骨髓内皮细胞分泌的抑制CFU-F生长的因子

为探讨骨髓微环境中内皮细胞调节造血的可能机制,本实验研究了骨髓内皮细胞无血清条件培养液(BMEC-CM)及其不同分子量组分对骨髓成纤维祖细胞(CFU-F)生长的作用.在体外培养条件下,收集人和小鼠纯骨髓内皮细胞无血清条件培养液,应用连续超滤技术从其中制备出分子量＞10 kD,3-10 kD和＜3 kD三种组分,进行骨髓CFU-F集落形成实验,检测这些条件培养液及其超滤组分的作用.结果显示,人和小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液和分子量＜3 kD超滤组分都抑制CFU-F的生长,但是分子量＞10kD和3-10 kD组分却不产生这种效应.两种条件培养液及其＜3 kD组分不仅减少CFU-F集落形成数,同时也使集落变小,而且,＜3 kD组分与CFU-F集落数之间有明显的负相关浓度依赖性关系.这些结果提示,骨髓内皮细胞至少能分泌一种分子量小于3 kD的对骨髓CFU-F生长有抑制作用的细胞因子.

骨髓内皮细胞产生造血抑制因子

本研究探讨骨髓内皮细胞分泌的造血抑制因子在扩增造血祖细胞中的作用并初步探讨其作用机制.收集无血清膏髓内皮细胞条件培养液(BMEC-CM),离心超滤,获得＞10 kD和＜10 kD的组分,以观察BMEC-CM原液及其＞10 kD和＜10 kD组分对CFU-GM及HPP-CFC的增殖作用的影响;检测骨髓内皮细胞及BMEC-CM中抑制因子的表达,用抗体中和实验检测BMEC-CM中的抑制因子对造血集落的抑制活性;用膜杂交法检测抑制因子联合造血刺激因子扩增造血细胞时增殖与分化相关基因的改变.结果表明:①BMEC-CM,＞10 kD及＜10 kD组分分别加入集落培养体系,BMEC-CM对CFU-GM及HPP-CFC的生成无明显影响,＞10 kD组分增加CFU-GM及HPP-CFC的生成,＜10 kD组分抑制CFU-GM及HPP-CFC的生成.②BMEC-CM,＞10 kD及＜10 kD组分分别加入骨髓细胞液体培养体系培养24小时后,BMEC-CM组CFU-GM明显减少,HPP-CFC显著增加;＞10 kD组分组CFU-GM明显增加,HPP-CFC无显著改变;＜10 kD组分组CFU-GM及HPP-CFC均明显减少.③小鼠骨髓内皮细胞表达MIP-2,MIP-1α,MSP,TGF-β,TNF-α,IFN-γ及Tβ4.BMEC-CM中存在有MIP-2,MIP-1α,MSP,TGF-β,TNF-α和Tβ4.④抗体中和实验结果表明在BMEC-CM中的TGF-β,MSP,MIP-1α,IFN-γ和Tβ4有明显抑制活性.⑤Tβ4与SCF,IL-3,IL-6,GM-CSF和EPO联合加入CD34+细胞扩增体系时,HPP-CFC明显增加,细胞增殖与分化相关基因及信号传导相关基因的表达较单用造血刺激因子组明显减弱或缺失.结论:BMEC-CM能显著促进早期造血祖细胞HPP-CFC增殖,其作用与BMEC-CM中存在的抑制因子的作用有关.这种作用可能是通过影响细胞增殖、分化及信号传导相关基因来实现的.

骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞向造血分化

为观察骨髓内皮细胞条件培养液(BECM)和(或)细胞因子(VEGF+SCF+EPO)对小鼠胚胎干细胞(ESC-D3细胞)生成造血干/祖细胞的促进作用,先将ESC-D3细胞形成4天胚状体(Day 4 embryoid body, 4dEB),再诱导4dEBs生成造血干/祖细胞.实验分4组,第1,2和3组分别为BECM+VEGF+SCF+EPO,BECM和VEGF+SCF+EPO组,第4组为自发分化对照组.检测各组造血干/祖细胞特异抗原、造血转录因子表达以及造血集落的形成.结果显示,BECM和(或)细胞因子诱导生成的细胞均表达造血干/祖细胞抗原(c-kit, Sca-1, Thy-1和CD34)和造血转录因子(c-myb, SCL和β-H1)基因mRNA,培养后可产生HPP-CFC和BFU-E.从诱导ESC-D3细胞生成造血干/祖细胞的数量和生成的集落总数看,BECM联合细胞因子组诱导效率均显著高于单用组和对照组.结论:骨髓内皮细胞条件培养液能显著促进胚胎干细胞早期造血分化,且骨髓内皮细胞条件培养液与细胞因子联合时效果更强.

粒-巨噬细胞集落刺激因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的促进作用

本研究以内皮细胞培养液(Endo-M)培养小鼠骨髓内皮细胞,探讨粒-巨噬系集落刺激因子(rmGM-CSF)对骨髓内皮细胞增殖的影响.用Endo-M培养小鼠骨髓内皮细胞,通过Wright-Giemsa染色计数内皮细胞集落、应用免疫荧光法观察内皮细胞表型;加入不同浓度的GM-CSF,通过集落形成率、MTT法和流式细胞术检测内皮细胞生长周期,观察GM-CSF对内皮细胞体外扩增的影响.结果表明:Endo-M诱导的骨髓细胞可以生成内皮细胞集落,vWF检测呈阳性;集落形成率检测及MTT法测定均证实GM-CSF对内皮细胞的增殖具有明显的促进作用;生长周期检测结果显示,GM-CSF处理组的细胞进入S期的比率为9.3%,而对照组为2.1%,说明GM-CSF可以通过促使内皮细胞进入S期而加快细胞的分裂,促进细胞增殖;比较第1代和第4次传代后细胞的生长曲线,两者无明显差别,说明多次传代后的细胞仍保持传代早期的增殖潜能.结论:GM-CSF对内皮细胞的增殖具有促进作用,经多次扩增传代后内皮细胞的增殖潜能无明显改变.

Slit-Robo信号通路在心脏血管生成中的作用研究进展

血管形成的过程包括血管发生和血管生成.血管发生于任何没有存在血管系统的地方,见于发育阶段,也见于病理情况下(如骨髓内皮细胞的前体)[1],血管生成是新血管形成时的细胞组成过程,包括已存在的血管和肿瘤血管的毛细血管出芽,多见于病理情况下.在正常成体内罕见血管生成,仅偶尔在雌性动物的生殖循环期间重现,例如:排卵、月经周期、受精卵进入子宫内膜和妊娠等.

骨髓内皮细胞的生物学特性及其介导血管新生能力的研究

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液支持卵黄囊造血干/祖细胞的体外生长

目的观察小鼠骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)对卵黄囊造血干/祖细胞体外生长的支持作用.方法取妊娠第8.5天的卵黄囊,经消化后获得卵黄囊细胞,取卵黄囊非贴壁细胞加入含10%mBMEC-CM和10%FBS的DMEM中培养24 h后,收集细胞做半固体培养.结果mBMEC-CM在液体培养体系中能扩增卵黄囊造血干/祖细胞使粒-巨噬系集落形成单位(granulocyte-macrophage colony ofrming unit,CFU-GM)和高增殖潜能集落形成细胞(high proliferative potential forming cell,HPP-CFC)的产率增加,经24 h液体培养后的CFU-GM和HPP-CFC的数目分别为培养0 h对照组的119.5%和130.8%(P＜0.05);mBMEC-CM联合flt3配基(flt3 ligand,FL)和血小板生成素(thrombopoietinTPO)后,其扩增CFU-GM和HPP-CFC的能力明显增强,mBMEC-CM联合FI和TPO经24 h液体培养后的CFU-GM和HPP-CFC的数目分别为培养0 h对照组的132.0%和176 9%(P＜0.01).结论mBMEC-CM对卵黄囊造血干/祖细胞的维持和扩增有促进作用,mBMEC-CM联合FL和TPO对卵黄囊造血干/祖细胞的扩增作用明显增强.

骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖的促进作用

本文通过制备小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液(serum-free murine bone marrow endothelial cell conditioned medium,mBMEC-CM),经超滤分为分子量＞10 kDa组分和＜10 kDa组分,分别观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞集落生成的影响.用Wright's Giemsa染色计数内皮细胞集落及检测骨髓内皮细胞的vWF,通过[3H]-TdR掺入量,观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的影响,并用分子杂交方法检测内皮细胞表达的细胞因子,从几个方面来研究mBMEC-CM对骨髓内皮细胞增殖的作用.结果显示,骨髓内皮细胞vWF检测阳性.mBMEC-CM原液及其分子量＞10 kDa组分能刺激骨髓内皮细胞集落增殖,且能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量;分子量＜10 kDa组分对骨髓内皮细胞集落增殖无明显刺激作用,也不能增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量.外源加入IL-6、IL-11、SCF、GM-CSF、VEGF、bFGF 6种细胞因子能明显刺激骨髓内皮细胞集落增殖,SCF、VEGF、bFGF能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量.Atlas array膜杂交实验显示骨髓内皮细胞内源性表达GM-CSF、SCF、MSP-1、endothelin-2、thymosin β10、connective tissue GF、PDGF-A chain、MIP-2α、PlGF、neutrophil activatingprotein ENA-78、INF-γ、IL-1、IL-6、IL-13、IL-11、inhibin-α等细胞因子的mRNA.上述结果提示,骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖具有促进作用.

小鼠骨髓内皮细胞分泌的细胞因子对造血干/祖细胞增殖的影响

应用小鼠骨髓内皮细胞株细胞传代培养,收集无血清条件培养液(mBMEC-CM),经超滤分成大于10 kD和小于10 kD两组分,分别观察两组分的mBMEC-CM对小鼠骨髓造血干/祖细胞CFU-GM,HPP-CFC,CFU-E,BFU-E和CFU-Meg的影响.结果表明: 含分子量大于10 kD物质的mBMEC-CM的保留液能明显刺激CFU-GM,HPP-CFC,CFU-E,BFU-E和CFU-Meg生长;含分子量小于10 kD物质的mBMEC-CM的超滤液能明显抑制CFU-GM,HPP-CFC,CFU-E,BFU-E和CFU-Meg生长.分子杂交结果显示,小鼠骨髓内皮细胞有多种细胞因子mRNA表达,其中首次发现小鼠骨髓内皮细胞有thymosin-β4,MIP-2α,IL-11,IL-13,IFN-γ和MSP-1等细胞因子mRNA表达,说明小鼠骨髓内皮细胞可分泌多种细胞因子调节造血细胞的增殖.

小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液及其超滤组分对粒巨噬系祖细胞生长的影响

本研究通过传代培养小鼠骨髓内皮细胞系细胞, 收集无血清条件培养液(mBMEC-CM), 将其作多级串联超滤, 获得分子量大于10、 3～10、 1～3、 0.5～1 kD和小于0.5 kD超滤组分.进行粒巨噬系造血祖细胞集落形成试验, 检测了它们的作用.mBMEC-CM 和3～10 kD组分对粒巨噬系祖细胞(CFU-GM)生长未见明显影响, 而分子量大于10 kD和0.5～1 kD组分促进CFU-GM的增殖, 分子量1～3 kD和小于0.5 kD组分则抑制CFU-GM的增殖.这4种超滤组分对CFU-GM生长的效应均有剂量依赖性.这些结果提示, 在体外培养条件下, 小鼠骨髓内皮细胞分泌若干种活性成分, 分别对CFU-GM的生长起促进或抑制作用.

ePTFE人工血管材料内衬自体骨髓内皮细胞的实验研究

目的:探讨自体骨髓内皮细胞衬里对ePTFE人工血管材料通畅性的影响.方法:24只犬随机分入实验组(12只)和对照组(12只).实验组取犬自体骨髓,提取单核细胞种植ePTFE人工血管,行左髂动脉人工血管置换术；对照组采用普通ePTFE人工血管.分别于术后1月、3月行彩色多普勒超声观察其通畅率,并行组织染色及扫描电镜观察,比较人工血管表面内皮化情况.结果:术后1月时实验组人工血管通畅率及内膜厚度同对照组均无明显差别；但术后3月时实验组通畅率高于对照组,内膜厚度明显小于对照组(P＜0.05).结论:自体骨髓内皮细胞衬里技术可明显提高ePTFE人工血管的短期通畅率,但其对远期通畅率的影响尚有待进一步观察.

骨髓内皮细胞与造血发生的关系

骨髓造血微环境是造血细胞增殖、分化和成熟的场所.而内皮细胞是造血微环境中重要的基质细胞成分.近年来,骨髓内皮细胞参与造血调控的现象不断地被发现和证实,极大地促进了造血干-祖细胞和造血调控机制的研究.本文就近年来骨髓内皮细胞与造血发生关系的研究进展综述如下.

骨髓内皮细胞条件培养液对巨核系细胞体外增殖的影响

目的: 探讨骨髓内皮细胞条件培养液(E-CM)对巨核系细胞体外增殖的调节作用.方法: 分离纯化骨髓内皮细胞和骨髓成纤维细胞,分别收集其无血清条件培养液,比较两种无血清条件培养液对体外扩增成熟巨核细胞和巨核系祖细胞的作用.结果: E-CM和骨髓成纤维细胞条件培养液(F-CM)对成熟巨核细胞及巨核系祖细胞有体外扩增作用;E-CM对巨核系祖细胞的扩增作用明显优于F-CM(P<0.05);对成熟巨核细胞的扩增作用弱于F-CM(P<0.01).结论: E-CM对巨核系细胞, 主要是巨核系祖细胞有体外扩增作用.

小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的作用

目的:观察骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的影响.方法:体外培养骨髓内皮细胞株细胞,收集无血清条件培养液(命名为ECM).用MiniMACS磁珠法分离脐血CD34+细胞.检测CD34+细胞经ECM体外液体培养24 h后或与骨髓内皮细胞层(ECL)共培养24 h后脐血造血细胞的扩增倍数,并观察在加入bFGF的培养条件下收集的骨髓内皮细胞条件培养液(bFGF-ECM)是否能加强对脐血造血细胞的扩增作用. 结果:ECM,ECL 皆能显著扩增脐血早期或晚期造血细胞,且二者对早期造血细胞的扩增效果是类似的;bFGF-ECM对脐血造血细胞的扩增倍数明显高于用ECM扩增的倍数.结论:小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞有明显的体外扩增作用.

骨髓内皮细胞无血清条件培养液对WEHI-3细胞生长的影响

该实验收集小鼠骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)预留部分原液外,其作用阻遏分子量为10000daltons(10KD)和3000daltons(3KD)的超滤膜眼滤,获得分子量＞10DK、3～10KD、＜3KD的超滤液,分别检测不同组分超滤液及原液对小鼠白血病细胞系(WEHI-3)细胞集落生长的影响,发现小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液中分子量＞10KD和＜3KD组分对小鼠粒单系白血病细胞系(WEHI-3)集落生长有明显的抑制作用,而mBMEC-CM原液和3～10KD两组的集落数与对照组差别无统计学意义.以上结果表示:小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液中可能存在多种分子量大小不同的造血生长因子,对粒单系白血病细胞系(WEHI-3)细胞的生长起调控作用.

骨髓内皮细胞在造血微环境中作用的研究进展

骨髓造血微环境,即“龛”是由基质细胞、细胞因子及细胞外基质组成.成骨细胞及内皮细胞是造血微环境的重要组成部分,与造血干细胞(HSCs)关系密切.成骨细胞参与构成的成骨龛是造血干/祖细胞定居的主要场所,对HSCs的自我更新和稳态起着重要的作用；而内皮细胞参与构成的血管龛造血调控中的作用近年也成为研究热点.内皮细胞通过与其他基质细胞的协同作用,合成和分泌多种造血调控因子,具有支持营养和调控HSCs的增殖和分化、协助HSCs的跨内皮迁移,在其归巢和动员中也起着重要的作用.笔者就骨髓内皮细胞在造血龛中作用的研究进展进行综述.