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食管鳞癌中14-3-3σ表达的临床意义及与预后的相关性
目的 确定14-3-3σ与食管鳞状细胞癌(ESCC)临床病理特征及与预后的相关性.方法-86℃冻存的TNMⅠ～Ⅳ期ESCC 80例,ESCC组织芯片含ESCC 86例;分别应用Western blot、免疫组织化学检测80例冻存、组织芯片中86例ESCC中14-3-3σ的表达;Kaplan-Meier分析14-3-3σ、临床病理资料与ESCC术后整体生存期相关性.结果 14-3-3σ蛋白主要表达于胞质及胞膜,其阳性表达与淋巴结转移、TNM分期呈负相关,与分化程度正相关(P＜0.05);14-3-3σ高表达及低表达ESCC患者术后平均生存时间分别为39.82和28.45个月,5年整体生存率分别为43.31％和24.8％(log-rank test,P＜0.01),TNM分期和14-3-3σ是影响ESCC预后的独立因素.结论 14-3-3σ低/失表达可能是ESCC预后不良的分子标志物之一.
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乳腺癌中14-3-3σ的表达及其与Bc1-2和Bax的相关性研究
目的 探讨乳腺癌中及其与Bc1-2和Bax表达的关系,进一步研究乳腺癌中14-3-3σ的表达情况及与14-3-3σ相关的细胞凋亡调控的分子机制.方法 应用免疫组织化学方法检测58例乳腺癌组织中14-3-3σ,Bc1-2和Bax的表达情况.对58例乳腺癌组织中14-3-3σ的表达水平与相应临床病理参数进行统计分析,并根据随访资料对患者进行生存分析.应用Spearman相关分析分别统计14-3-3σ表达与Bc1-2和Bax蛋白表达的相关关系.结果 14-3-3σ在乳腺癌组织中阳性表达率为70.7％ (41/58),Bc1-2的阳性表达率为62.1％(36/58),Bax的阳性表达率为32.8％(19/58).14-3-3σ蛋白表达与肿瘤大小、腋窝淋巴结的转移和TNM分期有关.随访的58例乳腺癌病例中,14-3-3σ阳性组的5年累积生存率为51.2％ (21/41),14-3-3σ阴性组的5年累积生存率为82.4％ (14/17),14-3-3σ阳性组的5年累积生存率明显低于14-3-3σ阴性组,两者差异有统计学意义(P＜0.05).相关性分析结果表明,14-3-3σ蛋白的表达与Bc1-2蛋白的表达呈正相关,而与Bax蛋白的表达呈负相关(P＜0.05).结论 14-3-3σ参与了乳腺癌的发生和发展,并可作为衡量患者预后的新指标.14-3-3σ可能是通过调节凋亡相关蛋白Bc1-2和Bax的表达,从而参与了抑制肿瘤细胞凋亡的过程.
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p53突变型乳腺癌细胞系中14-3-3σ对p73基因稳定性的影响
目的 探讨在p53突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,14-3-3σ对p73基因稳定性的影响.方法 采用基因转染、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹检测(Western blot)和放线菌酮(CHX)蛋白抑制分析的方法研究14-3-3σ对p73基因稳定性的影响.结果 RT-PCR显示,单独转染1μg p73后,p73与GAPDH的灰度值比为0.635;转染1μg p73+1 μg 14-3-3σ和1 μg p73+2 μg 14-3-3σ后,p73与GAPDH的灰度值比分别为0.643和0.631.Western-blot显示,单独转染1μg p73后,p73与actin的灰度值比为0.333;转染1μg p73+1μg 14-3-3σ和1μg p73+2μg 14-3-3σ之后,p73与actin的灰度值比分别为0.797和0.826.放线菌酮蛋白抑制分析显示:单独转染p73的对照组,放线菌酮处理0、1、2、4、6 h后,p73与actin灰度比值分别为0.075、0.166、0.124、0.100和0.092;而共转染p73和14-3-3σ的实验组结果分别为0.963、0.244、0.244、0.234和0.185.结论 在转录水平上,14-3-3σ不影响p73基因的稳定性;而在蛋白表达水平上,14-3-3σ可以增加p73基因的稳定性.
关键词： P73稳定性 14-3-3σ MDA-MB-231细胞系 放线菌酮 -
14-3-3σ在中波紫外线诱导的HaCaT细胞增殖和周期中的作用
目的 初步研究14-3-3σ在中波紫外线(UVB)照射诱导的HaCaT细胞增殖和周期阻滞中的作用.方法 不同剂量UVB(0、10、20、30、40、50、60和80 mJ/cm2)照射HaCaT细胞和14-3-3σ稳定干扰细胞系(HaCaTKD14-3-3σ,以下简称HaCaTKD).照后48 h,结晶紫染色法观察细胞生长密度.30 mJ/cm2 UVB照射后,CCK-8法检测HaCaT和HaCaTKD细胞的增殖变化,流式细胞术分析细胞G2/M期细胞比例的变化,Western blot检测UVB照射后两种细胞的14-3-3σ-、Cdc2、Cdc25c和CyclinB1蛋白表达水平.结果 UVB照后48 h,两种细胞存活率均呈剂量依赖性下降,且HaCaTKD在10 mJ/cm2即可出现明显下降(t =8.83 ～49.63,P＜0.05).HaCaTKD细胞的增殖能力显著低于HaCaT细胞(F=32.89,P＜0.05);30 mJ/cm2的UVB照射后,HaCaT细胞在24 h后恢复增殖能力,但HaCaTKD细胞在72 h仍未见增殖变化.HaCaTKD细胞在各观察点G2/M期细胞比例均未改变(P ＞0.05);30 mJ/cm2UVB照射后,HaCaT细胞在6～18h发生G2/M期阻滞(t=7.41、9.22、9.16,P ＜0.05),HaCaTKD细胞G2/M期细胞比例未发生改变(P＞0.05).UVB照后6、12、18、24 h和照前相比,HaCaT细胞中14-3-3σ表达量上调(=5.42 ～9.57,P＜0.05);HaCaT和HaCaTKD两种细胞中的Cdc25c和Cyclin B1的表达水平在照后均下调(t=3.95 ～11.21,P＜0.05);Cdc2在HaCaT细胞中下调(=4.93 ～5.37,P＜0.05),在HaCaTKD细胞中无变化(P＞0.05).结论 UVB照射或不照射,14-3-3σ的表达情况均能影响HaCaT细胞的增殖变化和细胞周期,UVB照射能诱导HaCaT细胞发生G2/M期阻滞,这种阻滞可能是由14-3-3σ的表达所介导,进而引起周期相关蛋白Cdc2、Cdc25c和Cyclin B1的表达改变而引发的.
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浸润性乳腺癌中14-3-3σ蛋白的表达与ER、PR的相关性研究
目的 探讨浸润性乳腺癌组织中14-3-3σ蛋白的表达与雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的相关性.方法 选择2012年12月～2014年10月重庆市公安消防总队医院手术切除的浸润性乳腺癌组织标本55例及其相应的癌旁正常组织31例为研究对象,分别将其作为浸润性乳腺癌组织组和正常乳腺组织组.采用免疫组化SP法检测乳腺组织中14-3-3σ蛋白及ER、PR的表达情况;采用Pearson相关系数分析14-3-3σ蛋白表达水平与ER、PR的相关性.结果 浸润性乳腺癌组织14-3-3σ蛋白及ER阳性表达率明显低于正常乳腺组织,差异均有统计学意义(P＜ 0.05或P＜0.01);浸润性乳腺癌组织PR阳性表达率与正常乳腺组织比较,差异无统计学意义(P＞0.05);浸润性乳腺癌组织中,14-3-3σ蛋白阳性表达率明显低于ER、PR,差异均有统计学意义(均P＜0.05);正常乳腺组织中,14-3-3σ蛋白、ER及PR表达情况比较,差异无统计学意义(P＞0.05).不同年龄、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移情况的浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白阳性表达率比较,差异无统计学意义(P＞0.05);不同TNM分期、组织分型、分化程度、PR及ER表达情况的浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白阳性表达率比较,差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).Pearson相关性分析显示,14-3-3σ蛋白与ER阳性表达呈正相关(r=0.3334,P＜0.05),14-3-3σ蛋白与PR无相关性(P＞0.05).结论 14-3-3σ蛋白可能参与浸润性乳腺癌的发生、发展和转移,14-3-3σ与ER的联合检测可成为乳腺癌患者预后判断的重要指标.
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宫颈癌变过程中14-3-3σ基因mRNA的表达
目的:通过检测宫颈病变组织中14-3-3σ基因的mRNA含量,探讨其在宫颈癌发生发展过程中的表达与意义.方法:应用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PeR)定量检测14-3-3σmRNA在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中的表达.结果:RFQ-PCR结果表明宫颈癌组的14-3-3σmRNA水平显著高于正常宫颈组,而宫颈上皮内瘤变组14-3-3σmRNA水平与正常宫颈相近.结论:在宫颈癌中,14-3-3σ转录上调,而宫颈上皮内瘤变中14-3-3σ转录没有明显变化,14-3-3σ在宫颈癌变过程中可能发挥作用.
关键词： 宫颈癌 14-3-3σ 实时荧光定量聚合酶链反应 -
p53和14-3-3σ在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达和意义
目的 探讨p53和14-3-3σ在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达.方法 采用免疫组化SP法和RT-PCR方法检测慢性宫颈炎20例、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)75例(其中CINI、II、III级病变各25例)、宫颈癌患者30例组织中p53和14-3-3σ的表达.结果 慢性宫颈炎组未见p53阳性表达,宫颈癌组p53阳性表达率明显高于宫颈上皮内瘤样病变组(P<0.05).在宫颈癌组、宫颈上皮内瘤样病变组4-3-3σ阳性表达率明显低于慢性宫颈炎(P<0.05),宫颈癌组4-3-3σ阳性表达率明显低于宫颈上皮内瘤样病变组(P<0.05).而p53和14-3-3σ在宫颈上皮内瘤样病变各分级中的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05).宫颈癌p53和14-3-3σ阳性表达与宫颈癌的组织分化程度有关(P<0.05),而与临床分期及有无淋巴结转移无关(P>0.05),且二者在宫颈癌组织中的表达呈负相关(r=-0.533,P<0.05).结论 p53和14-3-3σ的异常表达可能在子宫颈的恶性转变和细胞分化中发挥着重要的作用,提示14-3-3σ可能是宫颈癌发生和发展中的重要抑制因子.
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14-3-3σ基因表达下调促进肾癌细胞增殖
目的 检测14-3-3σ在肾癌(renal cell carcinoma,RCC)及相应正常肾组织(normal tissue,NT)中的mR-NA及蛋白表达情况,探讨14-3-3σ在RCC中的作用及其作用机制.方法 随机选择47例经肾肿瘤根治性手术治疗的肾癌患者,提取肾癌组织及正常肾组织mRNA及蛋白,使用RT-PCR法检测肾癌及正常肾组织中14-3-3σmRNA的表达情况,使用Western blot方法检测14-3-3σ蛋白在肾癌及正常肾组织中的表达水平,统计肾癌组织及正常肾组织中14-3-3σ基因的表达差异.转染肾癌786-O细胞,分别使用质粒过表达或siRNA敲低14-3-3σ基因的表达,使用CCK-8法检测786-O细胞在过表达和敲低14-3-3σ基因后的增殖变化.结果 肾癌组织较正常肾组织14-3-3σ基因mRNA表达水平明显降低(P<0.01),且该基因在肾癌组织中的蛋白表达水平也较正常肾组织明显降低(P<0.01).在786-O细胞内过表达14-3-3σ基因能够明显抑制786-O细胞的增殖(P<0.05),敲低该基因的表达能够明显促进786-O细胞增殖(P<0.01).结论 肾癌组织较正常肾组织14-3-3σ基因的表达水平明显下降,14-3-3σ与肾癌细胞的增殖有关.
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浸润性乳腺癌中14-3-3σ基因的甲基化及其转录表达的意义
目的：探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中14-3-3σ基因的mRNA的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态，并分析其临床意义。方法采用RT-PCR技术及甲基化聚合酶链反应（ MSP）技术检测73例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中14-3-3σ基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况，并分析其与临床病理参数之间的关系。结果浸润性乳腺癌组14-3-3σ基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组（P＜0.05）；14-3-3σ的甲基化与TNM分期、腋窝淋巴结转移及ER受体等分组间差异均有显著性意义（P＜0.05），而与其他临床特征之间差异均无统计学意义（P＞0.05）；14-3-3σ在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；在40例14-3-3σ基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组，均未检测到14-3-3σ的mRNA表达，进一步研究甲基化与基因表达相关性发现，二者呈负相关性（ r＝-0.676，P＝0.000）。结论14-3-3σ基因异常甲基化可能影响其mRNA的表达水平；14-3-3σ基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关，对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和及时治疗提供帮助。
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14-3-3σ干扰逆转录病毒载体的构建及其稳定转染HaCat细胞系的建立
目的:构建14-3-3σ干扰逆转录病毒载体,建立稳定转染的HaCat细胞系.方法:人工合成14-3-3σ基因干扰序列并定向插入到pSuper-retro-neo-EGFP质粒,并在STBL3菌内进行质粒扩增,刷选阳性克隆,酶切测序鉴定,转染293FT细胞进行病毒包装、扩增、纯化、获取逆转录病毒载体,将逆转录病毒栽体感染HaCat细胞后Western免疫印迹法、Real-time PCR法检测14-3-3σ的表达情况.结果:连接重组后经酶切和测序筛选出pSuper-retro-neo-EGFP-si14-3-3σ;干扰质粒稳定转染的HaCat细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光,Western免疫印迹法和Real-time PCR法表明14-3-3σ表达明显抑制.结论:成功构建了14-3-3σ干扰的逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系.
关键词： 14-3-3σ 逆转录病毒 稳定转染的HaCat细胞系 -
组蛋白去乙酰化酶抑制剂抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的实验研究
背景与目的:三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中的研究热点和治疗难点,目前尚无十分有效的靶向治疗药物.本研究旨在观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACI)对TNBC细胞增殖的影响,探讨针对组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的治疗对TNBC治疗的可行性.方法:将HDACI辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)作用于TNBC细胞MDA-MB-468,用MTS比色法观察细胞生长情况；用流式细胞术(the flow cytometry,FCM)检测细胞周期分布、凋亡情况,以及P21、14-3-3 σ、Cyclin D1和Cyclin A2蛋白的表达状况,并进行统计分析；同时用Western blot检测以上4种蛋白的表达情况.结果:MTS比色法显示,MDA-MB-468在加入SAHA 24 h后出现细胞生长抑制并逐渐凋亡,于72 h达高峰；FCM检测显示,在加入SAHA 48 h后MDA-MB-468出现S期细胞比例下降,细胞内Cyclin A2蛋白的表达量下降,Cyclin D1、P21和14-3-3 σ蛋白的表达量上升,细胞凋亡率上升,与MDA-MB-468对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；Western blot检测结果显示,MDA-MB-468在SAHA加入48 h后Cyclin A2蛋白表达量下降,P21、14-3-3 σ及Cyclin D1蛋白表达量上升.结论:SAHA是TNBC细胞增殖的高效抑制剂并促进其凋亡,其抑制作用有一定的时效关系；抑癌基因表达产物P21、14-3-3 σ蛋白和周期素Cyclin D1、Cyclin A2参与了SAHA对细胞增殖周期的调控.
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乳腺癌中组织14-3-3σ和cyclin B1的表达及其临床意义
目的:探讨14-3-3σ和cyclin B1蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌临床病理特征之间的关系.方法:选择2006年11月至2009年11月在辽宁医学院附属第一医院手术治疗的乳腺癌患者95例乳腺癌和30例癌旁组织(距癌边缘5 cm)的标本,患者年龄为31-85岁,中位年龄58岁.免疫组织化学PV法和Western blotting检测14-3-3σ和cyclin B1蛋白在乳腺癌和癌旁组织中的表达,分析两者与乳腺癌临床病理特征之间的关系以及两者的相关性.结果:Western blotting与免疫组化实验结果显示,14-3-3σ蛋白在乳腺癌中表达率为22.1%(21/95),显著低于癌旁组织的93.3%(28/30)(P<0.01);14-3-3σ蛋白的表达与乳腺癌组织学分级、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05).Cyclin B1蛋白在乳腺癌中的表达率为69.5%(66/95),显著高于癌旁组织的40%(12/30)(P<0.05);CyclinB1蛋白的表达与乳腺癌淋巴结转移相关(P<0.05).乳腺癌组织中14-3-3σ和cyclin B1蛋白的表达呈负相关(r=-0.333,P=0.001).结论:14-3-3σ和cyclin B1蛋白与乳腺癌的发生、转移相关,两者联合检测可为乳腺癌诊断和治疗提供参考.
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丹参注射液对人肝癌细胞14-3-3σ基因甲基化的影响
目的：观察肝癌组织14-3-3σ基因表达及其启动子区域甲基化程度的改变，丹参注射液对人肝癌细胞株Huh-7细胞14-3-3σ基因表达及其启动子区域甲基化的影响。方法收集2014—1月至2014年12月36例肝癌患者的肝癌组织及其癌旁组织，分别分离其RNA及DNA，针对14-3-3σ基因表达及其启动子区域甲基化程度进行定量分析；使用丹参处理人肝癌细胞株Huh-7细胞，观察丹参注射液处理后人肝癌细胞株Huh-7细胞侵袭能力及其14-3-3σ基因表达及其启动子区域甲基化程度的改变。结果相较于癌旁组织，肝癌组织14-3-3σ基因的表达量显著降低，且基因组DNA启动子区域多个CpG位点呈连续性的甲基化水平增高；丹参注射液处理后人肝癌细胞株Huh-7细胞侵袭能力显著降低；伴随着14-3-3σ基因表达量增加，且其启动子区域的多个CpG位点呈连续性的甲基化水平降低。结论肝癌组织14-3-3σ基因低表达与其启动子区域的高甲基化水平相关；丹参注射液能抑制通过抑制14-3-3σ基因启动子区域的多个CpG位点的甲基化，促进抑癌基因14-3-3σ表达，从而降低人肝癌细胞株Huh-7细胞的侵袭能力。
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HP V感染宫颈组织中14－3－3σ表达及启动子甲基化水平检测
目的：：检测HPV感染宫颈组织中14－3－3σ启动子甲基化与14－3－3σ mRNA的表达。方法：采用甲基化特异性PCR技术检测26例宫颈CIN3＋宫颈原位鳞癌,39例宫颈尖锐湿疣及35例对照标本中14－3－3σ基因启动子区CpG岛甲基化状态,Q－PCR法检测14－3－3σ mRNA表达,Western Blot检测14－3－3σ蛋白的表达。结果：宫颈CIN3＋宫颈原位鳞癌组中14－3－3σ基因启动子区CpG岛甲基化率为73.08％,明显高于对照组的22.86％,差异有统计学意义( P<0.05)；尖锐湿疣组为17.94％与对照组比较,差异无统计学意义( P>0.05)。宫颈CIN3＋宫颈原位鳞癌组的14－3－3σ mRNA及蛋白表达较对照组减少,宫颈尖锐湿疣组14－3－3σ mRNA及蛋白表达较对照组增加。结论： HPV感染宫颈CIN3＋宫颈原位鳞癌组织中14－3－3σ表达减少可能与14－3－3σ启动子高甲基化相关。
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支持向量机预测食管鳞癌患者术后生存期
目的 应用支持向量机(support vector machine,SVM)建立食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)术后生存期预测模型并评估该模型判断ESCC生存期的效能.方法 随访168例接受根治性手术治疗的ESCC患者,分析ESCC临床病理特征和14-3-3σ、热休克蛋白gp96、巨噬细胞移动抑制因子(migration inhibitory factor,MIF)等3个蛋白的表达规律与ESCC生存期的相关性;应用Matlab软件进行SVM运算,对训练组128例ESCC患者建立优预后分类模型ESCC-SVM,并用测试组40例患者验证分类效率,ROC曲线分析ESCC-SVM及其他预后相关因子对高低死亡风险ESCC的识别能力.结果 ESCC-SVM由性别、T分期、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、14-3-3σ和gp96等7个优属性组成,该模型区分训练组和测试组ESCC五年整体生存率的大AUC分别为0.96、0.86、准确率分别为97.7％、90.0％,明显优于目前临床应用的TNM分期(准确率分别为62.5％、67.5％)及其他各临床病理属性.Cox多因素比例风险回归模型分析发现年龄、T分期、gp96和ESCC-SVM是影响ESCC术后生存期的独立因素.ESCC-SVM与性别、T分期、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期和14-3-3σ均显著相关.结论 本研究建立的ESCC-SVM为预后评估、临床治疗方案选择及个体化治疗提供了理论依据.
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肝癌组织中14-3-3σ启动子异常甲基化及基因转录水平检测
目的 探讨肝癌14-3-3σ基因启动子异常甲基化状况及其与转录水平的关系.方法 14-3-3σ启动子甲基化用甲基化特异性PCR检测;14-3-3σ mRNA的表达水平用实时定量PCR检测.结果 14-3-3σ启动子甲基化在肝癌患者癌旁组织、肝硬化组织和癌组织中的阳性率分别为6.8%(3/44)、56.1%(23/44)和93.2%(41/44).不同性别、分化程度和乙型肝炎病毒状态的组织中14-3-3σ甲基化频率无显著差异(P＞0.05);发生甲基化的组织标本中90.6%(58/64)转录缺失,10.4%转录水平下降,而未发生甲基化的标本14-3-3σ mRNA表达水平基本正常.14-3-3σ甲基化与其mRNA水平明显负相关(P＜0.05).14-3-3σ甲基化与其mRNA表达水平下降密切相关(P＜0.05).结论 从癌旁组织、肝硬化组织到癌组织,14-3-3σ基因启动子甲基化频率逐步升高,且与其mRNA表达相关,提示14-3-3σ启动子甲基化可能在肝癌形成过程中是一个早期事件,与肝癌发生有一定关系.
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鼻咽癌耐药细胞株14-3-3σ表达研究
目的 研究14-3-3σ基因在鼻咽癌细胞株HNE1和耐顺铂鼻咽癌细胞株HNE1-DDP的表达情况,以了解14-3-3σ基因与耐药的关系. 方法 采用蛋白印迹法(western blotting,WB)检测HNE1-DDP细胞与HNE1细胞14-3-3σ的表达,并采用荧光定量RT-PCR(quantitative RT-PCR,q RT-PCR)检测14-3-3σ基因的mRNA表达水平. 结果 14-3-3σ蛋白和其mRNA在HNE1-DDP细胞株中表达明显下降. 结论 14-3-3σ下调可能与鼻咽癌耐药相关,其在耐药细胞株中表达下调的机制有待进一步的研究.
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5,7-DMF对MDA-MB-453细胞凋亡和14-3-3σ基因表达的影响
目的:研究5,7-二甲氧基黄酮(5,7-DMF)诱导人乳腺癌MDA-MB-453细胞凋亡作用及机制.方法:体外培养乳腺癌MDA-MB-453细胞.MTT法测定细胞活力；碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率；甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)观察14-3-3σ基因甲基化状态；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测14-3-3σ基因mRNA表达水平；Western blotting分析14-3-3σ蛋白表达.结果:5,7-DMF以浓度依赖方式抑制MDA-MB-453细胞活性和诱导细胞凋亡.10μmol/L 5,7-DMF处理72小时能显著抑制MDA-MB-453细胞14-3-3σ基因甲基化并上调其mRNA表达水平.5,7-DMF以浓度依赖方式上调14-3-3σ蛋白表达.结论:5,7-DMF诱导MDA-MB-453细胞凋亡与其抑制14-3-3σ基因甲基化并上调14-3-3σ蛋白表达有关.
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14-3-3σ与TPD52L1在低剂量中波紫外线诱导HaCaT细胞辐射损伤中作用研究
目的：探讨14-3-3σ与TPD52L1在低剂量中波紫外线（ UVB）诱导的HaCaT细胞凋亡、增殖和细胞周期中的作用。方法①取对数生长期HaCaT细胞，予低剂量UVB（累计照射剂量为2.97×10－2 J／cm2）照射后培养6～48 h收获细胞，另设不予UVB照射（予假照射）的对照，采用流式细胞分析法检测细胞凋亡率；将HaCaT细胞分为对照组和UVB组，于相应照射处理后0～72 h收获细胞，采用噻唑蓝法检测细胞增殖能力。②取HaCaT细胞随机分为对照组（予假照射）和UVB组，于相应照射处理后0～24 h收获细胞，采用流式细胞术检测G2／M期细胞比例。③予低剂量UVB照射HaCaT细胞后培养3～24 h或3～30 h，收获细胞，另设予假照射的对照，采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞中14-3-3σ与 TPD52 L1的 mRNA 的相对表达水平，采用蛋白质印迹法检测细胞中14-3-3σ与TPD52L1的蛋白相对水平表达。结果①UVB照射后24 h， HaCaT 细胞凋亡率上升至高值（ P＜0.05），增殖能力下降至低值（P＜0.05）。②对照组HaCaT细胞G2／M期比例呈现在假照射后6～12 h维持在高值，至假照射后18 h下降至低值的周期性改变特征；UVB组HaCaT细胞G2／M期比例在照射后6、12和18 h均较对照组上升（P＜0.05），并持续在高值，发生较明显的G2／M期阻滞。③UVB照射后HaCaT细胞中14-3-3σ的mRNA和蛋白相对表达水平均呈现先上升后下降现象。其中，14-3-3σmRNA相对表达水平于照射后3 h上升至峰值（ P＜0.05），于照射后3～12 h维持峰值水平（ P＜0.05），其后逐渐下降，于照射后24 h恢复正常水平；14-3-3σ蛋白相对表达水平于照射后6 h开始上升（P＜0.05），于照射后18 h上升至峰值（P＜0.05），其后逐渐下降，但于照射后30 h仍未恢复正常水平。 TPD52L1 mRNA相对表达水平则呈现先下降后上升现象，于照射后12 h下降至低水平（P＜0.05），其后逐渐升高，于照射后24 h上升至峰值（P＜0.05）；TPD52L1蛋白相对表达水平呈先上升后下降现象，于照射后24 h上升至峰值（P＜0.05），于照射后30 h下降至正常水平（P＜0.05）。结论14-3-3σ和TPD52L1在低剂量UVB诱导HaCaT细胞发生凋亡、增殖和G2／M期阻滞中可能共同发挥重要作用。
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14-3-3σ影响肿瘤发生发展和治疗的细胞及分子机制
14-3-3σ是14-3-3蛋白家族的重要成员之一,在多种肿瘤中低表达.作为肿瘤抑制蛋白,14-3-3σ的低表达或活性降低可致癌细胞的过度增殖和凋亡不足,进而促进肿瘤的发生发展、侵袭、转移,甚至影响肿瘤的预后和疗效.本文主要综述和总结14-3-3σ与肿瘤临床生物学特性的关系、肿瘤细胞和患者癌组织14-3-3σ蛋白表达异常的原因、14-3-3σ对肿瘤细胞增殖和凋亡及其信号转导的影响,旨在揭示14-3-3σ的抑癌作用及细胞和分子机制,为临床肿瘤诊疗提供新的药物靶点和肿瘤标志物.
