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BET bromodomain蛋白在人胚胎干细胞造血分化中的作用研究
目的:探讨BET bromodomain蛋白在人胚胎干细胞造血分化中的作用.方法:应用人胚胎干细胞单层造血分化体系,通过免疫荧光技术、流式细胞术及实时定量PCR技术,研究BET bromodomain蛋白抑制剂I-BET151对造血分化的影响,并在不同分化阶段添加I-BET 151探讨其在造血分化过程中的作用阶段.结果:I-BET151能够显著抑制CD43+造血干/祖细胞的产生,并且在APLNR+侧板中胚层生成、CD34+ CD31+生血内皮产生及内皮细胞生血转化3个阶段添加I-BET 151对CD43+造血干/祖细胞的产生均有显著抑制作用.结论:人胚胎干细胞造血分化过程中添加BET bromodomain蛋白抑制剂I-BET 151,能够抑制CD43+造血干/祖细胞的产生,并进一步证实BET bromodomain蛋白在造血分化各个阶段均发挥有作用.
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抑制Ras信号通路可减弱小鼠胚胎干细胞的造血分化
为了探讨Ras信号通路对小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem cells,ES cells)造血分化的影响,将突变型基因RasN17转染小鼠ES细胞,免疫印迹检测RasN17的表达对Erk1/2及Akt磷酸化的作用,应用半定量RT-PCR检测ES细胞在分化过程中与造血相关的基因的表达.结果表明:Ras N17的表达能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化,携带RasN17基因的ES细胞在分化过程中Runx1、SCL及beta-major珠蛋白等基因的表达被显著抑制,而FLK1的表达不受影响.结论:ES细胞体外造血分化需要Ras通路的活化.
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染色体构象捕获技术在造血分化调控研究中的进展
新研究显示基因组空间结构对转录调控起着关键的作用.以造血分化过程为例,三维调控网络能更真实、精确地呈现造血特异的关键转录因子调控的组织方式和动态过程.革新的染色体构象捕获技术的发展和延伸为解析不同染色体间的调控元件、同一染色体内的不同调控元件以及核内染色质功能性组分之间的转录调控的空间结构提供了研究手段.本文详细介绍了染色体构象糍获技术和在此基础上衍生的高通量组学技术的发展,以及这些技术在造血分化过程中的应用.
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DMSO促进人胚胎干细胞体外造血分化
目的:探讨DMSO在人胚胎干细胞造血分化中的作用.方法:利用已建立的人胚胎干细胞逐级诱导分化体系,通过流式细胞术分析并结合免疫荧光测定研究DMSO在造血分化中的作用,同时通过在不同时间点添加DMSO,确定其发挥作用的窗口期.结果:免疫荧光及流式细胞术分析发现,在人胚胎干细胞造血分化过程中添加DMSO显著促进CD43+造血祖细胞的产生;流式细胞术分析发现,DMSO显著促进APLNR+侧板中胚层细胞和CD31+ CD34+生血内皮细胞的产生;在侧板中胚层细胞产生的窗口添加DMSO显著促进CD31+ CD34+生血内皮细胞和CD43+造血祖细胞的产生.结论:DMSO通过促进侧板中胚层的产生促进人胚胎干细胞造血分化能力,在侧板中胚层发生窗口添加DMSO能够显著促进造血祖细胞的产生.
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小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响
骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞,在体外具有一定的造血支持作用,与造血干细胞共移植可促进其植入.本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性.首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养,通过造血集落培养和RT-PCR观察造血分化的特点.结果表明,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一,高表达Sca-1,CD29,CD44和CD105,而CD34和CD45等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性;特异性诱导体系内传代后(>4代)的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化.与悬浮分化体系相比,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞.此外,RT-PCR检测发现:共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct-4,而造血标记Flk-1, GATA-1和β-H1为阴性.结论:间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系.
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骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞向造血分化
为观察骨髓内皮细胞条件培养液(BECM)和(或)细胞因子(VEGF+SCF+EPO)对小鼠胚胎干细胞(ESC-D3细胞)生成造血干/祖细胞的促进作用,先将ESC-D3细胞形成4天胚状体(Day 4 embryoid body, 4dEB),再诱导4dEBs生成造血干/祖细胞.实验分4组,第1,2和3组分别为BECM+VEGF+SCF+EPO,BECM和VEGF+SCF+EPO组,第4组为自发分化对照组.检测各组造血干/祖细胞特异抗原、造血转录因子表达以及造血集落的形成.结果显示,BECM和(或)细胞因子诱导生成的细胞均表达造血干/祖细胞抗原(c-kit, Sca-1, Thy-1和CD34)和造血转录因子(c-myb, SCL和β-H1)基因mRNA,培养后可产生HPP-CFC和BFU-E.从诱导ESC-D3细胞生成造血干/祖细胞的数量和生成的集落总数看,BECM联合细胞因子组诱导效率均显著高于单用组和对照组.结论:骨髓内皮细胞条件培养液能显著促进胚胎干细胞早期造血分化,且骨髓内皮细胞条件培养液与细胞因子联合时效果更强.
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胚胎干细胞来源的BL-CFC可产生高增殖潜能造血祖细胞
小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)体外分化2.5-3.5天形成的拟胚体(embryoid body, EB)中可产生原始细胞集落形成细胞(blast colony-forming cell, BL-CFC),后者具有造血和内皮细胞双向分化潜能,是目前体外实验可检测到的早期的定向造血分化的细胞.本研究建立BL-CFC培养体系,并通过造血祖细胞集落培养、免疫荧光标记以及巢式RT-PCR鉴定单个原始细胞集落来源的贴壁细胞和非贴壁细胞的分化特点.结果表明:部分贴壁细胞吞噬DiI-Ac-LDL,并表达CD31,UEA-I,VE-cadherin等内皮细胞特异性的表面分子;非贴壁细胞具有原始造血(primitive hematopoiesis)和(或)永久造血(definitive hematopoiesis)活性,其中20%的原始细胞集落含有高增殖潜能集落形成细胞(high proliferative potential colony-forming cell, HPP-CFC),后者能形成次级造血集落.结论:胚胎干细胞来源的BL-CFC可产生高增殖潜能造血祖细胞,但原始细胞集落来源的HPP-CFC是否具有体内造血活性有待进一步的研究证实.
关键词： 胚胎干细胞 原始集落形成细胞 高增殖潜能集落形成细胞 造血分化 -
C57BL/6小鼠来源的胚胎干细胞建系及体外定向造血分化的研究
哺乳动物的胚胎造血表现为时间和空间的连续变化.既往研究表明,129小鼠来源的胚胎干细胞系(em-bryonic stem cells,ES细胞)的体外分化能在一定程度上模拟胚胎造血.为研究C57BL/6小鼠来源的ES细胞系体外定向造血细胞分化的特点,分离C57BL/6小鼠3.5天囊胚的内细胞团建立ES细胞系并采用常规方法鉴定,应用体外二步分化法形成拟胚体并进行集落培养,细胞化学染色和RT-PCR鉴定造血前体细胞.结果表明:所建ES细胞系MES-1符合建系标准,其体外分化后可在不同阶段的拟胚体中发现多种造血前体细胞的有序出现,包括原始红系前体细胞,永久红系前体细胞,混合集落形成细胞和粒单系集落形成细胞.RT-PCR分析显示,拟胚体表达多种造血特异性的转录因子和造血标记.结论:自C57BL/6小鼠建立的ES细胞系MES-1体外定向造血细胞分化在一定程度上能模拟胚胎造血.
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GATA-1调节红系、巨核系分化的新进展
各种造血细胞的终末分化是组织特异性基因产物协同配合作用的结果,该现象部分是由基因转录水平进行调节的.GATA-1是红系特异谱系转录因子,红系基因的表达在其控制之下.近年来,又发现GATA-1也是巨核细胞系、肥大细胞系分化发育,基因表达的重要调控因子.本文仅就GATA-1的结构特点,在造血细胞分化中的作用及基因表达活性的调节作一介绍.
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原代骨髓基质细胞联合细胞因子体外诱导ES-D3细胞造血分化的研究
目的:研究原代骨髓基质细胞联合细胞因子(VEGF,SCF和TPO)体外诱导ES-D3细胞造血分化的效率,探讨体外高效诱导胚胎干细胞生成造血干/祖细胞的方法.方法:取6～8周昆明鼠骨髓制备小鼠骨髓基质细胞(BMSC)饲养层.采用二步诱导法,先将ES-D3细胞诱导分化为拟胚体(EB),再将EB置于4种体系下诱导分化造血干/祖细胞:第1组:自发分化对照组;第2组:细胞因子组(VEGF加SCF加TPO);第3组:BMSC饲养层组;第4组:BMSC饲养层加细胞因子组(BMSC加VEGF加SCF加TPO).诱导分化1周的部分细胞行造血祖细胞集落培养.流式细胞仪检测诱导培养7 d和14 d的各组细胞中干细胞特异抗原(CD34)、祖细胞特异抗原(c-kit)、粒细胞表面抗原(CD11b)、红系细胞特异抗原(Ter119)阳性表达率.间接免疫荧光染色法显示CD34、c-kit、CD11b、Ter-119阳性细胞.RT-PCR检测造血转录因子GATA-2、Flk-1、SCL、β-H1和β-major珠蛋白的表达.结果:诱导7 d生成的细胞均表达造血CD34和c-kit,诱导14 d生成的细胞表达单核巨噬细胞、CD11b和Ter-119,且诱导细胞表达造血转录因子(GATA-2、SCL、β-H1、β-major)基因mRNA,培养在特定条件下可形成造血祖细胞集落.从生成造血细胞和造血集落的数量分析,骨髓基质细胞饲养层与细胞因子合用时诱导效率明显高于单用组和对照组(P＜0.05或0.01).结论:骨髓基质细胞饲养层与细胞因子合用,体外可以促进ES-D3细胞的早期造血分化,产生的造血前体细胞可进一步形成造血集落并分化成熟,表达与造血转录和早期造血分化相关的基因.
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地中海贫血患者来源外周血及脐带血细胞诱导式多能干细胞的建系和造血分化
目的：探讨地中海贫血（地贫）患者特异诱导式多能干细胞系（ iPSCs）细胞模型的建立及造血分化能力。方法采集HbH病引产胎儿（α地贫）的脐带血、双重杂合子β地贫输血患者（基因型为IVS－Ⅱ－654／CD17）外周血各1例，分离单核细胞后进行短期培养，核转染再程序化为iPSCs，检测iPSCs未分化状态和多能性标志物。 iPSCs与OP9细胞共培养向造血干细胞诱导分化，进行吉姆萨染色检查和流式细胞术检测造血干细胞的分化结果。结果地贫患者iPSCs表达干细胞多能性标志物Oct4、SSEA4、Tra－1－60、Tra－1－81，碱式磷酸酶染色阳性，悬浮培养可以形成类球形拟胚体，畸胎瘤形成实验显示地贫患者iPSCs可分化为内、中、外胚层细胞。流式细胞术检测结果显示CD34＋细胞分别为8.71％（α－iPSCs分化结果）和4.46％（β－iPSCs分化结果）。结论α、β地贫患者外周血与脐带血可再程序化为 iPSCs，该细胞系具有多能分化特性，与OP9共培养能分化为造血干细胞。
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利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞的初步研究
目的 利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞.方法 利用非整合型载体,将四个转录因子:Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc导入脐血来源的造血干/祖细胞(CD34+细胞)重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs),再利用与小鼠骨髓基质细胞OP9共培养法将其定向分化成CD34+造血干/祖细胞.借助iPSCs可以在体外无限传代、大量扩增的特点,实现体外保存及大量扩增造血干/祖细胞的目的.结果 脐血CD34+细胞可以在体外重编程为非整合型iPSCs,并能够高效定向分化成为CD34+细胞,其分化效率比胚胎干细胞(ESCs)有显著提高.结论 利用诱导性多能干细胞技术体外大量扩增脐血造血干/祖细胞是一个可行的方案,具有良好的应用前景.
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不同发育阶段拟胚体对小鼠胚胎干细胞造血分化的影响
目的 通过对拟胚体(Embryoid body, EB)在造血发育过程中三个不同发育阶段的初步探讨,以了解它们对胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)造血分化的影响.方法 根据不同阶段拟胚体的发育特点,将拟胚体分为三个阶段:EB 3-5天、EB 6-8天以及EB 9-13天.通过形态学、流式细胞仪分析、Realtime PCR以及造血集落形成试验来分析不同阶段拟胚体在造血分化过程的特点.结果 EB培养至第5天、第7天、第10天时,每6000个ES细胞形成EB的数量分别是97、100、88个;流式细胞仪检测CD34+/Sca-1+细胞,结果分别是8.91%、9.23%、12.73%;Realtime PCR结果分别显示EB培养到第6天左右时中胚层发育为活跃,第10天时造血发育比前两个阶段要活跃;造血集落形成试验显示EB发育至第5天、第7天以及第10天时,每1×105个EB细胞形成的集落数分别是21、26、32.结论 EB 3-5天处于分化早期,各种检测参数数值都相对比较低,适合于次级拟胚体以及爆发集落的培养;EB 6-8天中胚层发育为活跃;EB 9-13天造血发育相对比较成熟.根据不同阶段拟胚体发育的特点,可以选择适当的拟胚体作为体外造血分化模型来满足不同研究目的 需要.
