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干扰Wrap53基因调控人骨肉瘤U2OS细胞放射敏感性实验研究
目的:探讨干扰Wrap53基因表达对肿瘤细胞放射敏感性的作用及其分子机制.方法:构建针对Wrap53的干扰质粒;脂质体转染法转染至p53野生型(wtp53)的人骨肉瘤U2OS细胞;RT-PCR和蛋白质印迹法检测Wrap53和wtp53基因的mRNA和蛋白表达;克隆形成实验测定放射敏感性参数;流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞周期变化.结果:Wrap53的特异性shRNA质粒转染U2OS细胞后,细胞内Wrap53和wtp53的mRNA和蛋白表达水平均受到明显抑制;Wrap53基因干扰组U2OS细胞的D0值为0.44±0.01,明显高于阴性对照组0.37±0.01,P=0.001,Wrap53基因干扰组SF2值为0.72±0.10,高于阴性对照组0.44±0.02,P=0.047;Wrap53干扰细胞在放射后16 h(P=0.014)和24 h(P=0.011)的G2/M期阻滞更加明显,显著高于对照组;但Wrap53干扰细胞在放射后出现G1期阻滞减少,以放射后24 h为显著,P=0.001.结论:干扰Wrap53基因表达降低了U2OS细胞的放射线敏感性,该作用可能与下调wtp53表达和诱导细胞放射后G2/M期阻滞有关.
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人E1A激活基因阻遏子基因启动子生物信息学分析及转录调控功能初探
目的 对人类腺病毒5型早期区域1A(adenovirus type 5 early region 1A,E1A)激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes,hCREG)启动子进行生物信息学分析、预测hCREG启动子位置和转录因子结合位点.方法 对2005年1月至7月沈阳军区总医院全军心血管病研究所进行的从Genbank中获得hCREG的全长编码基因,利用First EF程序分析软件分析并获得hCREG的启动子序列,利用Motif软件对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测.免疫荧光染色和Western blot分别观察相关转录因子的蛋白表达与细胞内hCREG蛋白及细胞表型转化之间的关系.结果 用First EF软件测定长度为945 bp的hcREG启动子序列,hCREG的启动子区可能定位于转录起始点上游-109～-359 bp.用Motif软件预测启动子区域共含有80多个转录调控因子结合位点,其中肿瘤抑制基因wtp53结合位点为-456 bp.进一步应用蛋白质印迹(western blot)和免疫荧光染色分析wtpS3与细胞表型转化的关系.在0.5%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培养的HITASY细胞wtp53表达较10% FBS培养HITASY细胞明显增加.同时,hCREG蛋白和平滑肌细胞分化标志蛋白SM α-actin亦表达增多.结论 获得了hCREG启动子的转录调控信息,推测出wtp53是hCREG基因转录的重要调控因子,它可能结合于hCREG启动子区,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控.
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野生型p53对小鼠纤维肉瘤细胞线粒体功能的影响
目的 观察野生型p53(Wtp53)基因对纤维肉瘤细胞线粒体结构和功能的影响,探讨Wtp53的抑癌机制.方法 将5周龄昆明鼠随机分为单纯肿瘤组(对照组)和Wtp53基因治疗组(治疗组),建立纤维肉瘤动物模型,5d后治疗组动物于荷瘤局部注射表达Wtp53基因的重组腺病毒液0.1mL,对照组同一部位注射等剂量生理盐水.两组动物于2次注射后10d、20d、30d分批处死,量取肿瘤直径大小,Estabrook法分离提取线粒体,Clark氧电极法进行线粒体呼吸功能的测定,Reer法测定游离Ca2+浓度.结果 对照组肿瘤的凋亡指数明显低于治疗组.对照组中R3显著高于治疗组;10天时两组R4接近,但20天和30天时治疗组R4时相大大延长,与对照组比较差异非常显著;对照组RCR随着时间的延长无明显变化,治疗组中,RCR随时间延长而下降明显低于对照组;游离Ca2+浓度在10天时与对照组接近,而后大幅度上升.结论 Wtp53明显降低线粒体呼吸功能,增加线粒体的通透性,从而在促进细胞凋亡方面发挥对纤维肉瘤的治疗作用.
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正反p33ING1b对人类胰腺癌细胞SW1990生长的影响
目的:探讨p33ING1b和wtp53体外对胰腺癌细胞生物学活性的影响.方法:脂质体法将正义和反义p33ING1b以及wtp53单转染和共转染胰腺癌细胞SW1990;Western印迹法检测p33ING1b和wtp53蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞周期改变情况;特殊染色观察细胞凋亡情况.结果:转染p33ING1b组和共转染p33ING1b和wtp53组,两者蛋白水平明显较反义组和空转组高(P<0.05);共转组SW1990细胞生长周期较其他各组缩短;转染p33ING1b组和共转染p33ING1b和wtp53组,两者凋亡细胞数目较反义组和空转组多.结论:p33ING1b对细胞可能存在正性调控作用,这种作用可能主要通过p53来发挥作用的.
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补肾泻肝方对辐射诱导小鼠骨髓有核细胞凋亡及基因表达影响
目的探索补肾泻肝方("BuShenXieGanFang",简作补泻方,"BXF")减少辐射所致小鼠骨髓有核细胞(BMNCs)凋亡的作用机制.方法用TdT介导的脱氧核苷酸切口和末端标记法(Tunel)检测补泻方对辐射诱导的小鼠BMNCs凋亡的影响;应用RT-PCR方法检测补泻方对辐射诱导的小鼠BMNCs IL-1和wtp53基因表达水平的调控作用.结果补泻方能明显减少4Gy照射后2～24 h的BMNCs凋亡.在2～10 Gy剂量照射后6 h,补泻方能减少BMNCs凋亡,尤以2、4、8、10 Gy为显著.辐射诱导IL-1和wtp53基因表达,基因表达随辐射剂量增加而增加.用药组骨髓细胞经2、4、6和8 Gy照射后IL-1基因表达显著高于对照组(P<0.05);用药组骨髓细胞经2、4、6和8 Gy照射后wtp53基因表达显著低于对照组(P<0.05).显示补泻方能增加辐射所诱导的内源性辐射防护剂IL-1基因的表达;降低辐射所诱导的与造血细胞凋亡有关的凋亡基因wtp53的表达.结论补泻方显著改善辐射所致骨髓细胞凋亡的机制与调控辐射所诱导的与造血细胞凋亡有关的IL-1和wtp53基因的表达有关.
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WTp53基因联合TK/GCV、CD/5-Fc系统治疗人结肠癌的实验研究
目的:观察WTp53基因联合TK/GCV、CD/5-Fc系统对人结肠癌的治疗效果,并探讨其作用机理.方法:采用培养细胞移植法,将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型,将32只裸鼠随机分为4组:对照组、WTp53组、TK、CD组、WTp53与TK、CD组,每组8只,WTp53采用脂质体介导,TK、CD采用逆转录病毒介导.将WTp53、TK、CD注入移植瘤体内,瘤内注射TK、CD的裸鼠同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗,观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标,比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响.结果:各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制,裸鼠存活期显著延长,联合基因治疗组效果更好,WTp53与TK、CD有交互协同作用.结论:WTp53、TK/GCV、CD/5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用,WTp53基因联合TK/GCV、CD/5-Fc系统效果更强.
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EPO对视网膜缺血再灌注损伤中WTp53、CyclinD1含量变化的影响
目的 研究促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)与视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemical reperfusion injury,RIRI)视网膜组织中野生型p53(wild type p53,WTp53)、CyclinDl的关系,为EPO治疗RIRI提供理论依据.方法 前房穿刺加压法制作大鼠RIRI模型,28只大鼠随机分为正常组和手术组,其中手术组大鼠左眼为RIRI组,右眼为治疗组(于再灌注开始即刻玻璃体腔内注射EPO 20 IU),手术组又按照再灌注后不同时间段分为1h、6h、12h、24h、48h、72h组.SABC免疫组织化学法检测视网膜组织中WTp53、CyclinD1的表达.结果 RIRI组视网膜在再灌注6h后可发现有WTp3、CyclinD1的表达,24h达到高峰,48h仍持续强表达,72h表达已明显下降.玻璃体腔内注射EPO后上述因子表达趋势不变,但各时间点治疗组较RIRI组表达强度明显减少(P＜0.01).结论 玻璃体腔内注射EPO可以抑制WTp53、CyclinD1表达,这可能是EPO治疗RIRI的机制之一.
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促红细胞生成素对糖尿病大鼠视网膜bcl-2、bax和WTp53表达的影响
目的 研究bel-2,bax和WTp53蛋白在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达及促红细胞生成素(EPO)对其表达的影响.方法 48只Wistar大鼠用链脲佐菌素诱导糖尿病(DM),随机分为糖尿病未治疗组和EPO治疗组,分别于1、3、6个月处死大鼠,8只正常Wistar大鼠作为对照组.TUNEL法检测细胞凋亡情况,免疫组织化学法检测大鼠视网膜组织中bcl-2、bax和WTp53蛋白的表达及EPO对其表达的影响.结果 DM3和DM6组大鼠视网膜凋亡细胞较正常组和DM1组大鼠增多;与正常组和DMI组大鼠比较,DM3组和DM6组视网膜bcl-2蛋白阳性细胞数减低,bax及wTp53蛋白表达阳性细胞数较多.EP03、EP06组与DM3组和DM6组比较,bcl-2阳性细胞数增多,bax和WTp53蛋白表达明显下降(P<0.05).结论 EPO能减少DM大鼠视网膜神经细胞的凋亡,其机制可能与上调bel-2及下调bax以及wTp53蛋白的表达有关.
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视网膜缺血再灌注损伤中WTp53蛋白、CyclinD1表达的研究及bFGF对其的影响
目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF )在大鼠视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)中的治疗作用及机制.方法将28只Wistar大鼠随机分为正常组、缺血组和bFGF治疗组,其中后两组又按再灌注时间不同分为再灌注后1、6、12、24、48和72 h 6个时间段.通过前房穿刺加压法制作成RIRI动物模型,并在以bFGF(治疗组)或平衡盐溶液(缺血组)玻璃体腔注射后按不同时段处死动物,通过免疫组织化学链酶卵白素-生物素复合体(SABC)法检测各时段视网膜组织中野生型p53蛋白(WTp53)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表达变化.结果缺血组视网膜在再灌注后6 h可发现有WTp53蛋白及CyclinD1的表达,24 h达到高峰,48 h仍持续强表达,72 h表达已明显下降;bFGF治疗组各观察指标变化规律基本与缺血组相似,但表达量相对明显减弱,两组比较,在再灌注6～48 h时段差别P值均＜0.05,具有统计学意义.结论bFGF可抑制RIRI时WTp53蛋白和CyclinD1在视网膜表达的增高.
关键词： 视网膜 缺血再灌注损伤 碱性成纤维细胞生长因子 wtp53 细胞周期蛋白D1 -
槲皮素和8-Br-cAMP对Eca-109细胞抑癌基因表达的影响
目的:探讨槲皮素和8-Br-cAMP对Eca-109细胞抑癌基因表达的影响.方法:将培养的Eca-109细胞随机分成3组:①Br组,加8-Br-cAMP至终浓度为2×10-5 mol/L;②Q组,加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;③C组,不加任何药物,只加入新培养液培养.3组细胞同时培养48 h后,分别提取mRNA.将野生型(wt)p53、p16和p21WAF1 cDNA分别制备成生物素标记的探针,以mRNA斑点印迹阵列显示Eca-109细胞wtp53、p16和p21WAF1基因的表达.将3组细胞分别滴片,同时进行分化染色,记数分化和增殖细胞比率.结果:与C组相比,Br组和Q 组wtp53、p16和p21WAF1mRNA信号增强,P<0.01;Br组和Q 组分化细胞比率显著提高,P<0.01.结论:槲皮素和8-Br-cAMP皆可通过上调wtp53、p16和p21WAF1基因的表达,抑制Eca-109细胞增殖,诱导Eca-109细胞分化.
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8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞相关基因的DNA拷贝和基因表达的影响
目的:探讨8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞wtp53、c-myc、bcl-2基因的扩增、表达以及VEGF表达的影响.方法:将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组:加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组:加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组:不加任何药物,只加入新培养液培养.3组细胞同时培养48h.以cDNA 阵列技术显示Eca-109细胞凋亡中wtp53、c-myc、bcl-2 DNA拷贝和mRNA的表达,以免疫组化法显示VEGF的表达.结果:Br组和Q组与C组相比wtp53 DNA拷贝和mRNA信号较强,c-myc、bcl-2 DNA拷贝和mRNA信号较弱,VEGF表达较弱.结论:8-Br-cAMP和槲皮素皆可通过上调wtp53,下调bcl-2、c-myc基因的扩增和表达,下调VEGF的表达,而诱导Eca-109细胞凋亡.
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8-Br-cAMP与顺铂对Eca-109细胞DNA polβ,wtp53基因表达及多药耐受蛋白的影响
目的:比较分化诱导剂8-Br-cAMP与基因毒性药物顺铂对Eca-109细胞DNA polβ及wtp53基因表达和多药耐受蛋白的影响.方法:分别制备生物素和地高辛标记的polβ探针和生物素标记的野生型p53(wtp53) 探针,并检测各探针灵敏度.将培养的人食管癌Eca-109细胞分组如下:①8-Br-cAMP组(Br组);②不加8-Br-cAMP的对照组(C1组),①②组同时培养48 h; ③顺铂组(Pt组);④不加Pt的对照组(C2组),③④组同时培养24 h.应用原位杂交技术显示各组细胞polβ基因的表达.对①②及③组细胞进行polβ及wtp53双信号原位杂交,并应用多药耐受蛋白(MRP)的免疫组化方法检测耐药性.结果:生物素标记的polβ探针的杂交信号呈兰紫色细颗粒,分布于胞质; Br组信号弱于C1组, P<0.05.Pt组的信号比C2组强,P<0.05.Br组的MRP-IR弱于C1组,P<0.05; Pt组的多药耐受蛋白免疫反应性(MRP-IR)强于C2组,P<0.05.地高辛标记的polβ探针的杂交信号呈橙色细颗粒,生物素标记的wtp53探针的杂交信号呈蓝紫色细颗粒,均分布于胞质.在双杂交信号细胞内C1组的橙色强于蓝紫色信号;而Br组的蓝紫色信号较明显,Pt组的橙色信号较C1组更显著,3组相比P皆<0.05.结论:8-Br-cAMP可下调polβ基因表达及耐药性,上调wtp53基因表达,提示Eca-109细胞polβ基因是高表达的,8-Br-cAMP具有使细胞趋向正常分化效应;相反,顺铂上调polβ基因表达及耐药性,下调wtp53基因表达,提示Pt可能导致增变基因表型增加,分化诱导剂比基因毒性药物治疗肿瘤可能具有较好的疗效.
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苦参素注射液与顺铂联合对人肝癌细胞SMMC-7721端粒酶活性及wtp53、hTERT mRNA表达的影响
目的:探讨苦参素注射液与顺铂(DDP)联合对人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性及wtp53、hTERT mRNA表达的影响.方法:采用MTF法测定细胞的增殖抑制率,应用金氏公式分析药物间的相互作用,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,半定量RT-PCR法检测wtp53和hTERT mRNA表达.结果:苦参素注射液、DDP单独应用均能抑制SMMC-7721细胞增殖,两药联合具有单纯相加或协同作用,与DDP单药组相比,联合用药组的细胞抑制率明显增加(P＜0.01),端粒酶活性显著下降(P＜0.01),wtp53 mRNA表达明显升高(P＜0.01),hTERT mRNA表达明显减少(P＜0.01).结论:苦参素注射液和DDP联合应用具有单纯相加或协同抗肝癌SMMC-7721细胞增殖的作用,其机制可能通过上调wtp53和下调hTERT基因表达,从而有效抑制端粒酶活性.
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苦参素注射液联合顺铂对人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性及wtp53、hTERT mRNA表达的影响
目的:观察苦参素注射液联合顺铂(DDP)对人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性、野生型p53(wtp53)、端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达的影响.方法:将Dulbecco改良Eagle培养基培养的人肝癌SMMC-7721细胞分为苦参素组、DDP组、联合组和对照组.苦参素组低、中、高质量浓度分别为0.75、1.5、3.0 mg/ml,DDP组低、中、高质量浓度分别为1、2、4mg/ml,联合组浓度按两药联合用药1∶1的比例应用,对照组加入200 μl磷酸缓冲盐溶液(PBS),不给予药物干预.观察4组人肝癌SMMC-7721细胞凋亡率及药物间的相互作用,端粒酶活性吸光度差值(△A),wtp53和hTERTmRNA相对表达量.结果:联合组人肝癌SMMC-7721细胞凋亡率＞苦参素组＞DDP组＞对照组,4组比较差异有统计学意义(P＜0.01),q值提示苦参素与DDP存在单纯相加或协同作用.苦参素组、DDP组及联合组SMMC-7721细胞端粒酶活性△A、hTERTmRNA均显著低于对照组,且联合组＜DDP组＜苦参素组,苦参素组、DDP组及联合组wtp53显著高于对照组,且联合组＞DDP组＞苦参素组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:苦参素注射液联合DDP可增加人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡,其机制可能与wtp53表达上调、hTERTmRNA表达下调,从而影响端粒酶活性有关.
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瓦斯爆炸对大鼠心肌损伤过程中HIF-1α的动态变化
目的探索瓦斯爆炸伤致伤心肌缺氧后HIF-1α mRNA及其蛋白表达的动态变化规律及其在瓦斯爆炸伤心肌继发性损害发病机制中的作用.方法建立瓦斯爆炸伤动物实验模型,并分析爆炸后30 min、2、4、8、12、24、48 h时段心肌组织大体、光镜及超微结构特点;用地高辛标记HIF-1α cDNA探针进行心肌组织原位杂交;用RT-PCR方法对心肌组织HIF-1α mRNA进行半定量检测,用S-P法进行心肌组织HIF-1α及wtP53免疫组化染色.结果存活动物全身表皮可见不同程度烧伤,以四肢为重,实质脏器未见明显破裂,心内膜下可见附壁血栓.电镜下见:①心肌细胞水肿,线粒体肿胀、空化,内质网扩张;②部分肌丝排列紊乱,肌丝有局灶性溶解,闰盘分离;③核形不规则,异染色质边集,可见核溶解;④毛细血管周围间隙增宽,内皮细胞肿胀、变性,管腔狭窄.此病变在4 h内明显,随时间延长,病变程度减轻.HIF-1α mRNA及其蛋白表达明显增加,且2 h达高峰值,明显高于30min及48 h组,对照组无表达(P＜0.01).wtP53表达明显增加,2 h为高峰值.结论HIF-1α存瓦斯爆炸伤致心肌缺氧的继发性损害发病机制中起重要作用,且与损伤程度密切相关,wtP53可降低HIF-1α的活性,减少HIF-1α的过量表达,增加wtP53的活性及量可减轻瓦斯爆炸所致的心肌损伤,对心肌起保护作用.
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D-氨基葡萄糖衍生物对人食管癌Eca-109细胞Bcl-2及WTp53蛋白表达的影响
目的:探讨D-氨基葡萄糖衍生物2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(COPADG)对人食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法:体外培养Eca-109细胞,COPADG作用Eca-109细胞不同时间;倒置显微镜下观察细胞形态学变化;MTT法检测不同时间点细胞增殖抑制率;流式细胞术检测COPADG作用后Eca-109细胞内Bcl-2及WTp53蛋白表达的变化;Annexin V/PI染色结合流式细胞术检测COPADG作用后Eca-109细胞凋亡率.结果:COPADG作用显著增加Eca-109细胞增殖抑制率及凋亡率;COPADG作用使Eca-109细胞内Bcl-2蛋白表达明显下调而WTp53蛋白表达无变化.结论:COPADG显著抑制Eca-109细胞增殖并诱导细胞凋亡发生,细胞内Bcl-2蛋白表达下调,并可能通过该机制诱导细胞凋亡的发生.
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野生型p53/junB融合基因真核表达载体的构建
目的 通过构建抑癌基因野生型p53(wtp53)与核转录因子junB的融合基因真核表达载体,为进一步研究联合基因疗法在肝癌中的应用奠定一定的基础.方法 运用PCR(polymerase chain reaction)、RT-PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)、基因重组技术构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein, EGFP)报告基因的wtp53/junB融合基因真核表达载体pEGFP-C1-wtp53/junB.通过观察绿色荧光定位的方法验证wtp53/junB融合基因的真核表达载体转染人肝癌细胞株HepG2的情况.结果 成功地将p53/junB融合基因克隆到pEGFP-C1质粒中,其序列与设计的完全一致;转染人肝癌细胞株HepG2后可观察到绿色荧光定位于细胞核中,证明wtp53/junB融合基因成功转染入肝癌细胞株中.结论 成功构建了携带EGFP的pEGFP-C1-wtp53/junB融合基因真核表达载体,并转染入人肝癌细胞核中,为进一步研究两者在肝癌中的协同作用奠定了基础.
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视网膜缺血再灌注损伤后凋亡相关基因表达的变化
目的 研究视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)中凋亡相关基因野生型p53(WTp53)、bax和bcl-2表达的变化,探讨其作用机制.方法 将28只Wistar大鼠随机分为正常组、缺血组,其中缺血组又分为再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6个组.建立RIRI动物模型,用免疫组织化学链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测再灌注后不同时段视网膜组织中WTp53、bax和bcl-2基因表达的变化.结果 缺血组视网膜再灌注后WTp53、Bax蛋白表达增加,与正常组比较,再灌注6～72 h差异有显著意义(F=487.19、281.97,q=11.526～52.401,P＜0.05).缺血组视网膜再灌注后Bcl-2蛋白表达无明显变化,与正常组比较,差异无显著性(P＞0.05).结论 缺血再灌注损伤引起WTp53、bax基因在视网膜神经节细胞层、神经纤维层与内核层表达增高;WTp53和bax可能通过诱导或促进神经节细胞凋亡参与了视网膜缺血再灌注损伤的发生.
