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人ATP7B转基因大鼠模型的建立及其在转基因大鼠体内的表达分析
目的利用受精卵的雄性原核显微注射法,建立人ATP7B转基因大鼠模型.方法将构建7.1kb含有鸡β肌动蛋白启动子的人正常ATP7B cDNA,经显微注射法导入Wilson's病动物模型LEC(Long-Evans Cinnamon)大鼠的受精卵,利用PCR法筛选、鉴定阳性转基因大鼠,以RT-PCR和Western bolt检测人ATP7B在转基因大鼠体内的表达,并从血液生化指标和临床症状上对16周龄内的阳性转基因大鼠进行分析.结果建立了3株独立的转基因大鼠株系,其中2株转基因大鼠的肝组织中可检测到完整的人ATP7B基因表达产物,血液生化和临床指征显示2株转基因大鼠具有明显的ATP7B相关功能恢复表型.结论人ATP7B在转基因大鼠的肝组织中获得完整和正确的表达,其弥补了转基因大鼠内源性Atp7b基因功能的缺陷.
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29例肝豆状核变性临床病理特点分析
目的 对29例肝豆状核变性(Wilson病,WD)患者的临床病理特点归纳总结.方法 回顾性分析2007年1月至2012年10月河北医科大学第三医院和北京中日友好医院29例WD患者的临床资料,分析指标包括临床表现、肝脏生化指标、血清铜蓝蛋白、24 h尿铜、ATP7B基因检测及病理学检查结果.结果 29例WD患者中,男18例,女11例,中位年龄25.9岁(5～71岁).临床表现乏力18例(62.1％),腹胀、皮肤瘙痒各4例(13.8％)；体征包括:肝大11例(37.9％),脾大15例(51.7％)和腹水4例(13.8％)等.实验室检查示29例WD患者均有肝功能异常及24 h尿铜升高(100.0％),24例铜蓝蛋白降低(82.8％),8例K-F环阳性(27.6％).19例患者接受ATP7B基因检查,基因突变位点有外显子5、8、11、12、16和18.肝组织病理学特点:早期为肝细胞脂肪变性(大小泡混合性),铜染色阳性或阴性,肝小叶内可无明显炎症；慢性肝炎期主要表现为汇管区炎细胞浸润、胆管上皮变性,汇管区周围肝细胞胆盐淤积性改变伴铜颗粒沉积,小叶内灶性炎症；肝硬化期表现为汇管区扩大纤维化,宽阔间隔内铜沉积及小胆管破坏、增生、间隔周围肝细胞胆盐淤积性改变及大量铜颗粒沉积.临床确诊6例,临床+病理诊断4例,临床+肝脏病理+基因检测诊断19例.结论 WD单靠临床诊断漏诊率高；肝脏组织学中汇管区周围肝细胞胆盐淤积性改变较常见,有提示作用；ATP7B基因检测外显子16杂合突变较常见.临床+基因检测+肝脏病理可提高早期诊断率,减少误诊和漏诊率.
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P型铜转运ATP酶在食管癌组织中的表达及与预后的关系
目的:探讨食管鳞状细胞癌组织中P型铜转运ATP酶(ATP7B)的表达与有无淋巴结转移及预后的关系.方法:采用免疫组织化学ABC法检测64例手术切除的食管鳞状细胞癌组织中ATP7B的表达情况,并结合临床资料进行分析.结果:ATP7B的免疫阳性反应主要定位于食管癌细胞的细胞膜和(或)细胞浆,癌组织中ATP7B的阳性率为63%(40/64),其中有淋巴结转移的ATP7B阳性率为73%(30/41),无淋巴结转移阳性率为43%(10/23),两者具有显著性差异(P=0.019);术后生存期＜5年组的ATP7B阳性表达率为72%(33/46),术后生存期＞5年组的ATP7B阳性表达率为39%(7/18),两者具有显著性差异(P=0.015).结论:ATP7B在食管鳞状细胞癌组织中的过度表达与食管癌的预后密切相关.
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肝豆状核变性的遗传学研究进展
肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)是一种铜转运障碍的常染色体隐性遗传病,以胆汁铜排泄及血浆铜蓝蛋白合成障碍而导致肝和肝外组织铜的过度蓄积为特征,进而出现肝硬化、豆状核变性和角膜的K-F环等一系列异常临床表现.WD是由ATP7B基因突变引起的,基因变异超过515种(至少379种可能为致病突变),广泛分布不同人种和地域,包括错义突变、无义突变、缺失突变、插入突变、置换突变和剪接突变等.其中常见的突变类型欧洲患者为14号外显子His1069Gln错义突变,亚洲患者为位于8号外显子的Arg778Leu错义突变.基因突变分析有利于准确诊断及早期治疗,遗传缺陷的动物模型有助于开展实验性治疗和研究疾病的病理遗传机制.本文就肝豆状核变性的遗传学进展作一综述.
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Wilson病ATP7B基因突变检测
目的:研究Wilson病(WD)患者基因突变的类型和发生情况,为本病的早期诊断提供理论依据.方法:提取13例WD患儿的基因组DNA,用聚合酶链反应法,对其ATP7B基因的21个外显子进行扩增,并用DNA测序方法对扩增产物进行测序分析.并选择100名健康儿童的样本作为对照,以排除发现的基因突变为多态性的可能.结果:13例WD患儿中,共发现7种错义突变,2种无义突变,其中常见的突变方式为c.2333 G＞T (p.Arg778Leu),占46.15％;其次为c.2975 C＞T (p.Pro992Leu),占15.38％.21个外显子中,8号外显子发生突变的频率高,为53.85％;其次为13号外显子,其突变频率为26.92％.结论:ATP7B基因的8、13号外显子是WD的突变热点,其中8号外显子以Arg778Leu、13号外显子以Pro992Leu为主要突变形式,基因检测可对WD患儿作出快速、准确的诊断.
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ATP7B基因反义寡核苷酸对卵巢癌SKOV3ipl细胞顺铂敏感性的影响
目的:探讨ATP7B基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODNs)片段对卵巢癌SKOV3ip1细胞顺铂敏感性的影响.方法:人工合成包含ATP7B mRNA翻译起始位点的ASODNs片段及作为对照的正义寡核苷酸(sense ol-igodeoxynucleotide,SODNs)片段.脂质体lipofectamine 2000(LF)将ASODNs及SODNs转染卵巢癌SKOV3ip1细胞后,用RT-PCR法、流式细胞测定法、Western blot及MTT法检测SKOV3ip1细胞转染后,ATP7B基因mRNA、蛋白表达及半数抑制浓度(IC50)的变化.结果:SKOV3ipl细胞以及转染ASODNs后,ATP7B与β-actin mRNA的光密度比值分别为0.831±0.06和0.203±0.07(P＜0.01).流式细胞法检测细胞内ATP7B蛋白的荧光强度由转染前的79.42±4.04下降到50.87±5.47(P＜0.05).Western blot检测SKOV3ipl细胞以及转染ASODNs后,ATP7B与actin蛋白的光密度比值分别为2.60±0.44和1.01±0.06(P＜0.01).MTT检测IC50由转染前的(126.63±12.06)μmol/L下降为(80.90±20.09)μmol/L(P＜0.01).而转染SODNs及LF的SKOV3ip1细胞中,上述指标无统计学差异(P＞0.05).结论:ATP7B基因反义寡核苷酸能显著抑制卵巢癌SKOV3ip1细胞ATP7B mRNA和蛋白表达,并能增加SKOV3ip1细胞对顺铂的敏感性.
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慢病毒介导ATP7B基因转染对骨髓间充质干细胞在高铜环境中生存能力的影响
目的:探讨慢病毒转染ATP7B基因能否提高骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)在高铜环境中的生存能力.方法:全骨髓贴壁法培养Wilson病模型LEC大鼠的MSCs;构建含有ATP7B基因的慢病毒载体pWPT-ATP7B及对照慢病毒载体pWPT-GFP并转染MSCs,获得表达ATP7B基因的MSCsATP7B细胞及对照组MSCsGFP细胞.利用细胞免疫荧光、Real-timePCR、Western blot长期监测ATP7B基因表达；并以HepG2细胞系作为阳性对照,利用SRB法监测给予不同浓度铜离子处理的干细胞增殖情况.结果:MSCs CD90、CD29表达阳性,CD45、CD1 1b表达阴性；细胞免疫荧光、Western blot及RT-PCR显示MSCsATP7B细胞的ATP7B基因能够长期稳定表达；SRB结果显示,高铜环境中MSCsATP7B细胞的生存能力显著高于MSCsGFP细胞及HepG2(P＜ 0.05).结论:ATP7B基因修正的LEC大鼠MSCs可有效对抗铜蓄积损害,为Wilson病的治疗提供可能的新方法.
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ATP7B、Kiss-1、Skp2在CIN及子宫颈癌中的表达和意义
目的 探讨ATP7B、Kiss-1及Skp2在子宫颈不同程度病变组织中的表达情况.方法 选取196例子宫颈组织标本,用组织芯片技术和免疫组化方法(SP法)检测正常宫颈组织、各级CIN及宫颈鳞癌中ATP7B、Kiss-1及Skp2的表达.所得数据用SPSS17.0软件进行分析.结果 从正常宫颈到CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈鳞癌:ATP7B的表达逐渐增高(P<0.05),Kiss-1的表达逐渐降低(P<0.05),Skp2的表达逐渐增高(P<0.05).宫颈鳞癌中ATP7B、Kiss-1、Skp2三者的表达之间P>0.05.Skp2的表达与淋巴结转移、临床分期、分化程度、肿瘤大小、患者年龄之间P>0.05.ATP7B的表达与分化程度、年龄、肿瘤大小之间P>0.05,与淋巴结转移、临床分期之间P<0.05.Kiss-1的表达与年龄、肿瘤大小、分化程度之间P>0.05,与临床分期、淋巴结转移情况之间P<0.05.结论 ATP7B的增高、Kiss-1的降低、Skp2的增高都促进宫颈鳞癌的发生、发展.不支持ATP7B、Kiss-1及Skp2在宫颈鳞癌发生、发展中起协同作用.Kiss-1的降低和ATP7B的增高促进宫颈鳞癌的浸润和转移.
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肝豆状核变性ATP7B基因启动子区域的分子特征
目的 了解中国人肝豆状核变性(WD)ATP7B基因5'UTR及启动因子区域分子特征,探讨不同人种该区域基因多态与突变的分布.方法 采用聚合酶链反应-单链构象特异性(PCR-SSCP)和DNA序列分析技术,对110例WD患者和90例健康对照儿童进行ATP7B基因5'UTR及启动因子区域分子特征研究.结果 1.共发现5种基因改变:-1294T→G、-105C→G、-116C→T、-132delGCCGC和-75A→C,前三者未见报道,-132delGCCGC未见国内报道.2.-132delGCCGC和-75A→C位点等位基因均占70%以上,发生频率较高,且98%的患者呈完全连锁状态,二者相关性为96.9%.3. 国内外ATP7B基因启动子和5'UTR区域至今仅发现约20种多态,包括本课题发现的5种类型.中国人ATP7B基因启动子的多态主要分布于EXON 1侧翼序列,其多态的分布和种族密切相关.结论 发现ATP7B基因多态5种,其中-1294T→G、-105C→G、-116C→T为首次报道;-132delGCCGC和-75A→C 几乎呈连锁存在.中国人WD患者的ATP7B基因启动子和5'UTR结构改变大部分分布在EXON 1侧翼序列.中国人启动子部分不存在突变热点.
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河南贲门癌高发区贲门癌组织ATP7B的表达
目的:了解贲门癌组织中ATP7B的表达情况.方法:采用免疫组化ABC法检测49例河南贲门癌高发区贲门癌及其相应癌旁正常组织中ATP7B的表达.结果:ATP7B在贲门癌组织中阳性表达率为51%(25/49),高于癌旁正常组织中的29%(14/49),差异有统计学意义(x2=5.15,P＜0.05).贲门癌组织ATP7B表达与肿瘤体积、淋巴结转移和远处转移无关,而与肿瘤分化程度有关.结论:ATP7B在贲门癌对铂类抗肿瘤药的先天耐药形成过程中发挥了重要作用,ATP7B可作为贲门癌的预后判断指标.
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肝豆状核变性的分子生物学研究进展
本文旨在对肝豆状核变性分子机制研究进展进行综述.肝豆状核变性是一种以多器官铜沉积为特征的常染色体隐性遗传疾病,未经及时治疗的患者可能出现严重的功能损害甚至死亡.目前对其致病基因表达产物ATP7B的亚细胞定位、空间结构及其各结构域的功能特点已有不少研究.研究者们探讨ATP7B各位点的突变,尤其是欧洲人群和亚洲人群各自的突变热点H1069Q和R778L,与某种特定疾病表型联系起来,但是仍未发现二者之问肯定的相关性.此外,近年来肝豆状核变性基因诊断日益普及,检测技术也不断进步,这些分子生物学水平的进展为未来肝豆状核变性的生理学研究、诊断及治疗提供了新的方向.
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野生型和突变型肝豆状核变性蛋白对皮肤成纤维细胞内过多铜的转运作用
目的:将野生型和突变型(R778L)肝豆状核变性基因(ATP7B)转染入Me32aT22/2L细胞株中进行表达,观察野生型和突变型ATP7B的铜转运功能,为以后更深入的基因治疗奠定基础.方法:采用脂质体转染法分别将含野生犁和突变型cDNA重组真核表达载体pRc/CMV-WD转染到Me32aT22/2L细胞株中.免疫荧光观察野生型和突变型ATP7B在细胞内的分布,以及铜孵育实验检查野生型和突变型ATP7B的铜转运功能.结果:在转染的Me32aT22/2L细胞株中可检测到AqqrTB的表达.ATP7B位于细胞核的周围,在24和48小时后,细胞内铜/蛋白比值分别为335.33±49.86和477.38±30.95.而突变型ATP7B组铜/蛋白比值分别为606.14±45.72和901.84±53.18,两者比较具有统计学差异(P＜0.05).结论:野生型ATP7B具有铜转运功能,而突变型ATP7B则丧失了铜转运的功能.突变R778L基因是肝豆状核变性的致病基因.
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荧光定量PCR检测Kbpala/Alb-ATP7B短暂转染BRL细胞后的转录情况
[目的]明确Kbpala/Alb-ATP7B短暂转染BRL细胞后的表达情况.[方法]将Kbpala/Alb-ATP7B用阳离子脂质体Lipofect AMINETM 2000 Reagent转染BRL细胞后,按转染后不同时间点提取细胞mRNA,逆转录后,使用SYBR Green荧光定量PCR检测其表达情况.[结果]转染后4 h即可检测到外源基因的表达,48 h外源基因的表达高,可持续7 d以上.[结论]Kbpala/Alb-ATP7B可在BRL细胞中有效表达,表明载体构建成功.
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肝豆状核变性移植治疗进展
肝豆状核变性又称Wilson病(WD),是一种遗传性铜代谢障碍性疾病,铜代谢异常导致铜沉积于肝、神经等组织引起损伤,其致病基因ATP7B主要在肝脏表达,药物治疗往往具有治标不治本的局限性,移植治疗可以提供正常肝组织,能够不同程度地改善患者的铜代谢障碍.目前移植治疗正在迅速发展,本文将对此进行介绍.
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肝豆状核变性一核心家系ATP7B基因突变分析
目的 检测肝豆状核变性(WD)病人ATP 7B基因突变情况,探讨在WD发病中该基因复合突变的意义.方法 采用第二代DNA测序技术检测1例WD病儿及其生物学父母的ATP7B基因突变,通过PCR技术和Sanger测序技术进行突变位点的验证,以同样方法检测100例健康查体者的相同位点作对照.结果 经第二代DNA测序技术检测,WD病儿ATP 7B基因发现复合突变c.2333G＞T/c.3955C＞T,而其生物学父母分别检测到c.3955C＞T和c.2333G＞T;100例健康查体者均未检测到此突变.上述突变均经Sanger测序技术证实.结论 该WD病儿检测到ATP7B基因致病杂合突变,两个杂合突变均可能引起蛋白质结构和功能改变,其共同作用导致WD发病.
