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中国人群中发现的主要弱D型——弱D15个体的分子背景研究
为了探讨中国汉族人群弱D15型个体的Rh血型系统血型血清学表型及分子背景,采用常规血型血清学技术检测RhD抗原弱阳性个体Rh D、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因;标本测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目.结果表明,血型血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的人群中,有18例为弱D15型(占D抗原弱阳性表型56%),RHD基因全长编码区序列分析发现其第6外显子有一处碱基突变:845G＞A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;检测Rh小因子有3种表型CcEe(2例)、CcEe(2例)、ccEe(14例),分别占弱D15型的11%、11%、78%,血清学检测结果与分子生物学检测结果一致.RHD杂合性试验鉴定显示仅表型为CcEe的2例标本为纯合型RHD+/RHD+,提示基因型为DCe/DcE;其余为杂合型RHD+/RHD-,提示基因型分别是DCe/dce和DcE/dce.结论:弱D15型是中国人群中主要的弱D型,其中大部分为杂合型.
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一例弱D血型表型及基因型鉴定分析
目的:分析中国汉族人群中发现的一例弱D血型表型及基因型.方法:分别采用盐水法及微柱凝集(玻璃珠/凝胶)卡对该弱D血型进行血清学分析,鉴定该标本12种D抗原表位以确定其表型,对RhD基因10个外显子及其侧翼序列进行测序并分析其杂合性.结果:该个体盐水法与微柱凝胶卡法检测均为dCcee,但微柱玻璃珠卡法抗-D检测结果为1+,D抗原表位分析显示缺失部分D表位.测序检测发现,该标本存在等位基因c.1022T＞A,结合其血清学反应格局更符合部分D表型,RHD合予型鉴定为D/d.结论:中国汉族人群中发现的一例弱D血型归为弱部分D型更为恰当.
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PCR技术检测弱D15型
目的探讨采用DNA技术鉴定弱D15型.方法根据文献和GenBank报道的基因序列,针对弱D15型基因,设计一对特异性引物,并引入一对内对照引物,建立简易的聚合酶链式反应(PCR)技术检测弱D15型,之后用于检测10份Rh阴性、10份Rh阳性、10份Del样品和1例弱D15型DNA样品.结果除1例弱D15型样品检测为阳性外,其余均为阴性,显示PCR特异性检测弱D15型基因.结论PCR方法简便、快速,能准确鉴定弱D15型,可用于临床常规实验室.
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RhD初筛阴性患者RhD变异体检测分析
目的 对本地区RhD初筛阴性患者进行RhD变异体检测分析.方法 随机收集直接抗人球蛋白试验的RhD初筛阴性标本63例,按其血浆中是否含有抗D分成抗体阳性组和抗体阴性组,然后采用三批抗D-微柱凝胶抗人球蛋白法进行弱D确认试验和Del鉴定试验.结果 抗体阴性组的弱D确认试验阳性率为3.3％(2/60),其中弱D型占1.7％(1/60),部分D型占1.7％(1/60);抗体阳性组的弱D确认试验阳性率为0(0/3),未发现弱D型与部分D型.抗体阴性组Del鉴定总阳性率为95.0％ (57/60),其中三批抗D试剂的阳性率分别为88.3％(53/60)、91.7％(55/60)和68.3％(41/60),批间差异有统计学意义(P＜0.01);抗体阳性组Del鉴定总阳性率为100％(3/3),其中三批抗D试剂的阳性率分别为66.7％(2/3)、100.0％(3/3)、33.3％(1/3).结论 本地区部分RhD初筛阴性患者实际为弱D型或部分D型,临床有必要对RhD初筛阴性患者进行弱D确认;绝大多数RhD初筛阴性患者实际属于Del型,但不同来源的单克隆试剂对Del的检出情况差异较大;三批抗D试验均阳性的Del患者仍有可能产生免疫性抗D可能,临床患者似无进行Del型鉴定的必要.
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1例新的弱D型的鉴定
目的 分析1例新的Rh血型弱D型个体的RHD等位基因及其红细胞D抗原表位.方法 采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,并分析D抗原表位;序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,然后分析RHD编码区全长序列,并检测RHD杂合型.结果 血清学显示该个例为D抗原弱表现型,Rh因子为D+C+c+E-e+,PCR-SSP检测RHD基因显示与正常Rh(D)阳性对照相同.RHD编码区序列分析发现第9外显子存在1 212 C＞A碱基突变,其余外显子序列则与正常RHD基因一致(GenBank EF103573),RHD合子型鉴定为RHD+/RHD-杂合型,提示该个体基因型为CDe/cde.红细胞D抗原表位分析显示其具有基本完整D抗原表位.结论 该个例为RHD 1 212 C＞A碱基突变形成弱D72型.
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东莞市无偿献血者ABO亚型和弱D型分布调查
目的:分析无偿献血者ABO亚型和弱D型的分布特点.方法:对2009-01-01—2012-12-31在我市参加无偿献血的197 146名献血者血样进行ABO、RhD血型鉴定,若ABO正反定型不一致及有弱凝集等反应特点的样本进行确认试验,鉴定为ABO亚型者确定亚型分型;对RhD阴性及有弱凝集反应者进行弱D型确认试验.结果:在197 146名献血者中共检出ABO亚型30例,其中A亚型5例,B亚型12例,AB亚型7例,类孟买型6例;除A2、A2B和类孟买型外,ABO亚型的检出率为0.011％;共检出弱D型28例,检出率为0.014％.结论:我市无偿献血者中ABO亚型频率偏低,B亚型明显多于A亚型;弱D型频率明显低于国外报道,与国内报道相似.
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洛阳地区无偿献血者Rh血型临床相关高频抗原分布调查
目的:准确估计洛阳地区Rh血型系统Rh表型频率和估算Rh单倍型频率.方法:回顾性统计356 041例献血者的RhD检测数据,采用血清学检测10 373例RhD阳性献血者的CcEe抗原,Rh基因频率和单倍型频率的计算采用方根法[1].结果:洛阳地区献血者中RhD阳性率为99.54％,其中弱D检出率约为0.02％；阴性率为0.46％,其中Del检出率约为0.03％.Rh抗原基因和单倍型频率为:D:0.932 4,d:0.0676,DCe:0.615 4,DcE:0.2704,dce:0.051 5,Dce:0.034 3,dCe:0.0122,DCE:0.013 2,dcE:0.002 3,DCE:0.000 6.弱D以表型Dc-cEe、DCcee为主,Del型以表型DccEe、DCCee为主,RhD阴性献血者表型以dccee、dCcee为主.结论:精确地估算出了献血者中RhD抗原阴性分布频率,并准确计算出RhDCcEe抗原的基因频率和Rh单倍型频率,对一些稀有的Rh弱D型,Del型其D抗原弱表达与C、E抗原有关联.需要制定标准的弱D定型方法和合理的输血策略,来减少抗球蛋白试验对弱D抗原的漏检.
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RHD1227A型弱D的D抗原表位分析
目的 分析携带RHD1227A等位基因的Rh血型弱D型个体的红细胞D抗原表位.方法 采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,并检测RHD杂合型.对确认的弱D型,使用12种抗-D抗原不同表位的单克隆抗体,分析红细胞D抗原表位.结果 血清学筛选和PCR-SSP检测鉴定出3例携带RHD1227A等位基因的弱D型样本,Rh小因子均为C+c+E-e+,RHD合子型鉴定均为RHD+/RHD-杂合型,提示3例个体基因型为CDe/cde.3例个体红细胞D抗原表位分析显示均具有基本完整D抗原表位,与 Rh(D)阳性对照样本相同.结论 发现3例RHD 1227A型弱D型；不管RHD1227A等位基因表达DEL型或弱D型,其D抗原表位近似,均表达基本完整D抗原,提示该等位基因不同量的表达可能与其它调节因素有关.
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四例Rh弱D变异体的分子遗传学分析
目的：分析4例 Rh 血型弱 D 型变异体的分子机制。方法采用血清学方法检测 RhD、C、c、E、e 抗原表型,通过间接抗人球蛋白实验确认样本 RhD 血型表型；采用序列特异性引物聚合酶链反应检测RHD 基因合子型,并对 RHD 基因的全部10个外显子及其邻近内含子序列测序分析。结果4例样本RhD 血清学检测均为弱阳性。RHD 基因外显子测序结果显示1号样本第1外显子第17位碱基 C>T 变异,2号样本第1外显子第29位碱基 G>C 变异,3号样本第9外显子第1212位碱基 C>A 变异,4号样本第4内含子处存在 IVS4+5G> A 变异。RHD 单体型分析发现4例样本均为杂合 RHD 基因型。根据Rhesus Base 的命名规则,4例标本分别为弱 D31型、弱 D71型、弱 D72型及弱 D82型。结论开展 Rh 弱D 的血清学及分子生物学检测,将有助于深入了解其免疫学及遗传学特点,为制定正确的临床输血策略以及预防新生儿溶血病提供依据。
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用PCR-SSP技术检测弱D型RHD基因1例
RhD抗原(ISBT004.001；RH1)是一种由RhD蛋白携带的非常重要的血型抗原，是引起新生儿溶血病的主要原因［1］。极少数人红细胞的D抗原表达数目减少，被称之为弱D(以前叫作DＵ)，在白种人中的比例为0.2%～1%，在黄种人中的比例则更低。一部分弱D被解释为RhD蛋白的质的变化，称之为部分D，通常是由RHD／RHCE杂化基因引起，另一部分弱D是由Cde单倍体反式位置的抑制作用引起，这些弱D可能有正常的RHD基因，其RhD抗原表达只是微量减少，被宽松地称之为高级DＵ，现在常被定为正常的RhD。近笔者发现1名供血者红细胞为弱D型，且实验结果显示弱D型具有独特的基因结构，现报告如下。1 对象与方法1.1 研究对象献血者，男，21岁，汉族，在校学生，来本中心献血时被确定为弱D；阴阳性对照血样亦均取自本中心献血者，民族为汉族。1.2 序列特异性引物针对RHD和RHCE基因之间具差异的区段设计多对不同引物，特异性地扩增RHD基因的第2～7，9，10外显子和RHCE基因的第1，2，4，5外显子，以及RHD和RHCE基因的第4内含子(表1)。另以人类生长激素(HGH)基因序列特异性引物作为内对照引物，扩增片段为429bp(以上引物均由美国G&T公司合成、纯化及鉴定)。1.3 基因组DNA的制备使用美国G&T公司基因组DNA抽提试剂盒，采用盐析法从供血者外周血分离获得。0.3ml EDTA抗凝外周血加入1 ml红细胞裂解液，离心弃上清，沉淀加入170μl核裂解液及4μl SDS，剧烈振荡，再加入72μl NaCl溶液，10000r/min离心5min，取上清加入210μl异丙醇沉淀DNA，将DNA溶于100μl TE溶液中，保存待用。1.4 特异性PCR扩增反应体系11μl,含1μl DNA,8μl引物混合物，1U Taq酶。扩增条件为95℃预变性5min，95℃变性30s,60℃退火30℃s，72℃延伸90s,30循环。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间为25min。
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华北地区汉族人群Rh(D)抗原弱表现型个体的分子遗传机制研究
目的 探讨汉族人群非血缘关系Rh(D)抗原弱阳性个体的血清学表型及分子遗传机制.方法 采用常规血清学技术从非血缘关系随机献血者中筛检Rh(D)抗原弱阳性个体(包括弱D型、部分D型),对其进行Rh D、C、c、E、e抗原表型的检测;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法同时检测其RHD基因和RHCE基因;测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定其RHD合子型.结果 血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的有32例个体,占无关供者人群比率为0.015%, 其中18例个体为弱D15 型(845G＞A),1例为弱D12型(830G＞A), 1例为携带DEL等位基因(1227G＞A)的弱D型, 8例为部分D表型中的DⅥ Ⅲ型(RHD-CE(3-6)-D), 1例为部分D表型中的DⅤa(Hus) (RHD-CE(5)-D), 3例标本10个外显子检测均未见异常.Rh小因子检测有3种表型CcEe(4例)、Ccee( 10例)、ccEe(18例),其血清学与分子生物学检测一致.RHD杂合性试验鉴定显示仅4例标本为纯合型RHD+/RHD+,其余为杂合型RHD+/RHD-.结论 汉族人群D抗原弱阳性比率明显少于高加索人,汉族人群D弱表现型中,弱D15型频率高;部分D的弱表现型中,DⅥ Ⅲ型占主要比例.
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在中国人群中首次发现1例Rh血型弱D12型
目的分析鉴定1名RhD抗原弱阳性个体的血型血清学表型及分子背景.方法采用常规血型血清学技术检测Rh D、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因,并测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目.结果血型血清学试验证实该标本为D抗原弱阳性表型,与相应Rh抗血清反应为C-c+E+e+;SSP-PCR检测显示RhCcEe基因定型结果与血型血清学完全一致,且有完整的RHD基因; 但RHD基因全长编码区序列分析发现该标本的RHD第6外显子存在1处碱基突变:830G>A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;RHD杂合性试验鉴定显示为RHD+/RHD-杂合型,推测该个体基因型可能为DcE/dce.结论对照国内外文献报道和GenBank记录的基因序列,该个例为在中国人群中首次发现的弱D12 型.
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弱D型妊娠致抗-D引起的新生儿溶血病救治成功1例
1 病例报告孕妇,32岁,汉族,血型鉴定为弱D型,无输血史.婚后曾妊娠8次,第一胎女婴足月顺产,现9岁健在;以后2次流产,4次早产,早产儿均在生后数天因皮肤黄染死亡,死因未明.此次妊娠,于临产前1个月到河北省儿童医院妇产科待产.血清学检查孕妇为AB,CcDUe ,抗-D效价为256.于2001年6月21日上午10时30分自然分娩一女婴,体重3300g.新生儿呈贫血貌,3h后出现黄疸,伴全身水肿,Hb123g/L,总胆红素279.6μmol/L,间接胆红素212.1μmol/L,且胆红素水平上升很快,每小时达到10.85μmol/L,DAT强阳性,经血清学检查证实是抗-D所致的新生儿溶血病,符合换血指征.于当日下午4时为新生儿换取去除白细胞的O型Rh(D)阴性(Ccde)浓缩红细胞2U,AB型血浆200ml,换血总量达180ml/kg.换血后患儿DAT转为弱阳性,Hb升至142g/L,胆红素降至131μmol/L.此后,胆红素反复增高,提示未能换尽患儿体内致敏RBC和抗-D,于是又分两次输入去除白细胞的A型Rh(D)阴性全血200ml.经临床综合治疗,9天后新生儿Hb升至190g/L,总胆红素降至23.1μmol/L,痊愈出院,42天回访,健康状况良好.
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贵阳市无偿献血人群RhD变异体的基因型分析
目的 研究分析PhD抗原变异体的血清学表型和基因型.方法 收集贵阳市159名无偿献血者RhD盐水法初筛阴性的标本,采用间接抗球蛋白试验(IAT)筛出部分D型和弱D型抗原,用乙醚吸收放散试验检出De(l)型抗原,并对Rh表型(C、c、E、e抗原)进行血清学检测.同时运用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)对RhD变异型D抗原外显子进行扩增和选择性测序以判定其确切型别.结果 159例RhD初筛阴性标本中检出RhD变异型53例(33.3％),包括Del 1227G＞A、3G＞A 46例(28.9％)、部分D DVI typeⅢ RHD-CE(3-6)-D 3例、弱D15 845 G＞A3例、弱D24 1013T＞C 1例.Rh表型结果显示,ccee 65例、Ccee 79例、CCee 11例、ccEe和CcEe各2例.结论 贵阳市无偿献血人群中RhD变异体的基因型呈现多态性,其中主要为Del型.
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献血者弱D型8例
笔者2000年1月～2005年2月对本中心247273名献血者进行了Rh阴性筛选及确认,报告如下.1 材料与方法1.1 试剂单克隆抗-D(IgM、 IgG、 IgM+IgG类)、抗-C、-c、-E、-e血清、筛选细胞、抗球蛋白试剂、酶试剂(上海输血技术有限公司),聚凝胺(台湾BaSo公司),进口单克隆抗-D(IgM+IgG类)血清(美国Immuncor公司、加拿大 Dominion公司及荷兰 Sanquin公司).
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弱D15型D抗原同种免疫的分析研究
目的 对弱D15型标本产生抗-D的原因进行探讨.方法 对产生抗-D的Rh阴性标本鉴定其RHD合子型,对发现的弱D15型进行RHD基因10个外显子的测序；应用11种单克隆抗体通过流式细胞术进行弱D15型标本D抗原表位测定.结果 2例弱D15型标本,合子型显示为弱D15/d杂合,基因测序显示除了第6外显子存在845位碱基G＞A的突变外,未发现其它突变；对其红细胞的D抗原表位分析显示存在抗原表位缺失.结论 弱D15型存在抗原表位缺失,对D抗原会发生同种免疫,提示RhD抗原性的改变可能与空间结构改变有关.
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1252T＞G致新的弱D型血清学和分子生物学研究
目的 分析研究1例新的弱D型个体的血清学和分子生物学特点.方法 采用盐水法鉴定RhD/C/c/E/e抗原,并采用间接抗球蛋白法(IAT)进一步鉴定RhD抗原,采用盐水法和抗人球蛋白法进行抗体筛查;采用商用基因检测试剂盒对标本进行CDE基因检测;对其RHD基因10个外显子序列进行测序分析比对.结果 血清学检测显示该标本为D变异型,RHCE血型为C+c+E-e+,抗体筛查为阴性.CDE基因试剂盒检测为DCcee,RHD外显子序列测序分析发现第10外显子存在1 252 T＞G碱基突变,其余外显子序列则与正常RHD基因一致.结论 该标本存在RHD1 252 T＞G碱基突变,为新的弱D型.
