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过氧化氢诱导人黑素细胞氧化性损伤对TLRs表达的影响
目的 观察过氧化氢(H2O2)诱导人黑素A375细胞出现氧化性损伤后,TLRs的表达变化与白癜风病理过程的关系.方法 利用不同浓度的过氧化氢处理A375细胞,分为空白对照组(不予H2O2处理)及3个不同浓度(100、500和1000 μmol/L)H2O2处理的实验组,分别作用24、48、72h后,通过黑色素含量检测试剂盒检测诱导后细胞的黑色素含量变化,CCK8检测细胞氧化损伤程度,同时通过qPCR检测过氧化氢诱导后A375细胞中TLRs的表达变化.结果 500μmol/L和1000 μmol/L的H2O2能显著诱导A375细胞损伤,其中500μmol/L处理72h时细胞活性损伤率约为50％,1000 μm ol/L过氧化氢处理72h时细胞活性损伤＞50％.黑色素含量检测显示,500μmol/L和1000 μmol/L过氧化氢处理后A375细胞中黑色素含量降低显著.qPCR检测结果显示TLRs家族基因的表达均不同程度上调.结论 综合评估过氧化氢诱导后细胞活性和细胞内黑色素含量的变化,确定500 μmol/L处理72h为A375细胞氧化应激损伤的佳诱导条件.初步提示TLRs家族可能在氧化应激诱导的黑色素细胞损伤的过程中发挥重要作用,为开发新的药物靶点提供依据.
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氧化苦参碱增强多西他赛对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用
目的 观察氧化苦参碱对多西他赛抑制黑色素瘤细胞增殖的作用.方法 将传代的A375细胞分为4组:生理盐水组、多西他赛组、氧化苦参碱组和两种药物联合组,在不同的时间点通过MTT的方法检测药物对细胞增殖的作用;流式细胞仪检测细胞周期;通过WESTERN BLOT以及PCR的手段检测不同因素作用下相关蛋白的变化.结果 对细胞作用24h,5μg/ml多西他赛、10 μg/ml氧化苦参碱以及两种药物联合处理组对A375细胞的增殖抑制率分别为(22.41 ±11.96)％、(12.96±4.33)％和(64.42±0.74)％.药物联合使用对A375细胞的抑制作用显著高于各单药组相同剂量药物,各组间差异具有统计学意义(P＜0.05).生理盐水组以及不同药物处理组细胞周期G1期的百分比分别为(68.09 ±6.75)％、(72.19±5.44)％、(76.65±1.88)％和(86.51±3.41)％.药物联用组对G1期阻滞作用增强.各组数据间差异具有统计学意义(P＜0.05).氧化苦参碱也可增强多西他赛对蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6的抑制作用.结论 氧化苦参碱(10 μg/ml)可显著增强低浓度的多西他赛(0.01 ×PPC)对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用,联合应用能够降低多西他赛的使用浓度,减少其引发的不良反应.
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柚皮苷抑制黑色素瘤的生长与转移
目的 初步探索柚皮苷对黑色素瘤细胞生长与迁移的抑制作用.方法 使用不同浓度的柚皮苷分别处理A375细胞,应用MTT法检测不同处理因素对A375细胞增殖的影响,利用TRANSWELL实验检测不同处理因素对A375细胞迁移的作用.通过WESTERN BLOT及REAL-TIMEPCR方法检测不同因素作用下相关蛋白的变化.结果 不同浓度的柚皮苷对A375细胞增殖与迁移均有一定的抑制作用,其中10、20、40 μm/L柚皮苷作用24h后,对A375细胞增殖的抑制率分别为(40.01±0.74)％、(48.69±3.66)％和(54.32±1.61)％.20、40 μm/L柚皮苷作用24h后,对A375细胞迁移的抑制率分别为(18.44±3.89)％和(38.14±7.98)％.柚皮苷对A375细胞增殖与迁移功能的抑制作用随着剂量增加.柚皮苷对调控细胞增殖、迁移的CDK4等蛋白均有抑制作用.结论 柚皮苷对黑色素瘤细胞A375细胞增殖与转移均有抑制作用,可以作为临床治疗黑色素瘤的新的潜在药物而进一步研究.
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防己诺林碱增强吉西他滨诱导的黑色素瘤细胞凋亡
目的 观察防己诺林碱对吉西他滨导致的细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制. 方法 将人黑色素瘤细胞A375分为4组,分别用生理盐水(对照) ,吉西他滨、防己诺林碱以及两种药物联合处理,通过MTT的方法检测不同时间不同处理因素作用下细胞的光密度值(OD490),确定药物对细胞增殖的作用;用AV-PI染色的方法用流式细胞仪检测不同组凋亡细胞比例;Hoechest 33258染色的方法观察不同组别下细胞的凋亡情况;通过Western Blot以及Realtime PCR检测不同因素作用下凋亡相关蛋白的变化. 结果 对细胞作用24 h时,10 μg/ml防己诺林碱,1 μg/ml吉西他滨,以及两种药物联合处理组A375细胞增殖的抑制率分别为4. 07% ± 1. 95%,45. 22% ± 2. 25%和75. 71% ± 1. 01%. 两种药物联用A375细胞增殖的抑制作用显著强于各单药组作用,各组数据间差异显著(P<0. 05). 对细胞作用24 h时,不同处理组细胞凋亡的百分比分别为2. 07% ± 0. 27%,3. 35% ± 0. 20%,4. 15% ± 0. 07%和6. 12% ± 0. 51%. 药物联用作用下细胞凋亡率增加. 各组数据之间有显著差异(P<0. 05). 防己诺林碱也可以显著增强吉西他滨对凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX和Caspase 3的调控. 结论 低浓度防己诺林碱(10 μg/ml)可以显著增强极低浓度的吉西他滨(0. 01 × PPC)对抑制黑色素瘤细胞A375细胞凋亡的促进作用,联合应用可达到更好的治疗效果.
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青藤碱增强表柔比星对黑色素瘤细胞侵袭的抑制作用
目的 初探青藤碱如何增强表柔比星对黑色素瘤细胞侵袭的抑制作用.方法 应用Transwell方法检测不同处理因素对A375细胞侵袭的影响.处理因素分为4组,分别为:生理盐水组(对照),表柔比星处理组、青藤碱处理组和两种药物联合处理组.通过Western blot及Real-time PCR检测不同因素作用下侵袭相关蛋白的变化.结果 5μ∥mL表柔比星、10μg/mE青藤碱以及两种药物联合处理组24h后对A375细胞侵袭的抑制率分别为20.40％ ±4.63％、14.40％±2.67％和50.32％±3.02％.药物联用后对A375细胞侵袭的抑制作用显著高于各单药组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).青藤碱可以增强表柔比星对侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的抑制作用.结论 低浓度青藤碱(10μg/mL)可以显著增强低浓度表柔比星(0.1×PPC)对黑色素瘤细胞A375细胞侵袭的抑制作用,青藤碱可以作为化疗过程中的辅助用药,起到优化治疗效果的作用.
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芹菜素通过抑制Src通路抑制黑色素瘤细胞增殖
目的 探讨芹菜素如何通过调节Src通路来抑制黑色素瘤细胞增殖.方法 采用不同浓度的芹菜素处理黑色素瘤细胞系A375,使用HEK293细胞系(正常细胞系)作为对照,通过MTT实验观察芹菜素是否可以特异性抑制肿瘤细胞的增殖.进一步通过Western blot以及实时PCR检测芹菜素对A375细胞中Src通路增殖相关蛋白CDK4和CDK6的影响.结果 MTr检测结果发现芹菜素对HEK293细胞的增殖抑制作用不明显,但是10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L与80μmol/L的芹菜素分别作用于A375细胞后对细胞增殖的抑制率分别为(22.12±7.20)％、(27.08±4.37)％、(37.39±2.72)％和(39.00±1.57)％,而且随着药物的浓度增加对A375细胞增殖的抑制率增加.Western blot和实时PCR检测发现,20 μmol/L、40 μmol/L与80 μmol/L的芹菜素均可以抑制A375细胞中Src通路下游CDK4和CDK6蛋白的表达.结论 芹菜素可以通过抑制Src通路显著抑制黑色素瘤细胞系A375的增殖,对正常细胞作用较小,可以作为潜在的化疗药物应用于黑色素瘤的化疗.
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miR-489通过打靶PAK5抑制黑色素瘤的迁移
目的 探讨miR-489对黑色素瘤迁移的抑制作用.方法 通过Transwell实验检测miR-489对黑色素瘤迁移的影响;荧光素酶报告基因实验检测A375细胞中miR-489对PAK5的靶向作用;进一步通过Western blotting以及实时PCR检测miR-489对于A375细胞中PAK5的影响.结果 Transwell实验发现miR-489过表达后可以显著抑制A375细胞的迁移,当miR-489受到抑制后,A375细胞的迁移受到促进.荧光素酶报告基因实验证明,miR-489可以直接作用于PAK5.Western blotting和实时PCR检测发现,过表达miR-489可以抑制A375细胞中PAK5蛋白的表达;当miR-489受到抑制后蛋白表达有所增加.结论 miR-489可以通过打靶PAK5抑制黑色素瘤细胞的迁移.
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内皮素受体B在黑素瘤中的表达及内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促生长效应
目的 研究内皮素受体B(ETR-B)在人恶性黑素瘤中的表达及内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促生长效应.方法 采用免疫组化SP法检测ETR-B在黑素瘤组织中的表达,用RT-PCR法检测ETR-B基因在人恶性黑素瘤细胞A375和SK-mel-1中的表达,用MTT比色法检测不同浓度内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促增殖活性.结果 ETR-B在41例恶性黑素瘤和23例色素痣中的阳性率分别为78.05%和8.69%,两组间差异有统计学意义,P＜0.05.15例原位和26例Ⅰ～Ⅳ期恶性黑素瘤ETR-B阳性表达率分别为53.33%和92.31%,两组比较,P＜0.05.13例转移性恶性黑素瘤(Ⅲ～Ⅳ期)中ETR-B阳性表达率100%,28例未转移者(0～Ⅱ期)的阳性表达率为67.86%,两组比较,P＜0.05.ETR-B基因在人恶性黑素瘤细胞A375和SK-mel-1中均有表达;内皮素3对黑素瘤细胞A375在体外具有很强的促增殖作用,且促增殖能力呈内皮素3浓度依赖性.结论 内皮素3/ETR-B在促黑素瘤细胞生长中有重要作用.
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内皮素3上调黑素瘤细胞株A375表达骨桥蛋白的研究
目的 探讨内皮素受体(ETR)-B拮抗剂BQ788和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂LY294002对黑素瘤细胞株A375骨桥蛋白基因的表达.方法 对照组在人A375细胞培养体系中加入100nmol/L内皮素3,试验组除加入100nmol/L内皮素3外,分别加入1 μmol/LBQ788和20μmol/L、50 μmol/L LY294002,采用RT-PCR和蛋白质印迹方法检测骨桥蛋白的mRNA和蛋白表达.结果 ETR-B拮抗剂BQ788和PI3K抑制剂LY294002均能显著减少人恶性黑素瘤细胞株A375中骨桥蛋白mRNA和蛋白的表达,与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).高浓度较低浓度LY294002对骨桥蛋白表达的抑制作用更明显(P＜0.05).结论 内皮素3/ETR-B能通过激活PI3K信号通路上调骨桥蛋白的表达.
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白介素－8与表皮生长因子对黑素瘤A375细胞增殖的影响
目的：：明确IL－8与表皮生长因子( EGF)对黑素瘤细胞增殖的影响。方法：将黑素瘤细胞A375分为9组：EGF组；EGF＋AG1478组；AG1478组；IL－8组；IL－8I组；IL－8＋IL－8I组；EGF＋ IL－8组；EGF＋IL－8＋AG1478＋IL－8I组及对照组。采用MTT法检测各组细胞增殖情况；免疫印迹法检测EG-FR、蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶、磷酸化蛋白激酶B、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶、磷酸化表皮生长因子受体的表达；实时荧光定量聚合酶链式反应检测EGFR与IL－8R mRNA水平的表达。结果：EGF组黑素瘤细胞增殖、上述蛋白的表达和mRNA水平显著高于对照组、EGF＋AG1478组和AG1478组。IL－8组显著高于对照组、IL－8I组和IL－8＋IL－8I组(均P<0.05)，EGF＋AG1478组显著高于EGF组和IL－8组( P<0.05)。结论： IL－8与EGF均能促进人黑素瘤细胞的增殖，它们之间可能具有相互协同作用，这种协同作用可能与AKT和MAPK等共同通路作用有关。
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丹皮酚对人黑素瘤 A375和 M14细胞系增殖与凋亡的影响
目的：确定丹皮酚对体外培养人黑素瘤A375和M14细胞增殖与凋亡的影响。方法：利用CCK8检测黑素瘤A375和M14细胞的增殖抑制率；以流式细胞仪检测细胞周期变化、Annexin-V/PI法观察细胞凋亡的变化；用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态变化。结果：细胞周期显示丹皮酚处理过的A375和M14细胞G2/M期比例均高于对照组。以0 mmol/L、1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L丹皮酚作用24 h后，A375细胞的早期凋亡率分别为3.11％±0.53％，13.74％±1.73％，25.95％±0.57％和46.44％±0.81％；M14细胞的早期凋亡率分别为1.00％±0.08％，2.00％±0.01％，2.99％±0.29％和14.73％±0.94％，呈剂量依赖性诱导 A375和 M14细胞凋亡。经5 mmol/L 丹皮酚作用后 Ho-echst33258染色示凋亡细胞形态改变。结论：丹皮酚对黑素瘤A375和M14细胞均具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。
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EGCG对黑素瘤A375细胞增殖及RASSF1A基因表达的影响
目的:评价表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人黑素瘤A375细胞增殖及Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因表达的影响.方法:不同浓度的EGCG处理A375细胞后,分别于不同时间点用MTr法检测A375细胞的生长抑制率；并应用甲基化特异性PCR法以及荧光半定量PCR法检测EGCG作用前后细胞中RASSF1A甲基化及mRNA的表达.结果:EGCG浓度在5～30 μg/mL时抑制细胞生长并呈时间剂量依赖；作用后可使RASSF4A基因由原有的高甲基化变为低甲基化；细胞中RASSF1A基因的mRNA表达量与药物作用浓度和作用时间呈正相关.结论:EGCG可以抑制A375细胞的生长,并可通过逆转RASSF1A基因启动子区域甲基化状态,恢复该基因在细胞中的部分表达,从而达到抑制其增殖的作用.
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白藜芦醇对黑素瘤细胞株A375增殖及骨桥蛋白表达的影响
目的:确定白藜芦醇(Resveratrol,Res)对黑素瘤细胞株A375细胞增殖及骨桥蛋白表达的影响.方法:用不同浓度的白藜芦醇处理A375细胞,MTT比色法分别检测白藜芦醇对细胞增殖的抑制作用,RT- PCR和蛋白印迹方法检测骨桥蛋白的mRNA和蛋白的表达.结果: 白藜芦醇对A375细胞增殖的抑制呈时间和浓度依赖性；白藜芦醇能显著减少内皮素作用后黑素瘤细胞株A375骨桥蛋白中mRNA和蛋白的表达(P＜0.05).结论: 白藜芦醇作为内皮素受体拮抗剂有可能通过抑制内皮素受体(ETR-B)下调骨桥蛋白的表达,进而抑制A375细胞的增殖.
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叶酸对正常人成纤维细胞及黑色素瘤细胞端粒长度及基因组稳定性的影响
目的 探讨叶酸(folic acid, FA)缺乏-充足条件,对皮肤来源的人正常和癌细胞株的端粒长度及基因组稳定性的影响.方法 含FA 30～3 000 nmol/L的培养液干预培养人正常皮肤成纤维细胞株BJ及黑色素瘤细胞株A375 21天,以RT-qPCR技术分析受试细胞端粒绝对长度(absolute telomere length, aTL),以胞质分裂阻断微核细胞组实验(CBMN-Cyt)的染色体不稳定性(Chromosomal instability, CIN)指标来评价基因组稳定性改变情况.结果 BJ细胞在FA 30 nmol/L,端粒长度随干预时间延长呈现异常增长或缩短,CIN率明显上升(P＜0.05),在FA 100～300 nmol/L时,端粒长度、CIN率与FA浓度呈正相关;在FA 1 000 nmol/L时,端粒长度改变较小,CIN率维持不变.A375细胞在FA 30、300～3 000nmol/L时,端粒长度在15天时增长、21天时缩短的趋势(P＜0.05),CIN率在FA30 nmol/L时显著升高(P=0.013).结论 A375细胞的端粒与基因组稳定性变化对于叶酸没有明显依赖;叶酸缺乏在正常细胞BJ中会诱发端粒长度的异常和基因组不稳定性.
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银胶菊内酯对人皮肤癌细胞HaCaT和A375凋亡机制的研究
目的:研究银胶菊内酯对人皮肤癌细胞HaCaT和A375凋亡的影响.方法:XTT法检测银胶菊内酯对HaCaT和A375细胞的增殖抑制作用;荧光染色法检测细胞形态学变化;ELISA法检测细胞DNA断裂影响;流式细胞仪检测细胞周期.结果:银胶菊内酯明显抑制HaCaT和A375细胞的增殖,IC50值分别为1.45 μmol L-1和2.9μmolL-1;银胶菊内酯处理过的细胞中出现核碎裂现象,而在对照组细胞中则无此现象;银胶菊内酯诱导HaCaT和A375细胞DNA断裂的长度分别为1.41nm和0.38 nm,当用银胶菊内酯对HaCaT细胞处理24 h后,S期的细胞比例明显增加(P＜0.05);当用银胶菊内酯对A375细胞处理24 h后,G0～G1期的细胞比例明显增加(P＜0.05).结论:低浓度的银胶菊内酯能通过分别阻滞HaCaT和A375细胞的S期和G0～G1期诱导细胞凋亡.
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抗TfR抗体诱导黑色素瘤细胞凋亡研究
目的:观察抗TfR抗体对人黑色素瘤细胞系A375凋亡的影响.方法:通过流式细胞术分析抗TfR抗体对A375细胞分别作用24、48和72小时后凋亡的影响.结果 与空白细胞对照组相比,抗TfR抗体作用于肿瘤细胞24及48小时后对肿瘤细胞凋亡并无影响,而当作用72小时后抗体可显著诱导肿瘤细胞的凋亡.结论:抗TfR抗体单独作用可诱导黑色素瘤细胞凋亡.
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全反式维A酸、阿维A和他扎罗汀对人黑色素瘤细胞A375凋亡和Bax/Bcl-2蛋白表达的影响及意义
目的探讨全反式维A酸(ATRA)、阿维A及他扎罗汀对人黑色素瘤细胞A375凋亡及Bax/Bcl-2蛋白表达的影响及其意义.方法采用体外培养和流式细胞仪检测细胞凋亡(Annexin V-PI法),SABC免疫细胞化学方法检测细胞Bax/Bc1-2蛋白表达情况.结果浓度均为10-5mol/L的ATRA、阿维A及他扎罗汀能不同程度地诱导了人黑色素瘤细胞A375凋亡,其中阿维A作用为显著,凋亡率13.42%,明显高于对照组、ATRA及他扎罗汀组(均P＜0.05);其次为ATRA(5.03%,明显高于对照组及他扎罗汀组,P＜0.05)和他扎罗汀组(凋亡率2.88%).3种维A酸亦使A375细胞Bax蛋白阳性表达增强而Bcl-2蛋白阳性表达减弱(P＜0.05),其中阿维A作用强,其次为ATRA和他扎罗汀.结论维A酸促进A375细胞凋亡可能部分通过以线粒体为核心的凋亡途径.阿维A可能是防治黑色素瘤的有效药物.
关键词： 维A酸 人黑色素瘤细胞 A375 凋亡 Bax/Bc1-2蛋白 -
薯蓣皂苷元衍生物的抗肿瘤活性研究
目的 研究薯蓣皂苷元衍生物在体外的抗肿瘤活性.方法 采用MTY法对人恶性黑色素瘤细胞A375、人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG -2及人慢性髓原白血病细胞株K562进行体外抗肿瘤活性试验.结果 薯蓣皂苷元衍生物对4个肿瘤细胞株A375、A549、K562、HepG -2具有不同程度的抗肿瘤活性.结论 绝大部分薯蓣皂苷元衍生物对4个肿瘤细胞株有较好的抗肿瘤活性,IC50值都低于30 μmol·L-1.化合物22对细胞株A375的IC50=4.48 μmol·L-1,化合物9、10对细胞株K562的IC50分别为2.51、2.38 μmol·L-1;显示其抗肿瘤活性与对照化合物1-(3β-薯蓣皂苷元)-3-苄基咪唑溴盐相当.
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Bcl-2硫代反义寡核苷酸对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响
目的: 研究bcl-2硫代反义寡核苷酸(bcl-2 ASODN)对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法: 采用MTT法、激光共聚焦显微镜、TUNEL法和AnnevinV/PI双染法检测bcl-2 ASODN对A375细胞增殖和凋亡的影响.应用RT-PCR方法,观察bcl-2 ASODN 处理前后bcl-2 mRNA在A375细胞表达水平的变化.结果: MTT法检测显示bcl-2 ASODN抑制A375细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性;经30 μmol/L ASODN作用48 h,激光共聚焦显微镜观察细胞呈现典型凋亡特征;TUNEL染色可见ASODN组多数A375细胞核被标记呈棕褐色,而SODN组和对照组细胞核未被明显标记;Annexin V/PI检测ASODN组凋亡细胞比例升高,与SODN组和对照组均有显著性差异(P＜0.001);RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA表达水平下降.结论: bcl-2 ASODN可抑制A375细胞增殖和诱导A375细胞凋亡,其诱导凋亡的机制是下调bcl-2 mRNA的表达.
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Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株
目的 构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定,转染人黑素瘤细胞A375,使其过表达RhoD蛋白,为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础.方法 Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,与辅助质粒pLV/helper-SL3,pLV/helper-SL4及pLV/helper-SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine 2 000复合物,并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装,产生相应慢病毒颗粒,通过定量PCR方法测定病毒滴度.包装好的慢病毒转染人黑素瘤A375细胞,荧光显微镜下观察荧光表达情况,流式细胞仪检测转染效率;实验分为A375(未处理对照组)、A375-EGFP(不合目的基因的空病毒对照组)和A375-RhoD(含RhoD基因的病毒组)三组,采用实时荧光定量PCR (QPCR)及免疫印记法(western blotting,WB)验证RhoD在A375-RhoD组细胞中的过表达.结果 通过PCR、基因测序证实,慢病毒表达载体pLV[Exp]-EGFP/NeoCMV＞ hRhoD构建成功.与辅助质粒共转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒,经测定病毒滴度为(5.13±2)×108 TU/mL.转染A375细胞后可见明显的绿色荧光表达,流式检测转染效率大于80％;A375-RhoD组RhoD mRNA及蛋白水平均较A375-EGFP组和A375组细胞中明显增高.结论 成功构建RhoD慢病毒表达载体,包装出具高效感染力的慢病毒颗粒并成功转染人黑素瘤A375细胞,为进一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供实验基础.
