伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库构建

目的构建伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库.方法提取伯氏疟原虫K173株(NS)与青蒿素抗性株(AR)的总RNA,super SMART法合成双链cDNA,分别以NS为消减方(driver),AR为试验方(tester)及AR为driver,AS为tester进行双向抑制性消减PCR(SSH PCR).富集的差异表达cDNA克隆到pMD18-T载体构建消减文库.结果NS-AR和AR-NS消减文库分别获得395个和506个阳性克隆,从NS-AR和AR-NS文库中随机挑取108个克隆PCR鉴定,分别有100个和104个含插入片段,大小在0.25～2 kb之间.结论成功构建了伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库.

蒿甲醚与瑞香素伍用对感染伯氏疟原虫小鼠的治疗作用

目的研究蒿甲醚与瑞香素伍用(A+D)对感染伯氏疟原虫ANKA株小鼠的疗效及其联合作用方式.方法按"四天抑制法"d0感染,d0～d3给药,每天1次,d4涂薄血膜检查,并计算d4减虫率及各药丰数有效置(ED50),用等效应图解法分析A+D的合并作用.结果蒿甲醚0.4 mg/(kg·d)×4 d的d4减虫率与对照组相比差异无显著性;[A 0.4 mg/(kg·d)+D7.7 mg/(kg·d)]×4d的抗疟效果提高,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05).A+D各组的ED50均低于单用药组;不同配伍比例的R值皆大于0.4,小于2.7(0.4＜R＜2.7).结论蒿甲醚与瑞香素伍用治疗感染伯氏疟原虫小鼠能提高抗疟疗效,且两药合并呈相加作用.

伯氏疟原虫青蒿素抗性系的培育研究

目的培育伯氏疟原虫青蒿素抗性系.方法与结果采用伯氏疟原虫接种传代和青蒿素剂量递增法分3条路线进行培育:A线,青蒿素起始剂量为126.2 mg/kg(相当于1/2 ED50),递增剂量为60 mg/k,每隔2代改为1 26.2 mg/kg加强1次.第14、30、44及第60代抗性指数(I 50)逐渐上升,分别为4.01、10.11、16.02及18.93;至第76代,抗性减弱,I50为14.89;至第108代,剂量达8 862.5 mg/kg,I.仅为10.49.B线,是从A线第66代转种而来,此后每周给药1次,剂量为4 000 mg/kg,至第40代I50为27.45,抗药性明显增强.C线,是从B线第1 9代转种而来,此后每周给药1次,剂量为2 000 mg/kg,至第15代,I50为1 7.41.结论已培育出具有中度抗药性的伯氏疟原虫青蒿素抗性系.

伯氏疟原虫氯喹抗性株感染小鼠的氯喹代谢动力学研究

[目的]比较氯喹在正常小鼠、感染伯氏疟原虫药物敏感(N)株和氯喹抗药性(RC)株小鼠体内的药物动力学差异.[方法]应用反相高效液相色谱法分别测定正常小鼠、感染伯氏疟原虫N株和RC株小鼠血浆中的氯喹浓度,采用3P87药物动力学分析软件对数据进行分析,从而获得有关药物动力学参数.[结果]感染RC鼠的t1/2β与其他两组间有显著的统计学差异(P＜0.05),而感染N株鼠与正常鼠间无显著差异.[结论]氯喹在感染了伯氏疟原虫RC株鼠体内的消除速度显著快于正常鼠及感染N株鼠.

巴西日圆线虫诱导小鼠T辅助细胞的变化对伯氏疟原虫感染的影响

[目的]观察预感染巴西日圆线虫后,小鼠抵御伯氏疟原虫攻击感染的能力,并着重探讨T辅助细胞亚型在感染过程中的变化以及这些变化对宿主免疫力和预后的影响.[方法]皮下注射巴西日圆线虫感染C57BL/6小鼠,建立线虫预感染模型,于3 wk后腹腔注射伯氏疟原虫ANKA株攻击感染小鼠.观察每天原虫血症变化情况,并于疟原虫感染后0、3和9 d取脾,提取RNA,用RT-PCR扩增法定性观察细胞因子IFN-γ和IL-4的变化.[结果]与对照组相比,实验组感染疟原虫后,原虫血症的峰值出现时间明显延长,小鼠对疟原虫感染的耐受程度以及小鼠生存时间显著提高.实验组Th2型细胞合成IL-4的量在疟原虫感染0 d时明显高于对照组;而在3与9 d时两组均异常升高.Th1型细胞合成IFN-γ均量在疟原虫感染后3 d时实验组高于对照组,但在9 d时实验组IFN-γ有所下降.[结论]预感染巴西日圆线虫的小鼠具有较高的抗感染能力.但在攻击感染疟原虫后Th2型细胞被提前激活而抑制了Th1型细胞的正常功能,终仍导致小鼠死亡.

瑞香素杀疟原虫裂殖体的作用

[目的]研究中药瑞香素在体外和体内的杀裂殖体作用.[方法]在恶性疟原虫FCCl株常规体外培养中测试瑞香素杀裂殖体活性,并按"四天抑制性试验”在感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠中测定不同剂量瑞香素的体内抗疟活性.[结果]体外试验中瑞香素在1～10 μmol/L剂量范围内有明显杀灭裂殖体作用,而体内试验中按D4减虫率与感染鼠在30d内的平均生存天数评价,50或100mg/kg.d-1×4 d瑞香素灌胃以及10,50或100mg/kg.d-1×4 d瑞香素腹腔注射给药在伯氏鼠疟原虫ANKA株感染鼠中的抗疟作用与10 mg/kg.d-1×4 d氯喹(CQ)灌胃的疗效相似.[结论]瑞香素在体外和体内均有一定的杀裂殖体作用.

TNF-α和ICAM-1在脑型疟发病中的作用

[目的]研究粘附分子TNF-α、ICAM-1与脑型疟(cerebral malaria,CM)的关系,并通过体内注射外源性TNF-α来观察ICAM-1的表达情况及其对CM发生的影响.[方法]通过建立CM小鼠模型,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测感染小鼠血清TNF-α浓度.免疫组织化学SP法检测感染小鼠脑微血管的ICAM-1表达,结果用真彩色图象分析仪半定量分析.[结果]发生CM小鼠的血清TNF-α明显高于其它小鼠,只有发生CM的小鼠脑微血管有ICAM-1表达,体内注射rTNF-α能促进CM的发生,并显著增加脑微血管的ICAM-1的表达.[结论]大量的TNF-α在CM的发病中可能有直接致病作用,但主要可能通过调节脑微血管的ICAM-1表达发挥作用.

广藿香挥发油对青蒿酯钠抗伯氏疟原虫的增效作用和对抗青蒿酯钠伯氏疟原虫的逆转抗性作用

[目的]研究广藿香挥发油(B)与青蒿酯钠(SA)联合用药对伯氏疟原虫(P.b)正常株(N)及抗青蒿酯钠株(R)的抗疟增效作用和对R的逆转抗性作用.[方法]采用4天抑制试验法对分别感染N和R小鼠进行抗疟实验,以两药等效剂量配伍,用直线回归法计算其抑制原虫50%的药物剂量(SD50).[结果]B单独用药,N:SD50=87.64±19.58(GKD),R:SD50=43.24±7.71(GKD);SA单独用药,N:SD50=0.88±0.01(MGKD),R:SD50=27.69±0.93(MGKD).B与SA联合用药,N:B的SD50=36.89±4.57(GKD),SA的SD50=0.39±0.05(MGKD);R的SD50=7.40±1.30(GKD),SA的SD50=4.21±0.74(MGKD).联合用药B对SA的增效指数,N、R分别为2.2和6.6,B对R的逆转抗性倍数为6.6.相对逆转率为87.6%.[结论]采用B和SA联合用药对P.b的抑制作用具有增效作用,能逆转R对SA的抗性及延缓N对SA抗性的发生.

流式细胞术在感染鼠疟原虫活红细胞检测中的应用

采集感染伯氏疟原虫的ICR小鼠外周血,未经固定的红细胞用Vybrant DyeCycle Green染料和抗小鼠CD71 PE荧光抗体进行双染色(实验组).以健康小鼠外周血作阴性对照.分别在染色后0、30和60 min利用流式细胞仪进行检测,比较各次结果的一致性.结果显示,阴性对照(健康小鼠血样)与空白对照(感染疟原虫鼠血未作染色)未检出感染红细胞的疟原虫,实验组可检出感染红细胞的疟原虫.组内相关系数(ICC)检验结果显示,3个时间点检测结果的一致性较好(ICC=0.999,P＜0.01).表明未经固定的红细胞用Vybrant DyeCycle Green染料和抗小鼠CD71 PE荧光抗体染色经流式细胞术检测可区分感染疟原虫红细胞.采集的红细胞在一定时间内未作固定对检测结果无明显影响.

伯氏疟原虫pbmag-1基因片段克隆及原核表达优化

目的 克隆并表达伯氏疟原虫pbmag-1基因cDNA片段.方法 在GenBank中检索伯氏疟原虫编码基因pbmag-1部分cDNA序列,设计特异引物,经RT-PCR从伯氏疟原虫ANKA株扩增出该基因的部分cDNA片段.以锚定Oligo dT引物反转录mRNA获得的cDNA为模板,利用已知序列设计特异引物,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术延伸pbmag-1 3'端未知的编码序列,并将其克隆于原核表达载体后转入大肠埃希菌(E.coli)BL21-(DE3)-RIL株,经优化诱导条件,表达了重组蛋白PbMAg-1并用其免疫小鼠.结果 获得1 341 bp具有完整3'末端序列的pbmag-1基因片段,其A/T含量为73%.以包涵体形式表达的重组蛋白免疫小鼠,其血清抗体经蛋白质印迹(Western blotting)分析,能特异性地识别伯氏疟原虫感染红细胞相对分子质量约为Mr64 000的蛋白.结论 获得重组蛋白PbMAg-1的3'端完整的pbmag-1基因cDNA片段,为研究伯氏疟原虫PbMAg-1蛋白在鼠疟免疫反应中的作用奠定了实验基础.

伯氏疟原虫氯喹抗性株和敏感株基因组DNA比较研究

目的比较伯氏疟原虫敏感株(N株)和抗性株(RC株)基因组DNA差异.方法应用基因组DNA随机多态性扩增(RAPD)和锚定引物扩增DNA(APAD),分别对抽提的伯氏疟原虫N株和RC株基因组DNA进行PCR扩增,并对扩增的产物进行电泳,对结果进行统计分析.结果37条随机引物RAPD方法扩增出440条DNA条带,其中RC株和N株的共有条带是196条,差异带43条.84条锚定多聚A引物APAD方法扩增出952条DNA条带,其中RC株和N株的共有条带是436条,差异带53条.两种方法得到N株和RC株基因组DNA的同源性分别为0.89和0.9l;距离系数分别为0.197和0.155.结论伯氏疟原虫N株和RC株基因组DNA具有高度同源性.

伯氏疟原虫RC株和N株感染小鼠IFN-γ mRNA的表达及其对致病的影响

目的:探讨伯氏疟原虫RC株和N株感染小鼠IFN-γ mRNA 的表达及其对疟疾致病的影响.方法:应用RT-PCR技术,比较伯氏疟原虫RC株和N株感染后ICR小鼠脑、肝、脾组织IFN-γ mRNA 表达的差异,并探讨其与原虫血症、体温和体质量等病理学参数之间的关系.结果:N株感染小鼠后第10天,平均原虫血症达到(64.00±7.51)%,平均体质量降至(97.60±4.59)%,平均体温降至(27.87±2.95)℃,感染小鼠开始死亡;第12天小鼠全部死亡.RC株感染小鼠后第24天,平均原虫率达(61.10±6.56)%;第26天平均体质量和平均体温降至低点;随后原虫率逐渐下降,第30 天体质量和体温开始回升;感染后第36天,绝大多数感染鼠外周血涂片不能检出疟原虫,平均体质量和平均体温恢复正常;感染RC株小鼠的病死率仅为25%.感染N株小鼠在感染前期,肝、脾组织IFN-γ mRNA 的转录明显增强,但持续时间较短;感染RC株小鼠在感染期间,肝和脾脏一直有IFN-γ mRNA 转录,直到原虫被清除,小鼠完全康复.整个实验期间,正常对照小鼠肝和脾脏均未检测到IFN-γ mRNA .结论:由N株和RC株疟原虫感染诱导小鼠肝、脾IFN-γ mRNA 的表达可能具有不同的机制;RC株疟原虫感染可诱导小鼠肝﹑脾持续表达IFN-γ mRNA ,对减轻疟原虫感染所造成的损害和感染鼠的康复有重要意义.

伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株虫体食物泡和疟色素形态及形成的比较

目的:了解伯氏疟原虫氯喹敏感株(N)和抗性株(RC)红内期虫体在抗药性、致病力和诱导免疫应答方面差异的形态学基础.方法:应用超薄切片和透射电镜技术,比较N株和RC株虫体食物泡和疟色素形态及形成的差异.结果:N株滋养体具有单一的、大型的食物泡,疟色素位于滋养体周边的质膜下;在裂体生殖中,疟色素发生聚合和中心化.RC株滋养体食物泡少见,其中多数虫体形成多个微型单层膜的食物泡样结构;疟色素形成明显少于N株滋养体;而且在裂体生殖中,未见疟色素聚合和中心化.结论:伯氏疟原虫RC株长期在氯喹压力下,形成了微型食物泡样结构的摄食方式,具有与N株疟原虫不同的对游离血红素的解毒机制, 这可能是伯氏疟原虫N株和RC株在抗药性、致病力和诱导宿主免疫应答方面差异的基础.

伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株感染的免疫差异

转基因伯氏疟原虫的建立及报告基因表达的初步研究

目的:通过转染含有绿色荧光蛋白(GFP)和PbfMSP1片段的重组质粒,建立伯氏疟原虫转染技术和表达恶性疟原虫MSP-1 19 000片段(PfMSP1-19)的转基因伯氏疟原虫.方法:构建重组转染质粒PyrFlu/PbfMSP1.伯氏疟原虫ANKA株经培养和分离后用电转化方法转入重组转染质粒,药物筛选转化原虫后进行PCR检测,并于荧光显微镜下检测报告基因GFP的表达.结果:构建了重组转染质粒PyrFlu/PbfMSP1.荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的伯氏疟原虫.PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在GFP和PbfMSP1基因.结论:重组质粒已成功转染伯氏疟原虫并表达了GFP报告基因,建立了伯氏疟原虫转染技术.

IL-12对伯氏疟原虫红内期感染小鼠Th1/Th2细胞因子表达水平的影响

目的观察白细胞介素12 (IL-12) 对伯氏疟原虫(P.b)红内期感染小鼠Th1/Th2细胞因子表达水平的影响,探讨IL-12介导Th1/Th2免疫偏移在抗P.b红内期感染中的免疫调节作用.方法 BALB/c小鼠接种5×105个感染P.b的红细胞,同时分别给予0.03 μg/d或0.15 μg/d IL-12处理,用ELISA方法检测P.b感染小鼠血清或脾淋巴细胞体外培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-4表达水平的动态变化.结果 0.03 μg/d IL-12处理组小鼠接种感染后第7天取脾淋巴细胞体外经PHA或可溶性抗原sAg刺激培养产生的IFN-γ水平较感染对照组显著升高,IL-4水平显著下降,而0.15 μg/d IL-12处理组脾淋巴细胞产生的IFN-γ及IL-4水平均较感染对照组显著下降.在感染后第3天,0.03 μg/d或0.15 μg/d IL-12处理组小鼠血清中IFN-γ均已出现,第5天达高峰,但感染后第7天 0.15 μg/d IL-12处理组血清中IFN-γ迅速下降,甚至低于感染对照组及0.03 μg/d IL-12处理组,感染对照组直到感染后第7天血清中方可检测到IFN-γ水平.结论适当低剂量IL-12诱导CD4+Th1免疫应答,产生细胞因子IFN-γ,以诱导抗P.b红内期感染的免疫保护作用;而较大剂量IL-12抑制机体抗感染免疫,甚至可致免疫病理损害.

一种简便高效制备伯氏疟原虫蛋白的实验方法

目的:探讨建立简便有效的大量制备鼠伯氏疟原虫蛋白的方法.方法:采集伯氏疟原虫感染晚期的大鼠外周血经肝素抗凝,通过白细胞滤器过滤去除白细胞,再使用30%阿拉伯胶溶液经密度梯度离心法分离含虫红细胞,经皂素溶血,收集纯化的原虫,虫体经超声波破碎后离心,上清液经SDS-PAGE电泳分析.采用蛋白凝胶灰度扫描方法分析蛋白电泳条带的分布.结果:从大鼠含虫外周血可分离制备出大量的可溶性疟原虫蛋白,对大鼠分离的疟原虫可溶性蛋白与小鼠来源的原虫可溶性蛋白比较,两种蛋白的电泳图谱完全相同.结论:利用大鼠模型可简便高效地制备大鼠伯氏疟原虫,结合超声波破碎法可提取足量的可溶性疟原虫蛋白抗原.

白细胞介素12在伯氏疟原虫红细胞内期感染中的免疫调节作用

[目的]探讨白细胞介素12(IL-12)在伯氏疟原虫(P.berghei)红细胞内期感染中的免疫调节作用.[方法]BALB/c小鼠接种5×105个感染P.berghei的RBC,分别以不同剂量(0.01、0.03、0.10和0.15μg/d)IL-12,或分别在不同给药时间(感染前1 d、感染同时、感染后第3 d)给予0.03μg/d IL-12,各组均连续用药6 d.观察各组小鼠原虫血症变化及存活时间.[结果]与对照组比较,较低剂量(0.01或0.03 μg/d)IL-12均可显著推迟血中原虫的出现及原虫血症达峰值的时间,但仅0.03μg/d剂量可明显提高生存率;较高剂量(0.1或0.15μg/d)IL-12则增加原虫密度,加速小鼠死亡.在感染的第3 d给予0.03μg/d IL-12,对原虫血症、生存率均无明显影响.IL-12不能改变感染的结局,终各组小鼠均死亡.[结论]IL-12具有免疫保护和毒副反应双重活性.诱导保护作用而减少毒副作用,剂量及给药时间是关键,适时地给予适当剂量的IL-12可诱导抗红内期疟原虫的部分保护作用.

伯氏疟原虫再感染过程中树突状细胞表面分子表达水平的实验观察

目的 探讨疟疾感染早期根治性治疗对再感染过程中树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟和功能的影响.方法 用伯氏疟原虫(Plasmodium berghei ANKA,PbA)感染DBA/2小鼠,感染后3d进行根治性治疗,并于初次感染后90d进行再感染.通过吉姆萨薄血膜染色法计数红细胞感染率,流式细胞术检测再感染前(0d)和再感染后(1d、3d、5d)不同时间点脾细胞中表达CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ分子的DCs以及活化性T细胞的百分含量.结果 同种疟原虫再感染后,根治性治疗小鼠仅出现短暂的低水平虫体血症;表达CD80、CD86、CD40和MHC-II分子的DCs百分率均于再感染后第3d出现了有意义的升高;再感染后第1～5d活化性T细胞百分率持续升高.结论 初次感染早期根治性治疗后,同种疟原虫再攻击可诱导DCs的成熟和功能的发挥.

斯氏按蚊配子体激活因子活性变化与产卵的关系

目的 探讨斯氏按蚊唾液腺中疟原虫配子体激活因子的变化趋势与蚊卵发育及产出的关系.方法 应用体外雄配子体出丝观察方法检测雌性斯氏按蚊唾液腺抽提物及卵巢匀浆上清中配子体激活因子对伯氏疟原虫雄配子体出丝诱导活性的动态变化;分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Bradford蛋白分析法检测两器官蛋白成分或含量的变化.结果 吸血后按蚊唾液腺抽提物的出丝诱导活性显著下降,未产卵组和产卵组按蚊的活性分别于吸血后第8日和第4日恢复到吸血前水平;卵巢匀浆上清的诱导活性亦在吸血后下降,吸血后第2日显著升高,未产卵组保持该活性水平至吸血后第8日,产卵组诱导活性于吸血后第4日(产卵翌日)回落.两组按蚊唾液腺蛋白组成未见明显区别;吸血后第2日,卵巢的蛋白含量达到峰值,未产卵组按蚊卵巢蛋白含量维持在高水平直至吸血后第6日,而产卵组按蚊卵巢蛋白含量在吸血后第4日则恢复到吸血前的水平.结论 按蚊唾液腺中配子体激活因子的消长与雌蚊体内蚊卵的发育、成熟及产出之间存在某种内在的生理联系.