野生型(wt) p53 cDNA及c-myc cDNA分别制备了生物素/地高辛标记的探针进行原位杂交和RNA斑点印迹阵列.另进行POLB,XRCC1,VEGF及PCNA的免疫组化染色及免疫斑点印迹阵列.结果:Br组和Q组的DNA polβ,EGFR,c-myc基因表达下调而wtp53基因表达上调.POLB,XRCC1,PCNA及VEGF免疫斑点印迹减弱.8-Br-cAMP及槲皮素显著下调Eca-109细胞的DNA polβ基因表达及相关癌基因表达,同时上调抑癌基因的表达.作为POLB的异二聚体XRCC1及恶性细胞生物标志的PCNA及VEGF表达下调.结论:分化诱导剂下调Eca-109细胞DNA polβ基因表达,提示Eca-109细胞的polβ基因是高表达的;功能调整后的polβ通过相关基因表达的改变尤其是wt p53基因表达的上调在癌细胞分化中可能起重要作用.
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8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白及其mRNA表达的影响
目的:应用Southwestern技术研究8-Br-cAMP和槲皮素(quercetin)对Eca-109细胞DNA结合蛋白与p16基因启动子区的结合调控mRNA表达的影响.方法:将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组:加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组:加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组:不加任何药物,只加入新培养液培养.同时培养48 h,应用质粒提取及限制性酶切回收目的DNA片段,采用生物素随机引物标记探针;应用DNA斑点印迹技术检测探针的灵敏度后以Southwestern印迹技术检测与p16基因启动子区特异性结合的DNA 结合蛋白(DBP);以原位杂交检测p16基因mRNA的表达情况.结果:实验组条带强于对照组,Br组强于Q组;核基质DNA结合蛋白主带位于Mr66 000、58 000和20 000;核外DNA结合蛋白主带位于Mr40 000、28 000和20 000;2者中20 000是共同成分.原位杂交技术显示p16基因mRNA蓝紫色信号颗粒位于胞质,杂交信号以实验组较强.结论:8-Br-cAMP和quercetin尤其是前者作用于人食管癌Eca-109细胞,诱导产生与p16基因启动子结合较强的DBP,启动p16基因表达.
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8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞相关基因的DNA拷贝和基因表达的影响
目的:探讨8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞wtp53、c-myc、bcl-2基因的扩增、表达以及VEGF表达的影响.方法:将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组:加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组:加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组:不加任何药物,只加入新培养液培养.3组细胞同时培养48h.以cDNA 阵列技术显示Eca-109细胞凋亡中wtp53、c-myc、bcl-2 DNA拷贝和mRNA的表达,以免疫组化法显示VEGF的表达.结果:Br组和Q组与C组相比wtp53 DNA拷贝和mRNA信号较强,c-myc、bcl-2 DNA拷贝和mRNA信号较弱,VEGF表达较弱.结论:8-Br-cAMP和槲皮素皆可通过上调wtp53,下调bcl-2、c-myc基因的扩增和表达,下调VEGF的表达,而诱导Eca-109细胞凋亡.
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8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞内游离钙离子浓度的影响
目的:观察8-Br-cAMP和槲皮素对人食管癌Eca-109细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响.方法:将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组:加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组:加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组:不加任何药物,只加入新培养液培养.3组细胞同时培养48 h,用激光共聚焦显微镜观察3组细胞内钙离子的荧光强度.结果:对照组细胞内游离钙离子荧光强度为59.2±8.1,Br组细胞内游离钙离子荧光强度为63.3±8.5,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);Q组细胞内游离钙离子荧光强度为113.3±12.5,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论:提示Br和Q诱导细胞凋亡的信号传导途径可能存在一定差异.
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8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞周期及凋亡的影响
目的:观察8-Br-cAMP和槲皮素(quercetin)对Eca-109细胞周期及凋亡的影响.方法:将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组:加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组:加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组:不加任何药物,只加入新培养液培养.3组在同等条件下继续培养48 h.采用流式细胞仪检测细胞的周期,采用TUNEL法检测细胞凋亡百分率,采用DNA琼脂糖凝胶电泳法观察细胞DNA降解情况.结果:2实验组细胞中G2-M期细胞比例较对照组显著上升(P<0.01).细胞凋亡百分率:2实验组显著高于对照组(P<0.01);Br组和Q组相比,差异无统计学意义(P>0.05).DNA琼脂糖凝胶电泳中Br组和Q组皆呈DNA"梯样型"带,对照组未呈现DNA降解.结论:8-Br-cAMP和槲皮素皆可阻滞Eca-109细胞于G2-M期,并进一步诱导Eca-109细胞凋亡.
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8-Br-cAMP对Hela细胞wtp53,mtp53,c-myc和iNOS基因表达的影响
目的:探讨8-Br-cAMP对Hela细胞癌基因和抑癌基因等表达的影响.方法:将培养的Hela细胞分为3组:①8-Br-cAMP组(Br组): 加至8-Br-cAMP终浓度为2×10-5mol/L;②阳性对照组(60Co组):给予60Co 照射量4 Gy,720 s;③阴性对照组(C组):仅加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液.各组细胞均培养48 h后,将1×107 ml-1细胞悬液滴加至预先处理过的硝酸纤维素膜和载玻片上.应用原位杂交和完整细胞原位斑点印迹技术分别检测3组Hela细胞中野生型p53(wtp53)、突变型p53(mtp53)、c-myc和iNOS基因的表达.结果:8-Br-cAMP组与阳性对照组相比,差异无统计学意义,P>0.05;与阴性对照组相比,上调wtp53和iNOS基因的表达,同时下调mtp53和c-myc基因的表达,P<0.01.结论:结果提示8-Br-cAMP可能通过调控Hela细胞癌基因和抑癌基因的表达对Hela细胞起到生长抑制和促分化作用.
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8-Br-cAMP和槲皮素单独和联合应用对Eca-109细胞POLB及多药耐受相关蛋白的影响
目的:探讨8-Br-cAMP和槲皮素单独和联合应用对Eca-109细胞耐药性的影响.方法:将培养的Eca-109细胞随机分为4组:①8-Br-cAMP组(Br组); ②槲皮素组(Q组); ③(Br+Q)组; ④不加药物的对照组(C)组.同时培养48 h,对以上4组细胞制备细胞滴片及硝酸纤维素膜(NCM)滴膜2种标本,分别进行MRP和POLB的免疫组化染色和免疫斑点印迹阵列及TLC扫描.结果:免疫组化染色显示: C组的MRP-IR、POLB-IR强于Br组、Q组或(Br+Q)组,P<0.01.TLC扫描OD值:C组MRP-IR高于Br、Q(Br+Q)组约3倍;POLB-IR高于Br、Q或(Br+Q)组约2倍;MRP与POLB呈显著正相关r=0.983 8,P<0.01.结论:8-Br-cAMP和槲皮素联合用药或单独用药均可降低Eca-109细胞的多药耐受性而提高药物的敏感性,可有利于提高临床疗效.
