首页 > 文献资料
-
胎盘滋养层细胞的感染和凋亡与HBV的宫内传播机制
目的:通过HBV感染体外培养的人绒毛膜滋养层细胞,探讨HBV宫内感染发生的机制.方法:对人早孕绒毛膜滋养层细胞进行原代培养和对人滋养层细胞系JEG-3进行传代培养,将HBV感染血清与原代及传代培养细胞共同孵育8-48 h,倒置显微镜观察细胞形态及细胞间连接,细胞免疫荧光和免疫组织化学染色方法检测滋养层细胞中HBsAg和HBcAg的表达,荧光定量PCR方法检测被感染的滋养层细胞中的HBV DNA,TUNEL方法检测滋养层细胞的凋亡.结果:与HBV阳性血清共同孵育对滋养层细胞的形态和细胞间连接无明显影响;细胞免疫荧光和免疫组织化学染色结果显示,滋养层细胞与HBV感染血清共同孵育(8,24,48 h)后,滋养层细胞可以出现HBsAg和HBcAg的阳性表达,24 h时HB sAg阳性细胞数量多(8 h:18.0%±3.67%;24 h:30.6%±2.88%;48h:24.8%±4.21%);荧光定量PCR方法检测到被感染的滋养层细胞中HBV DNA的存在;TUNEL结果显示,与HBV感染血清共同孵育可导致滋养层凋亡细胞数量逐渐增加(24 h:18.6%±3.05%;48 h:26.8%±2.86%;P＜0.01).结论:滋养层细胞的感染可能是HBV通过胎盘屏障的途径之一;HBV感染可以诱导滋养层细胞产生凋亡,这可能是胎盘屏障阻止HBV宫内感染的一种保护性机制.
-
高尔基体蛋白73单克隆抗体的制备和鉴定
目的 探讨高尔基体蛋白73(GP73)鼠源单克隆抗体的制备方法并进行鉴定.方法 用GP73重组抗原蛋白免疫5只小鼠获得血清抗体,免疫小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,经过筛选后选择GP73抗体阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养,通过腹水制备获得高特异性和高效价的GP73单克隆抗体(单抗).结果 成功筛选出11株能稳定分泌特异性GP73单抗的杂交瘤细胞株,经多次复苏传代仍能稳定分泌特异性强、效价高的抗体.11株单抗均能结合天然状态下的GP73蛋白,与无关蛋白均无交叉反应,提示有较强的特异性.应用筛选出的配对GP73单抗可检测出浓度为1ng/ml的GP73基因工程表达抗原.结论 制备的GP73杂交瘤细胞株分泌的抗体对GP73蛋白具有特异亲和性,并且有较高效价,为GP73蛋白诊断试剂的研制提供了关键技术基础.
-
不同固定剂及渗透方法对免疫荧光技术中EGFR内吞转运观察效果的影响
目的：探索适合表皮生长因子受体（EGFR）内吞转运免疫荧光观察的固定和渗透方法。方法：采用OLYMPUS BX61荧光显微镜及成像系统，对不同固定剂（4％多聚甲醛，甲醇，4％多聚甲醛＋甲醇，丙酮，丙酮与甲醇体积比1∶1的混合液）配合不同渗透方法（0．04％saponin，0．1％TritonX－100）得到的EGF刺激后0 min和15 min两个时间点的EGFR免疫荧光图像进行对比分析。结果：0 min时EGFR主要定位于细胞质膜，4％多聚甲醛＋甲醇的固定方法，配合使用0．04％saponin，可以观察到细胞膜上明显、清晰、连续的EGFR信号。针对EGF刺激15 min后内吞进入细胞的EGFR，不同固定方法对观察效果没有明显影响。但与配合使用0．04％saponin相比，0．1％TritonX－100进行渗透能充分暴露EGFR在细胞核内的信号。结论：温和的固定和渗透方法可获得较好的EGFR膜定位信号。针对内吞转运中的EGFR需要较强的渗透剂，以确定EGFR在细胞内准确的定位。
-
绵羊羊膜上皮细胞分离培养及鉴定
背景:目前有研究发现人羊膜和大鼠羊膜分离消化培养后,可成功获得具有干细胞特性的人羊膜上皮细胞和鼠羊膜上皮细胞,在体外一些外源因子作用下具有向三胚层细胞分化的潜能.目的:获取绵羊羊膜上皮细胞,并对其干细胞特性进行鉴定.方法:采用机械方法剥离绵羊羊膜组织,运用低速旋转TrypLE(胰酶替代物)消化法对绵羊羊膜进行分离培养获得绵羊羊膜上皮细胞.结果与结论:细胞免疫荧光检测结果表明绵羊羊膜上皮细胞表达Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等胚胎干细胞标记蛋白;RT-PCR技术鉴定结果显示绵羊羊膜上皮细胞的Oct-4、Sox-2、Rex-1全能性相关基因表达,而Nanog基因不表达.检测结果提示实验成功获得具有干细胞特性的绵羊羊膜上皮细胞.
-
一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法
背景：脑微血管内皮细胞是神经科学研究领域的重要工具细胞，如何获得高纯度的脑微血管内皮细胞一直是体外研究的关键和难点。
目的：探索一种简便易操作，高纯度的原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法。
方法：使用6-8周龄C57BL/6小鼠，经酶消化及梯度离心法获得微血管段，使用药物进一步纯化内皮细胞，利用CD31和GFAP免疫荧光染色鉴定内皮细胞纯度。使用Claudin-5免疫荧光染色鉴定紧密连接蛋白的表达情况。
结果与结论：①细胞呈旋涡状或铺路石样排列、生长；②免疫荧光显示内皮细胞纯度达99%以上，并广泛表达紧密连接蛋白；③结果表明，实验建立了一种简便、易操作的，可以获得大量高纯度的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法。 -
短葶山麦冬皂苷C的细胞内分布研究
制备纯化短葶山麦冬皂苷C(DT-13)单克隆抗体,选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及人宫颈癌细胞(HeLa)为研究对象,通过MTT法筛选给药浓度,以细胞免疫荧光定位法探索DT-13在细胞内的作用分布和蓄积情况及其特点.结果显示,在对细胞无显著毒性作用的DT-13浓度下,DT-13能迅速透过细胞膜进入胞浆,逐渐进入细胞核并长时间蓄积.DT-13(5.0 μmol/L)在给药30 min前主要分布于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞的胞浆,给药12 h后主要蓄积于细胞核内且持续时间可达24 h.而对人宫颈癌细胞(HeLa),与HUVEC细胞相比,DT-13(2.5 μmol/L)能更快进入并蓄积于细胞核.提示DT-13可能通过作用于细胞核而发挥其主要的生物活性.该方法能直观、可靠、便捷地观察DT-13在细胞内的定位及动态变化,为中药皂苷类活性成分的药效及作用机理研究提供新的技术方法.
-
八聚体结合蛋白4在不同转移能力肿瘤细胞株中的表达
目的 研究不同转移能力肿瘤细胞株中八聚体结合蛋白4(Oct 4)的表达情况及其意义.方法 选取3对不同转移能力的肿瘤细胞株:高转移能力人乳腺癌细胞 MDA-MB231 和低转移能力人乳腺癌细胞MCF7,高转移能力人食管癌细胞Eca-109和低转移能力人胃腺癌细胞AGS,高转移能力卵巢癌细胞HO-8910PM和低转移能力人卵巢癌细胞SK-OV-3;采用RT-PCR、实时荧光定量PCR和细胞免疫荧光技术分别从mRNA和蛋白水平检测Oct 4在各株肿瘤细胞中的表达情况.结果 Oct 4在6株肿瘤细胞中mRNA和蛋白水平均有表达.高转移能力细胞中mRNA 表达量较低转移能力细胞高;Oct 4蛋白红色荧光在细胞质中均有显示,在高转移能力细胞中较低转移能力细胞亮.结论 Oct 4 在高转移能力肿瘤细胞株中的表达较低转移能力肿瘤细胞高,提示与肿瘤细胞的转移能力可能存在相关性,其机制有待进一步研究.
-
穿透性Sox2蛋白的质粒构建及功能鉴定
目的 构建具有细胞性穿透性的9R-Sox2蛋白的重组质粒,使其在293T细胞中表达,并对所表达的9R-Sox2蛋白的功能进行鉴定.方法 从小鼠胚胎干细胞中扩增Sox2基因,并且在其N端加上9个精氨酸短肽,此融合基因连接到pPYCAG载体上,pPYCAG-9R-Sox2和pPYCAG分别转染到293T细胞中.3 d后,对转染细胞用嘌呤霉素筛选,1周后筛选得到阳性克隆细胞株,对其进行细胞免疫荧光鉴定.表达9R-Sox2蛋白的细胞株进行裂解,取细胞裂解液加入至小鼠胚胎成纤维细胞的培养基中进行通透.48 h后,小鼠胚胎成纤维细胞进行细胞免疫荧光检测,并提取蛋白Western blot检测PCNA表达.结果 用Sox2抗体进行细胞免疫荧光鉴定,结果均显示所有细胞表达9R-Sox2.在细胞裂解液处理的成纤维细胞,细胞免疫荧光结果显示9R-Sox2蛋白定位在细胞核,表明9R-Sox2构建和翻译正确.同时经含9R-Sox2的细胞裂解液处理的成纤维细胞,PCNA表达明显上调.结论 成功构建表达9R-Sox2融合蛋白的pPYCAG-9R-Sox2重组质粒,并证明具有细胞通透及促细胞增殖功能.
-
兔Tenon's囊组织原代成纤维细胞分离培养与鉴定
目的:改良和补充兔Tenon's囊组织原代成纤维细胞的分离培养、鉴定方法,为开展抗青光眼术后滤过泡瘢痕化的药物研究提供成熟的原代成纤维细胞.方法:应用组织块培养法,无菌条件下摘取组织,机械剪碎,于含10％胎牛血清的DMEM中培养,显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法鉴定,实时荧光定量PCR法检测细胞波形蛋白、角蛋白的mRNA水平.结果:分离培养的细胞具有成纤维细胞形态,7-10 d从组织块周围大量爬出,15 d铺满培养皿;免疫荧光法鉴定显示,波形蛋白表达阳性,角蛋白阴性表达;实时荧光定量PCR检测出细胞中波形蛋白mRNA水平远远高于角蛋白.结论:改良和补充了兔Tenons囊组织成纤维细胞原代培养与鉴定方法,为后续青光眼术后滤过泡抗瘢痕化的药物研究奠定基础.
-
硒蛋白K在小鼠中的组织差异表达及T淋巴细胞内定位
目的 检测硒蛋白K(SelK)在小鼠脾、肾、肠、肺、脑、肝组织中的表达差异及在T淋巴细胞内的定位,为研究SelK的分布与生物学功能的关联性提供参考.方法 采用实时荧光定量PCR,Western blot以及免疫组化方法检测硒蛋白K在小鼠各组织的表达差异,并采用细胞免疫化学的方法,用激光共聚焦显微镜观察硒蛋白K在小鼠T淋巴细胞内的定位.结果 实时荧光定量PCR结果显示硒蛋白K在小鼠各组织中均有表达,并且在脾脏中的表达明显高于其他组织(P＜0.05).Western blot及免疫组化结果与实时荧光定量PCR结果基本一致.细胞免疫化学结果显示硒蛋K在小鼠T淋巴细胞中定位于内质网.结论 硒蛋白K是一种在脾脏中高表达的内质网蛋白.
关键词： 硒蛋白K 实时荧光定量PCR Western blot 免疫组化 细胞免疫荧光 -
不同固定剂在激光共聚焦荧光技术中的效果评价
[目的]探讨3种不同的固定剂在激光共聚焦免疫荧光技术中对信号表达的影响.[方法]对培养的NRK-52E细胞分成胞浆,胞膜及胞核抗原3组,每组用4 g/L PFA,甲醇及丙酮分别固定后,完成免疫荧光实验;原代滑膜成纤维样细胞分两组用4 g/L PFA固定后分别用TritonX-100和预冷的甲醇进行打孔,完成免疫荧光实验之后,使用Confocal显微镜在条件同等的情况下观察并拍摄荧光图像,以证实小同的固定剂对信号表达的影响.[结果]胞浆蛋白α-SMA用丙酮固定时信号清晰锐利,将Actin蛋白的丝状结构表达得非常充分.胞膜蛋白ZO-1用甲醇固定处理的信号清晰.胞核蛋白磷酸化的Smad3用4 g/L PFA同定时p-Smad3信号与细胞核具有很好的共定位关系.原代滑膜成纤维样细胞用预冷甲醇打孔处理的细胞,其磷酸化的骨架相关蛋白(P-ERM)蛋白信号明显优于用TritonX-100打孔处理的细胞.[结论]针对不同抗原结构特点选用固定剂;有机溶剂固定剂用于细胞支架成分的固定.交联剂固定剂用于膜相关成分的固定,同时使用交联剂固定剂及有机溶剂打孔可较好的保存抗原而获得高质量的荧光图片.
关键词： 细胞免疫荧光 固定剂 激光扫描共聚焦显微镜 -
p53凋亡刺激蛋白2在食管鳞癌组织及食管癌EC109细胞中的表达及意义
目的 研究ASPP2在食管鳞癌(ESCC)组织及人食管癌EC109细胞中的表达及其意义.方法 采用SP免疫组化染色法及TUNEL染色法检测42例ESCC及13例正常食管黏膜组织ASPP2蛋白的表达和细胞的凋亡情况,分析ESCC中细胞的凋亡阳性率与ASPP2表达的相关性;采用免疫荧光染色法检测人食管癌EC109细胞中ASPP2蛋白的分布;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测经顺铂(cisplatin,CDDP)干预后的实验组及未干预的对照组细胞ASPP2mRNA的表达情况.结果 ASPP2蛋白在ESCC和正常食管黏膜组织的阳性率分别为52.4％(22/42)及84.6％(11/13),差异具有统计学意义(x2=4.298,P=0.038);凋亡阳性率在ESCC及正常食管黏膜分别为54.8％(23/42)和7.7％(1/13),差异有统计学意义(x2=8.943,P=0.003).在ESCC中,凋亡阳性率与ASPP2的表达呈正相关(r=0.666,P＜0.01).免疫荧光染色结果显示,ASPP2蛋白主要分布于EC109细胞的胞核及胞质中.经CDDP干预后,ASPP2 mRNA的相对表达是对照组的3.6倍(t=3.220,P=0.005).结论 ASPP2异常表达与食管癌的发生发展、增殖凋亡密切相关,可作为理想的肿瘤标志物,用于辅助ESCC诊断并指导临床治疗.
-
食管癌细胞系SLP-2基因的表达及其荧光表达载体的构建
目的:研究SLP-2基因在食管癌细胞系中的表达及其功能发生的具体分子机制.方法:运用Western-blotting检测SLP-2在TE12细胞系中的表达.利用PCR从TE12细胞的cDNA中扩增SLP-2的开放阅读框,定向连接到pEGFP-N3载体,并通过细胞免疫荧光实验检测SLP-2蛋白在TE7细胞内的表达.结果:SLP-2基因在TE12细胞中高表达,并成功构建pEGFP-N3-SLP-2荧光表达载体,SLP-2蛋白主要定位在细胞质内.结论:证明了SLP-2在食管癌细胞中高表达,其荧光表达载体的构建为进一步研究SLP-2在食管癌发生发展的分子机制奠定了基础.
-
热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定
目的 检测已构建热反应元件修饰的端粒酶逆转录酶hTERT基因启动子(8HSEs-hTERTp)调控的基因表达载体肿瘤特异性和热诱导特性.方法 ①RT PCR、Western blot和免疫细胞化学检测细胞内hTERT mRNA和蛋白表达水平,选择hTERT高表达和低表达的细胞株作为该研究阳性细胞株和阴性细胞株;②收集前期已包装成功的热反应元件8HSEs和人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp联合调控自杀基因PNP表达的慢病毒表达载体8HhP病毒液,感染hTERT+ SW480细胞及hTERT-MKN28细胞、hTERT-MRC-5细胞,细胞免疫荧光技术检测该治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性;并用Western blot和RT-PCR分别检测热刺激条件下目的基因PNP在不同hTERT水平细胞株中的表达水平.结果 hTERT mRNA及蛋白在SW480细胞中高表达,在MKN28细胞和MRC-5细胞中低表达甚至阴性表达;免疫荧光、RT-PCR和Western blot结果显示,8HSEs-hTERTp调控的目的基因PNP只有在43℃处理下的SW480细胞中呈现高表达,而在阴性细胞株MKN28和MRC-5中PNP表达较少,而常温下SW480细胞中PNP的表达水平明显低于热处理组.结论 8HSEs修饰的hTERT启动子可以明显提高治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性.
