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利用细菌内重组腺病毒系统构建胃癌MG7-Ag模拟表位疫苗
目的:以复制缺陷的腺病毒为疫苗载体,构建基于胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒疫苗.方法:将编码MG7-Ag模拟表位的互补序列设计到上游引物的5/端.以含有HBcAg全序列的质粒p1.2Ⅱ为模板,通过PCR扩增,获得MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因.经序列测定证实后,亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5 183中进行同源重组.经抗性筛选及酶切鉴定的重组质粒,再用导入293细胞进行包装,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达.结果:序列测定证实,PCR产物为胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片段;酶切鉴定表明胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片断插入了pAdTrack-CMV穿梭质粒,卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3 d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论:胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒载体的构建成功,为进一步研究胃癌MG7-Ag模拟表位诱发抗胃癌免疫打下了基础.
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基于CDDP标记铁皮石斛抗性种质筛选与多样性研究
目的 利用CDDP标记技术对43份铁皮石斛Dendrobium officinale野生和栽培种质进行初步抗性筛选和遗传多样性分析,为铁皮石斛产业以及优良品种筛选保护提供理论基础.方法 从21条CDDP引物中筛选出产物清晰、多态性好的引物对供试材料基因组DNA进行扩增.结果 16条引物共扩增出了151条带,其中多态性条带144条,多态性比率95.7％,表明供试材料具有丰富的遗传多样性.种群遗传多样性结果表明,3个种群多态性位点比例(PPL)为65.56％～82.12％,种群间基因分化系数(Gst)为0.110 2,基因流(Nm)为4.035 4,说明人为选择亦可能促进铁皮石斛的遗传多样性.结论 铁皮石斛人工栽培种具有丰富的遗传多样性,同时统计结果分析表明,43份材料中可以初步筛选出8份具有潜在优良抗性的植株.
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多因素复合诱变选育克拉维酸高产菌株
采用多因素连续复合诱变的方法,对克拉维酸产生菌带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)进行系列诱变,以抗生素抗性作为理性筛选标记,从含青霉素35 μg/ml的琼脂平板上筛选到青霉素抗性突变株YT-201-57#,在摇瓶实验中,对青霉素的抗性由8μg/ml提高到45 μg/ml,克拉维酸产景较出发菌株提高10.3%,且高产遗传特性经5次传代仍稳定.
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紫杉醇产生菌美丽镰刀霉K1781的诱变育种
采用紫外线与亚硝酸对美丽镰刀霉(Fusarium mairei)K178的孢子进行复合诱变,于含40μg/ml制霉菌素的平板上进行筛选,获得31株突变株,其中5株的紫杉醇摇瓶发酵产量高于出发菌株,突变株UH23的紫杉醇产量为259.8μg/L,进一步优化其发酵工艺条件,紫杉醇产量达286.4pg/L,较出发菌株提高了29.9%.
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麦考酚酸高产菌株的选育
以短密青霉MA-4为出发菌株,应用紫外和亚硝基胍诱变,结合麦考酚酸与三氟乙酸抗性筛选,获得高产、稳定的突变株MA-H8.经过发酵培养基优化,突变株发酵水平为4500μg/ml.
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N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶生产菌的选育
以产N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的恶臭假单胞菌MZ0315为出发菌株,应用紫外和硫酸二乙酯的复合诱变,经底物类似物5-氟尿嘧啶的筛选,获得高产、稳定的优良菌株MF0506.经过发酵培养基优化,诱变株的产酶活力由出发菌株的0.443u/ml提高至0.680u/ml.
关键词： N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶 诱变 抗性筛选 -
复合诱变和抗性筛选高产谷胱甘肽酵母菌株
对75株酵母菌经初筛、复筛和单倍体分离,得到胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量较高的单倍体酵母菌株S1(a),并进行遗传标记.经硫酸二乙酯诱变、紫外诱变及两者的复合诱变,ZnCl2、乙硫氨酸抗性交替筛选得GSH含量较高的单倍体F4(a,Arg-,ZnCl2r,Ethr),GSH含量与产量分别比出发单倍体提高了73.5%和118.1%.
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利用抗CTP合成酶反馈抑制筛选胞苷高产突变株
目的:通过解除对CTP合成酶的反馈抑制,得到胞苷高产突变株.方法:以胞苷脱氨酶缺失的枯草芽孢杆菌为出发菌株进行亚硝基胍(NTG)诱变,用6-氮杂尿嘧啶(6-AU)、5-氟胞苷(5-FCR)和3-脱杂氮尿嘧啶(3-DU)3种嘧啶结构类似物进行抗性筛选.结果:筛选得到突变株K-215,研究表明其抗6-AU、5-FCR和3-DU的浓度分别是0.9 mg/mL,3.5 mg/mL和4.5 mg/mL;突变株CTP合成酶的活性为出发菌株的6.2倍,37℃培养80 h积累胞苷可达6.2 mg/mL.结论:突变株K-215能够累积胞苷且CTP合成酶的反馈抑制得到部分解除.
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多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化
目的 利用诱变结合抗性筛选方法选育多杀菌素高产菌株,并通过发酵培养基优化进一步提高多杀菌素产量.方法 分别确定链霉素、安普霉素和鼠李糖3种抗性的小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),然后以S.s1-4为出发菌株,通过紫外(UV)结合链霉素、安普霉素、鼠李糖抗性因子诱变选育,在此基础上利用亚硝基胍(NTG)结合上述抗性因子诱变选育,并利用响应面实验设计对发酵培养基中葡萄糖、糊精、棉籽蛋白3种成分进行优化.结果 出发菌株经过紫外照射30s,涂布于抗性平板上,筛选得到S.s2-21,S.s2-21再用NTG处理30min,涂布于抗性平板上,终获得1株遗传性状稳定的菌株S.s3-37,产量为78.26mg/L,提高了45.71％;发酵培养基优化后,其产量达83.00mg/L.结论 利用紫外和NTG结合抗性复合诱变选育获得多杀菌素高产菌株是有效的,通过发酵培养基优化,其产量较出发菌株提高了54.55％,获得良好的效果.
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Pneumocandin B0高产菌株选育
目的 筛选获得pneumocandin B0高产菌株.方法 以pneumocandin B0产生菌PB22-79作为出发菌株,采用微波诱变方法处理,然后利用He-Ne激光复合制霉菌素抗性筛选菌种,以菌种发酵液效价作为筛选指标.结果 获得一株高产突变株FH-24-135,其摇瓶生产能力比出发菌株提高了56.3％.且遗传特性稳定.研究确定了微波辐射的佳时间为80s,而He-Ne激光复合制霉菌素抗性筛选的佳剂量为90min和25μg/mL(MIC).结论 微波诱变结合He-Ne激光复合制霉菌素抗性筛选方法是筛选pneumocandin B0产生菌的有效方法,有利于提高菌株的发酵水平,为工业化生产奠定基础.
关键词： Pneumocandin B0 复合诱变 He-Ne激光 抗性筛选 -
格尔德霉素高产菌株的抗性筛选及其发酵的研究
目的 用实验室保藏的格尔德霉素产生菌Streptomyces melanosporofaciens101,通过抗性选育,获得高产突变株.并研究该菌株的工业化发酵工艺.方法 经硫酸二乙酯诱变和添加代谢终产物(格尔德霉素)抗性筛选,格尔德霉素抗性浓度从5g/L提高到10g/L,筛选高产突变菌株.再进行发酵罐上工艺优化,分别进行了单批发酵和分批补料发酵研究.结果 获得的高产突变株其生产能力比出发菌株提高了1000倍.在96、120、144和168h分别补加总体积3％的葡萄糖,该分批补料发酵工艺适合格尔德霉素工业化生产.结论 格尔德霉素高产突变株的筛选和发酵工艺的确定为该项目产业化奠定了基础.
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达托霉素生产菌(ATCC31568)的紫外诱变和抗生素抗性筛选
目的 建立一种提高达托霉素生产水平的方法.方法 以玫瑰孢链霉菌(ATCC31568)为出发菌株,利用紫外诱变结合抗生素抗性筛选以提升达托霉素生产水平.结果 通过对致死率和正突变率的考察,确定紫外诱变时间为45s,利福平和庆大霉素的合适筛选浓度分别为1.4μg/mL、1.0μg/mL,得到的突变株经摇瓶发酵后,采用高效液相色谱仪(HPLC)对终发酵液进行检测.筛选到的突变株Ge-27高产量达到79.44 mg/L,比原始菌株提高了42.2％.结论 采用紫外诱变结合抗生素抗性筛选得到了达托霉素合成水平提高的菌株.
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红霉素高产菌株的筛选
以红霉素生产菌株HD07-30为出发菌株.采用紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)进行双重复合诱变选育筛选耐红霉素的高产菌株,获得红霉素抗性突变菌株,生物效价比出发菌株提高27%.
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用庆大霉素抗性筛选法选育西罗莫司高产菌株
用紫外线对吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)NP03进行诱变,再采用庆大霉素抗性筛选法进行处理,剂量分别为0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml,共获得113株抗性突变株,其中西罗莫司产量高于出发菌株的有51株,突变株NP03-74#的生产能力达到出发菌株的134%,且遗传特性稳定.
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紫外诱变复合重金属离子抗性突变选育霉酚酸高产菌株
以霉酚酸产生菌1321#为出发菌株,采用紫外线诱变并复合重金属Cr6+、Cu2+抗性株筛选,获得一株遗传性状稳定且摇瓶发酵水平提高86.6%的164#高产菌株.经发酵配方优化,该菌株的摇瓶单位再度提升了5.5%,显示出了高产潜力.
