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流式细胞术检测弱表达D抗原的探讨
曾有报道采用流式细胞术定量分析红细胞膜D抗原密度(D antigen density),为此提出采用敏感的流式细胞术常规检测D抗原弱阳性表型,本研究旨在探讨其可行性.2010年至2011年间采用盐水法、间接抗人球蛋白试验(IAT)和吸收放散试验检测到6例D抗原弱阳性表型和7例DEL型样本,通过RHD基因定型、合子型分析和RHD基因序列测定,鉴定3例为弱D15型,3例为部分DV Ⅰ-Ⅲ型,7例为DEL型且均携带RHD1227A等位基因.取正常RhD阴性2例和正常Rh(D)阳性样本2例作对照,采用流式细胞术分别检测上述弱D15型、部分DV Ⅰ-Ⅲ型和DEL型,观察其平均荧光强度.结果表明,流式细胞术检测弱D15和部分D型DV Ⅰ样本的平均荧光强度与Rh(D)阴性对照有显著性差异(P＜0.05),可判读为D抗原阳性；7例DEL红细胞样本的平均荧光强度与Rh(D)阴性对照均无显著性差异(P＞0.05),检测结果均可判读为阴性,其中包括1例DEL,其红细胞样本的吸收放散检测结果为强阳性,即使IAT检测的结果也显示为“±”,合子型分析显示为RHD+/RHD+纯合子,流式检测亦为阴性.结论:流式细胞术检测D抗原的敏感度与IAT相近,低于吸收放散试验；用于检测弱D或部分D型不如IAT简便实用,用于检测DEL型其敏感度不够.
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Rh弱D及Del样本的检测研究
为了研究初筛为RhD(-)样本中弱D及Del的检测,采用常规血清学方法初筛RhD,用间接抗人球蛋白试验(IAT)检测弱D,应用三氯甲烷/三氯乙烯吸收放散法检测Del.结果表明:在26 200例献血者中,常规血清学初筛D(-)者56例(2.14‰),其中经IAT实验确认为弱D型者5例,吸收放散试验确认Del型者9例,且与CE表型相关.结论:为了临床输血安全,经常规血清学检测RhD阴性者,应当再用间接抗球蛋白试验及吸收放散实验检测是否为弱D及Del.
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新生儿D抗原遮蔽现象分析及应对策略
目的 探讨新生儿D抗原遮蔽现象产生的原因及对血型鉴定的影响,结合文献提出应对策略.方法 采用血清学方法对新生儿及母亲的血型抗原、抗体进行分析及鉴定.结果 3例新生儿血型均产生不同程度的遮蔽现象,新生儿血型抗体筛查为阳性,抗体鉴定为抗-D抗体,且均能被放散实验检测出.结论 新生儿D抗体阳性易导致新生儿溶血病,临床上应对这类情况进行追踪并尽早采取相应措施.
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稀有血型队伍建立的现状分析及科学管理
人类Rh血型是复杂的红细胞血型系统,其中D抗原具有较强的抗原性,因能导致严重的新生儿溶血病(HDIV) 、溶血性输血反应备受人们的关注.
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抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原单克隆抗体的制备及其初步应用
目的 制备脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)Ⅰ型D抗原单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA检测方法.方法 采用Vero细胞培养脊髓灰质炎病毒Ⅰ型,柱层析纯化病毒抗原,SDS-PAGE鉴定病毒蛋白,HPLC分析抗原纯度,Western blot分析抗原的反应原性.以纯化的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原免疫BALB/c小鼠,进行细胞融合,筛选可分泌脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株.单克隆抗体经纯化后,采用间接ELISA法检测小鼠腹水抗体效价、单抗的特异性及相对亲和力.分别以纯化的单抗作为捕获抗体和酶标抗体,进行配对试验,建立用于脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原检测的双抗体夹心ELISA方法,确定方法的佳线性范围,并验证方法的特异性.结果 纯化的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原经SDS-PAGE分析,共显示4条蛋白条带,相对分子质量分别为约40 000、35 000、32 000和28 000;经HLPC分析,纯度达99％；小鼠免疫血清可与相对分子质量约为35 000的VP1蛋白发生特异性反应.共筛选出5株可稳定分泌脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,纯化的单抗仅与D抗原发生反应；2H1和3B5株单抗的效价分别为2× 107和2× 106,且亲和力高于其他3株单抗.采用2H1和3B5株单抗配对,可以特异性检测D抗原,而与C抗原不反应；D抗原佳线性范围为4.300～0.071 DU/ml,R2为0.994 6.该法仅可检出脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原,而与脊髓灰质炎病毒Ⅱ型、Ⅲ型D抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅰ型C抗原、EV71抗原、Vero细胞培养上清不发生交叉反应.结论 制备了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原单克隆抗体,建立了可用于脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原特异性检测的双抗体夹心ELISA方法.
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Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗D抗原国家标准品的建立
目的 制备Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗D抗原国家标准品,并进行协作标定及稳定性检测.方法 委托中国医学科学院医学生物学研究所按照国家批准工艺制备分装三价候选国家标准品,并考察其均匀性;组织5家实验室采用统一的D抗原ELISA检测方法对候选标准品协作标定,确定D抗原标示值,并对其稳定性进行初步检测.结果 候选标准品分装精度变异系数(CV)为0.21％;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型CV值分别为7.39％、6.21％、7.75％;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在不同实验室间D抗原含量的CV值分别为4.03％ ～ 5.90％、3.48％～4.00％、3.03％～4.53％,抗原含量均一性良好;确定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型终标准品效价分别为180、191、243 DU/mL.将标准品于4及-20 ℃放置4个月,3个血清型的D抗原含量均未发生较大变化;25℃放置约7周时,各血清型D抗原含量才出现下降趋势;37℃放置1周时开始下降,尤以Ⅰ型为明显.结论 制备的候选标准品满足国家生物标准物质的要求,可应用于Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗体外效力检测.
关键词： Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗 D抗原 标准品 -
脊髓灰质炎灭活疫苗抗原含量检测方法的研究进展
脊髓灰质炎灭活疫苗(inactived poliovirus vaccine ,IPV)的问世使全球范围内消灭脊髓灰质炎成为可能,而且IPV在全球致力于消灭脊髓灰质炎中的作用日益增强.通过IPV D抗原检测可以检测IPV效力,因此IPV D抗原的快速定量检测成为亟待解决的关键问题.目前,常用的体外检测法是ELISA法,然而,尚无国际公认的标准IPV效力检测法.此文就IPV抗原含量检测方法的研究进展加以综述.
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Sabin株脊髓灰质炎病毒I、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法的建立及应用
目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine, sIPV) D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,用于sIPV的体外效力评价.方法 以纯化D抗原分别免疫西门塔尔牛和BALB/c小鼠,获得牛免疫血清和小鼠单克隆抗体(单抗)杂交瘤细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备单抗腹水.牛血清和小鼠腹水分别经沉淀和亲和层析后得到纯化牛多克隆抗体(多抗)和小鼠单抗.以多抗为包被抗体、单抗为检测抗体进行配对筛选,建立D抗原定量检测的双抗体夹心 ELISA.对方法的线性、范围、特异性、准确度、精密度以及在sIPV制备过程中样品检测的适用性进行验证.结果 纯化多抗和单抗均具有中和抗体活性,纯度分别达到80％和90％以上.经抗体配对筛选,确定3H10、901、1H10作为检测抗体,分别用于I、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA的建立.I、Ⅱ、Ⅲ型包被抗体的使用浓度分别为1:8 000、1:8 000,1 : 10 000, 3H10、901、1H10检测抗体的使用浓度分别为1 : 10 000,1 : 20 000,1 : 10 000.建立的I、Ⅱ、Ⅲ型D抗原检测方法的检测范围分别为0.4～13.0、0.4～12.0和0.4～20.0 DU/ml,线性回归决定系数≥0.99.该法能特异性检出D抗原,与C抗原、不同型别D抗原以及生产过程中的其他物质无交叉反应.用该法对高、中、低浓度样品进行测定, I、Ⅱ、Ⅲ型测定值/理论值(×100％)分别为97％～111％、91％～104％和95％～102％、相对标准偏差分别≤7％、≤9％和≤10％;采用该法检测sIPV生产过程中的样品,显示出抗原纯化趋势.结论 建立了脊髓灰质炎病毒I、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法,可有效用于sIPV的体外效力评价.
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Rh弱D、Del的检测及意义
目的:探讨初筛为Rh(D)阴性样本中弱D、Del的检测及临床意义.方法:采用常规血清学方法初筛Rh(D)血型,用微柱凝胶抗人球蛋白试验检测弱D,用吸收放散试验检测Del,用PCR-SSP法检测样本RhD基因8个外显子结构.结果:常规血清学初筛Rh(D)阴性60例中经微柱凝胶抗人球蛋白试验确认为弱D4例,占6.67%;56例Rh(D)阴性标本经吸收放散试验后确认13例为Del,占21.67%;对其中2例弱D和5例Del标本的D基因8个外显子检测都完整存在,排除了弱D、Del的10例Rh(D)阴性标本其基因检测有完全缺失和部分缺失两种可能.结论:为了临床输血安全,常规血清学检测Rh(D)阴性者,应当再用抗人球蛋白试验或吸收放散试验检测是否为弱D或Del.
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1例新的弱D型的鉴定
目的 分析1例新的Rh血型弱D型个体的RHD等位基因及其红细胞D抗原表位.方法 采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,并分析D抗原表位;序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,然后分析RHD编码区全长序列,并检测RHD杂合型.结果 血清学显示该个例为D抗原弱表现型,Rh因子为D+C+c+E-e+,PCR-SSP检测RHD基因显示与正常Rh(D)阳性对照相同.RHD编码区序列分析发现第9外显子存在1 212 C＞A碱基突变,其余外显子序列则与正常RHD基因一致(GenBank EF103573),RHD合子型鉴定为RHD+/RHD-杂合型,提示该个体基因型为CDe/cde.红细胞D抗原表位分析显示其具有基本完整D抗原表位.结论 该个例为RHD 1 212 C＞A碱基突变形成弱D72型.
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1例部分D表型孕妇抗-D及基因型分析
目的：分析1例孕妇抗-D同种免疫反应及部分D表型和基因型。方法分别采用盐水法和微柱凝胶卡法检测RhDCcEe抗原，以及常规血清学试管法和凝胶卡法鉴定孕妇血清抗-D抗体及其效价，通过检测RHD基因的10个外显子、RHD基因合子型，以及测定D抗原12个表位鉴定部分D表型。结果该个体盐水法测定为dCcee，但微柱凝胶卡法检测为DCcee表型，RHD基因外显子检测缺失第3~6外显子，合子型测定为D/d，D抗原表位分析显示缺失大部分D表位，提示该个体为部分D表型DVI-III型，基因型为DVICe/dce；孕妇血清抗-D抗体第20周第1次检测为阳性，效价为1∶32，至生产前为1：64，产后确认为Rh（D）新生儿溶血病，生下一子为Rh阳性。结论部分D表型DVI-III型过往国内亦有报道发生抗-D同种免疫反应和新生儿溶血病，我国汉族DVI-III型多见，产前检查时须防漏检。
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RhD阴性患者的弱D、DEL的分布及RhCE表型分析
目的：研究RhD阴性患者的弱D、DEL的分布比例,并对RhCE的表型进行分析。方法：选取常规血清学方法初筛RhD阴性的标本,用抗人球蛋白试验检测弱D,阴性情况下应用吸收放散试验检测DEL。结果：在129例RhD阴性患者标本中经抗人球蛋白试验确认为弱D型者9例(6.9%),其表型分别为ccDuee型5例,CcDuee型3例,ccDuEe型1例。经吸收放散试验确认为Del者24例(18.6%),其表型分别为CcDELee型12例,CcDELEe型7例,CCDELee型2例,CCDELEe型3例。结论：在采集的初筛为RhD阴性的标本中,DEL阳性标本所占的比例高,应引起重视,其RhCE表型比例符合相关文献报道。故于常规血清学检测RhD阴性者,应当再用抗人球蛋白试验及吸收放散试验检测是否为弱D及DEL。
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Rh血型系统分子生物学研究
本文综述近年来Rh血型系统的抗原与其复合物的结构及功能的研究.从基因角度分析了弱D及不完全D型的形成原因及研究中的问题、Rh null和Rh mod型的基因结构,并简要分析了Rh抗体和Rh自身抗体.
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全自动微板法筛查献血者Rh血型D抗原的检测方法
目的建立全自动微板法快速检测献血者Rh(D)血型的方法.方法用试管法从已知阳性标本筛出±凝集效果标本8份、已知阴性标本4份作为试验标本,采用多因素水平正交试验确定凝集反应佳条件组合,尽量使弱凝集和阴性凝集外观表现明显区分开,将D抗原性较弱的标本尽可能以较强的凝集表现出来.结果采用此法筛查无偿献血者标本80 394人份,所得阴性标245份均进行经典试管法确证试验,与微板法的符合率为98.8%.结论全自动微板法可用于献血者Rh血型D抗原的检测.
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PCR-SSP RHD基因定型方法的初步应用
目的采用序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)进行RHD基因定型.方法采用新近报道的PCR-SSP RHD定型方法检测10例RhD阳性个体,包括2例哈萨克族人、2例蒙古族人、2例藏族人和4例维吾尔族人,以及11例RhD阴性个体(汉族10例、维吾尔族人1例),并通过测序和内含子检测分析1例汉族个体的RHD基因型.结果全部样品的PCR-SSP检测结果与血清学表型相符,1例汉族RhD阴性个体鉴定为D放散型,携带RHD1227A等位基因,1例个体的检测结果提示携带融合RHD基因.测序分析显示该融合基因的第1、2和第10外显子序列与正常RHD基因相应外显子相同,而缺失其余外显子,由于RHD基因和RHCE(e)基因的第2外显子序列相同,笔者采用PCR方法检测RHD基因第2内含子,结果为阴性,说明该个体携带的融合基因为RHD-CE(2-9)-D2等位基因.结论 PCR-SSP可用于中国人Rh血型D抗原基因定型.
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RHD1227A型弱D的D抗原表位分析
目的 分析携带RHD1227A等位基因的Rh血型弱D型个体的红细胞D抗原表位.方法 采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,并检测RHD杂合型.对确认的弱D型,使用12种抗-D抗原不同表位的单克隆抗体,分析红细胞D抗原表位.结果 血清学筛选和PCR-SSP检测鉴定出3例携带RHD1227A等位基因的弱D型样本,Rh小因子均为C+c+E-e+,RHD合子型鉴定均为RHD+/RHD-杂合型,提示3例个体基因型为CDe/cde.3例个体红细胞D抗原表位分析显示均具有基本完整D抗原表位,与 Rh(D)阳性对照样本相同.结论 发现3例RHD 1227A型弱D型；不管RHD1227A等位基因表达DEL型或弱D型,其D抗原表位近似,均表达基本完整D抗原,提示该等位基因不同量的表达可能与其它调节因素有关.
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抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原单克隆抗体的研制
目的应用杂交瘤技术制备抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原的单克隆抗体.方法用脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin 株D抗原免疫雌性Balb/c小鼠,取其致敏脾脏淋巴细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合.间接ELISA法筛选阳性克隆,制备腹水.检测McAb效价、抗体亚类和杂交瘤细胞核型.结果获得4 株阳性杂瘤细胞株,选择一株制备腹水,ELISA效价为1:2.4×106,中和试验效价1:1.3×104,蛋白浓度为 27.2 mg/mL.McAb与Ⅱ型Sabin株C抗原(ⅡC)、Ⅰ型Sabin株及Ⅲ型Phizer株D抗原(ⅠD、ⅢD)不发生交叉反应,具有高度特异性.结论成功的制备了针对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原的McAb,为进一步研究IPV效力检测奠定了基础.
关键词： 脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株 单克隆抗体 D抗原 -
Del红细胞膜表面D抗原表位及抗原强度分析
目的 分析Del红细胞膜表面D抗原表位并测定其抗原强度.方法 采用16种针对D抗原不同表位的单克隆抗体,通过吸收放散方法检测74例Del个体红细胞膜表面D抗原表位,应用流式细胞术检测其相对抗原强度.结果 74例Del个体D抗原1～9表位检测均为阳性.D阴性、Del及D阳性红细胞相对D抗原阳性率分别为(0.97±0.18)%、(3.06±0.31)%和(99.65±0.71)%,3种表型红细胞D抗原平均荧光强度分别为13.89±2.45,24.18±3.38,223.32±13.05.结论 Del红细胞膜表面D抗原表位表达基本完整,其D抗原强度极低,仅含有微量的抗原分子数目.
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1名RhD弱表现型个体携带Del等位基因
目的探讨1名RhD弱表现型个体的RH基因型及RHD基因的分子机制.方法采用常规血清学方法检测Rh D、C、c、E和e抗原表型,间接抗球蛋白试验确认D抗原,用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD/RHCE基因,然后分析RHD编码区全长序列,并用PCR检测RhD杂合型.结果血清学结果显示该个例为D抗原弱表现型,Rh因子为D+C+c+E-e+,PCR-SSP检测RHD/RHCE基因与之相符;RHD编码区序列析发现第9外显子存在1227G→A碱基突变,其余外显子序列则与正常RHD基因一致,表明该个体携带RHD 1227A等位基因.RhD合子型鉴定结果为RHD+/RHD-杂合型,拟定RHCE和RHD为cis遗传,提示该个体基因型为CDe/cde.结论该RhD弱表现型个体携带RHD 1227A等位基因,而这一等位基因是Del表型的主要等位基因,提示该等位基因在不同个体RhD分子的表达效率不同.
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孕妇高效价抗-D遮断D抗原致新生儿Rh定型假阴性1例
临床上因Rh系统不合引起的新生儿溶血病(HDN)并不少见,但因孕妇高效价IgG抗-D封闭新生儿红细胞上的D抗原引起遮断现象,致患儿Rh定型出现假阴性的报道甚少,笔者遇到1例,现报道如下.
