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大黄素体外抑制人树突状细胞分化及成熟作用的研究
目的 探讨大黄素体外作用树突状细胞(dendritic cell, DC)后对人DC分化、成熟及免疫功能的影响.方法 分离健康人外周血单个核细胞,在粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)的诱导下培养DC.培养的第5天和第7天分别加入脂多糖(liopolysaccharide,LPS)及大黄素刺激获得成熟或未成熟DC,流式细胞仪检测树突状细胞表型(HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14、CD11c)及IL-12的分泌水平,并将DC与自身T淋巴细胞共培养,评价树突状细胞的免疫刺激功能.结果 大黄素作用组DC细胞表面分子CD80及CD83的表达分别为(13.4±6.6)%和(9.3±2.2)%,而对照组分别为(39.3±8.6)%和(30.7±5.6)%,差异有统计学意义(P<0.05);大黄素组与对照组比较,DC分泌IL-12[(1 700.44±1 000.21) μg/L vs (4 500.60±1 200.60) μg/L]能力下降,分泌IL-10能力提高[(350.60±150.20) μg/L vs (230.70±90.10) μg/L]差异均有统计学意义(P<0.05).混合淋巴细胞培养检测发现大黄素可显著抑制DC刺激的自体T淋巴细胞的增殖.结论 在DC体外转化的过程中大黄素可明显抑制DC的成熟及免疫刺激功能.
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肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞和肿瘤免疫治疗
肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞(CTL)是重要的抗肿瘤细胞.本文介绍了抗原呈递及CTL识别的分子基础,并对肿瘤相关抗原(TAA)及T细胞表位的鉴定、肿瘤相关抗原肽诱导特异性CTL应答的免疫原性、肿瘤相关抗原肽疫苗治疗肿瘤的原理以及T细胞免疫应用前景做一综述.
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细胞免疫治疗白血病研究进展
尽管化疗能诱导恶性血液病缓解,但是缓解后存在复发风险且化疗毒性无法避免.研究人员一直致力于通过免疫手段清除肿瘤细胞.近年来,人们发现了许多白血病相关抗原(LAA)能被细胞毒性T细胞(CTL)所识别,同时具有HLA-Ⅰ限制性.这些LAA包括WT1、PR-3、RHAMM、BCR-ABL和Aur-A等.在实验室研究基础上,目前开展的恶性血液病免疫治疗手段包括有肿瘤多肽疫苗、获得性T细胞治疗、NK细胞及DC-CIK治疗等.本文就细胞免疫治疗白血病研究进展作一综述.
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肿瘤抗原冲击DC诱导淋巴细胞对小鼠胃肠癌的杀伤作用
目的:用胃肠癌冻融抗原冲击树突状细胞(DC)诱导荷瘤小鼠脾细胞,观察DC及细胞毒T细胞(CTL)的生物学功能及对胃肠癌靶细胞体外杀伤作用.方法:小鼠骨髓细胞经GM-CSF、IL-4诱导和胃肠癌细胞系 KATO3、CT26细胞冻融抗原(Ag)的冲击,诱生致敏的DC与活化脾淋巴细胞共培养,获得的CTL对相应靶细胞及对照黑色素瘤细胞进行体外杀伤.结果:制备的DC与CTL具有良好的生物学活性,胃肠癌 Ag冲击的DC诱导的CTL对相应靶细胞的杀伤率分别平均75.98%和86.75%,且效靶比显示量效关系;对无关靶细胞A375为10.57%和11.53%.结论:胃肠癌Ag冲击致敏的DC能诱导CTL产生特异性杀伤作用.
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HLA-A·02/24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析
目的 建立HLA-A·0201/2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆.方法 HLA-A·0201/2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞(PBMC)分别用限制性表位肽HBc18～27和HBc117～125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素(PHA)及联合使用表位肽刺激.用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定.结果 从HBc18～27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8+T克隆,均具有特异性细胞毒活性.从HBc117～125激活的细胞中获得12株CD8+T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下.克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62%和14.58%.结论 分别用表位肽HBc18～27和HBc117～125,能激活HLA-A· 0201/2403阳性HBV感染者的CD8+T细胞.建立CD8+T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率.
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细胞毒T细胞
细胞毒T细胞(CTL)分为CD8+CTLs、CD4+CTLs和CD4-CD8-CTLs几个亚群,它来源于淋巴样造血干细胞的T细胞库,在胸腺中发育成熟,并在周围淋巴组织中活化.效应CTL对靶细胞实行杀伤的途径主要有两条:FasL-Fas介导的细胞凋亡作用和颗粒胞吐途径介导的溶细胞作用.由于CTL在抗肿瘤和抗病毒中效应显著,因而受到广泛重视.
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颗粒酶杀细胞的机制
颗粒酶是活化的细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的效应分子,主要介导细胞凋亡.其分子生物学特征从一定程度上揭示了它的作用.其细胞毒作用是与导致靶细胞凋亡的其他因素相关的,穿孔素是否介导了颗粒酶的进入值得探讨,caspases及其底物作为颗粒酶的潜在底物倍受关注.
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膀胱癌可溶性抗原诱导细胞毒T细胞的实验研究
目的 观察膀胱癌可溶性抗原诱导细胞毒T细胞产生，为构建膀胱癌疫苗及过继性免疫治疗提供实验基础。方法 提取膀胱癌可溶性抗原(TSA)，用TSA、抗CD-3单抗、IL-2联合诱导外周血单个核细胞(PBMC)，动态观察细胞增殖，进行细胞表型分析和细胞因子测定；并与IL-2诱导的LAK细胞，抗CD-3单抗、IL-2诱导的CD3-AK细胞进行比较。结果 实验组细胞第8d增殖7.52倍，第12d增殖28.92倍，第16d增殖32.8倍，第20d增殖36.96倍；LAK细胞第12d增殖5.72倍.第20d增殖0.82倍；CD3AK细胞第12d增殖24.46倍，第20d增殖27.72倍。实验组与LAK组、CD3-AK组比较相差有显著性(P＜0.05)。第8d实验组细胞表型分析：CD4+细胞为16％，CD8+细胞为89％。第8d培养上清肿瘤坏死因子(TNF)活性达到高峰，对L929细胞的细胞毒性为85.08％。结论 TSA、抗CD-3单抗、IL-2等诱导PBMC，产生了以CD8+为主的细胞毒T细胞(CTL)，这种细胞体外增殖速度快、增殖倍数高、存活时间长，并能分泌肿瘤坏死因子。
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调节性T细胞对肿瘤特异性CTL杀伤效能的影响
目的 探讨CD+4CD+25Treg细胞对肿瘤特异性CTL杀伤效果的影响及机制.方法 将C57BL/6小鼠80只随机分为4组,每组20只.实验组1:DC与T细胞共同培养前删除CD+4CD+25Treg;实验组2:DC与T细胞共同培养后删除CD+4CD+25Treg;实验组3:DC与T细胞共同培养时不删除CD+4CD+25Treg;对照组:无DC诱导的T细胞.应用脾脏来源DC细胞诱导T细胞制备CTL,在CTL形成的不同时期采用MACS法删除CD+4CD+25Treg.应用MTT法检测不同组别CTL对B16黑色素瘤细胞的杀伤效果.同时应用ELISA法检测细胞培养液中IL-2、IL-10含量变化.结果 3实验组CTL杀伤率明显高于对照组(P<0.05).实验组1及实验组2删除CD+4CD+25Treg的CTL杀伤率明显高于未删除的实验组3(P<0.05).但CTL形成的不同时期删除CD+4CD+25Treg对CTL杀伤率无显著差别(P>0.05).结论 删除CD+4CD+25Treg细胞可明显提高CTL的杀伤效果,是打破肿瘤免疫耐受机制的新途径.
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HLA-A*0201／CAP-1四聚体在结直肠癌研究中的应用
目的：应用HLA-A*0201/CAP-1四聚体，分析HLA-A*0201＋CEA＋结直肠癌患者的外周血及癌旁肠系膜引流淋巴结的特异性CTLs的数量。方法：分离健康人（18例）PBMC和结直肠癌（23例）患者PBMC以及癌旁肠系膜引流淋巴结的淋巴细胞，应用流式细胞术，以HLA-A*0201/CAP-1和HLA-A*0201/FLUmp四聚体检测CAP-1和FLUmp特异性CTLs的频率。结果：在25例HLA-A*0201＋个体中，结直肠癌组和正常组外周血单个核细胞中HLA-A*0201/FLU四聚体＋CD8＋细胞的频率分别为（0.671±0.421）％和（0.564±0.408）％，两组之间无显著差异（P＝0.525）。结直肠癌组和正常组外周血单个核细胞中HLA-A*0201/CAP-1四聚体＋CD8＋细胞的频率分别为（2.409±2.385）％和（0.020±0.021）％，两组之间有显著差异（ P＝0.008）。结论：HLA-A*0201＋结直肠癌患者HLA-A*0201/CAP-1四聚体＋CD8＋细胞的频率升高，说明CEA特异性CTLs在结直肠癌患者的免疫监视功能中具有重要的作用。对存在针对肿瘤抗原的特异性CTLs却无法阻止肿瘤进展的具体机制需要更加深入的研究。
关键词： MHCⅠ类分子四聚体 细胞毒T细胞 结直肠癌 癌胚抗原 -
T-exo 负载DC诱导抗肝癌细胞免疫效应研究
目的：观察肝癌细胞来源的外泌体（T-exo）负载DC体外诱导细胞毒T细胞（CTL）对肝癌细胞的杀伤作用。方法：采用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度超速离心的方法从肝癌Huh-7细胞培养上清液中分离外泌体（ T-exo ），透射电镜鉴定形态，Western blot 检测外泌体相关蛋白CD9、CD63、HSP70及肿瘤抗原分子AFP的表达；分离健康供者外周血单个核细胞（PBMC）培养DC，流式细胞术鉴定负载T-exo 的DC细胞表型；用2-（4-碘苯）-3-（4硝基苯）-5-（2，4-磺苯基四氮唑）-2H-四唑单钠盐-1（ WST-1）法检测负载T-exo 的DC 刺激T淋巴细胞增殖情况；流式细胞术Annexin-V／PI双染法检测负载T-exo 的DC诱导CTL分别对AFP阳性Huh-7细胞及AFP阴性的SMMC7721细胞的杀伤作用。结果：透射电镜下可见T-exo为圆形或椭圆形双层膜囊泡状小体，大小不等，平均直径50～100 nm，表达外泌体膜相关分子及肿瘤抗原分子。负载T-exo 的DC 可促进初始T细胞增殖，T-exo致敏DC对AFP阳性的Huh-7肝癌细胞系杀伤活性明显高于AFP阴性的SMMC7721肝癌细胞组（ P＜0.05）及未负载T-exo 的对照组DC（ P＜0.05）。结论：负载T-exo 的DC 能促进T细胞增殖，提高CTL细胞的细胞毒活性诱导特异性的抗肝癌效应。经T-exo抗原致敏DC诱导的CTL对肝癌细胞有明显的细胞毒作用，明显高于DC对照组（ P＜0.05）。
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某省肿瘤医院不同年龄、性别的健康人外周血各类T细胞亚群和NK细胞的分布研究
目的 调查不同年龄、性别的正常人外周血中各类T细胞亚群和NK细胞的分布.方法 流式细胞仪检测193例健康者外周血的各类T细胞亚群和NK细胞在淋巴细胞、T细胞、或T细胞亚群中的百分比含量.结果 193例健康人按年龄分为青年(≤39岁)、中年(40～ 59岁)、老年(≥60岁)三个组.获得在不同年龄、性别组中T、T4、T8和NK细胞占外周血淋巴细胞中的平均值和标准差;Th、Tc、Ts、Treg、NKT、活化T细胞等T细胞亚群占外周血T细胞中的平均值和标准差;Treg细胞占T4细胞亚群中,Tc、Ts占T8细胞亚群中的平均值和标准差.结论 本结果可作为健康人外周血细胞流式细胞术参数的正常参考值,供基础和临床研究参考.
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四聚体技术检测人外周血巨细胞病毒抗原特异性CTL
为深入了解抗病毒免疫机制,探索人在健康状态及巨细胞病毒(CMV)急性感染时抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)数量的动态变化.以CMV抗原肽、HLA-A*0201重链和轻链制备CMV四聚体;分离并检测12名健康被检者外周血单个核细胞(PBMC)中CMV抗原特异CTL数量;PBMC体外培养建立CTL细胞系,于末次刺激的不同时相进行四聚体染色,流式细胞仪(FACS)检测抗原特异CTL数量.结果发现9名被检者PBMC中均检出抗原特异CTL;细胞系中CMV特异性CTL数量急剧增多,细胞系与PBMC相比,差异有显著的统计学意义(P＜0.001);研究结果提示,9名被检者感染过CMV,血液中存在少量免疫记忆性T细胞,当再次遭遇同一抗原后发生克隆扩增.
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慢性乙型肝炎患者外周血细胞毒T细胞表面NK相关受体的表达
目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者细胞毒T细胞(CTL)表面NK相关受体(NKR)的变化格局,了解CHB患者CTL对乙型肝炎病毒(HBV)免疫应答的受体途径.方法 用流式细胞术分析40例CHB患者(HBV DNA阳性18例,HBV DNA阴性22例)和20名健康对照者(正常对照组)外周血CTL百分率及其表面NK相关的激活性受体NKG2D和NKp30以及抑制性受体NKG2A和KIR2DL3的表达水平,统计分析2组间上述指标的差异及其与HBV DNA载量、HBV感染血清标志物和肝脏损伤标志物等的相关性.结果 CHB组外周血T细胞中CTL百分率[(19.33±6.25)%]显著低于正常对照组[(23.94±6.09)%](P<0.05),CTL表面表达KIR2DL3的细胞比例[(3.32±2.63)%]显著高于正常对照组[(1.55±0.53)%](P<0.05).CHB患者中HBV DNA阳性组外周血CTL百分率[(16.94±4.8)%]显著低于HBV DNA阴性组[(21.29±6.7)%](P<0.05);HBV DNA阳性组CTL表面表达KIR2DL3的细胞比例[(3.85±3.41)%]显著高于HBV DNA阴性组[(2.91±1.81)%](P<0.05).相关性分析结果 显示,CHB患者外周血中表达NKG2A的CTL比例与血清HBV DNA和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平呈显著正相关(r值分别为0.580、0.671,P<0.01),CHB患者外周血中表达KIR2DL3的CTL比例与HBeAg呈显著正相关(r=0.556,P<0.001).结论 CHB患者存在CTL数量和功能的缺失,即T细胞耗竭;CHB患者CTL上NK相关抑制性和激活性受体表达格局的变化致使CTL活性受损和免疫应答紊乱,导致HBV不能得到有效清除,引起肝细胞损伤.CTL上NK相关抑制性受体表达水平可望成为CHB病情评估的新指标以及CHB治疗的潜在新靶点.
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大鼠同种肝移植免疫耐受机制的研究
目的:探讨与大鼠肝移植免疫耐受相关的细胞学改变.方法:分析从肝移植物分离出的移植物浸润细胞(GIC)的表现型和功能,同时比较长期生存的BN→LEW模型和急性排斥反应的DA→LEW模型.结果:通过流式细胞仪计数确定DA→LEW受体的T细胞和激活的T细胞相对比例高于BN→LEW受体;移植后第7、14和30天,GIC表现型证实所有T细胞、OX8阳性细胞(细胞毒T细胞和NK细胞)和OX39阳性细胞(IL-2受体)的相对比例在移植后第7天高,移植后30 d下降;移植后第7天急性排斥反应时GIC细胞毒T细胞活性高于长期生存者.结论:移植后第7天免疫抑制机制已存在;在长期生存的肝移植物中细胞毒T细胞的激活和浸润均受到抑制.
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不同方式负载AFP抗原的DC诱导抗肝癌HepG2细胞免疫效应的比较
目的:比较AFP抗原以不同方式负载DCs对后者生物学功能的影响及体外刺激CTL对肝癌HepG2细胞的杀伤作用.方法:分离健康供者外周血单个核细胞培养DC,分别用(A)人工合成AFP抗原肽、(B)HepG2细胞裂解物、(C)HepG2细胞分泌的外泌体(tumor exosome,T-exo)、(D)AFP抗原的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus express-ingα-fetoprotein antigen,rAAV/AFP)致敏DC前体细胞及(E)未负载抗原的DC作为对照,经GM-CSF、IL-4及LPS联合诱导DCs分化成熟.流式细胞术检测rAAV/AFP病毒感染效率、各组DCs表型及其刺激初始T细胞的增殖效应,7-ADD/CFSE双染法流式细胞术检测各组DCs诱导CTL对AFP阳性HepG2细胞的杀伤作用.结果:几种抗原负载方式均可诱导DCs成熟、促进CTL增殖及特异性识别并杀伤HepG2细胞,但rAAV/AFP感染DCs后,其CD83、CD86、ICAM-1、CD58、CD40分子表达水平明显高于对照组(P＜0.05),rAAV/AFP+ DC组和HepG2-Texo+ DC组对HepG2细胞的杀伤作用均分别显著优于其他抗原负载(AFP/peptide+ DC、HepG2 lysate+ DC)组[(44.92±4.12)％vs(28.42±3.29)％、(24.28±1.79)％;(41.40±2.87)％ vs(28.42±3.29)％、(24.28±1.79)％;均P＜0.05)].结论:rAAV/AFP高效感染DCs后能有效刺激初始T细胞增殖,并增强CTL对AFP阳性靶细胞的杀伤活性,而负载Texo的DCs也能诱导显著的抗肝癌效应,上述结果为基于DCs的肝癌疫苗的研发提供新的思路.
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迟发型超敏性反应分型及其在变应性皮肤病中的意义
基于T细胞CD4、CD8免疫表型及所分泌的细胞因子,成熟T细胞在特定情况下可分为或极化为Ⅰ型辅助性T细胞、Ⅱ型辅助性T细胞、Ⅰ型细胞毒T细胞及Ⅱ型细胞毒T细胞等型,综述由各个极化型T细胞在变应性皮肤病中介导的迟发型超敏反应的表现型以及迟发型超敏反应分型在变应性皮肤病尤其是特应性皮炎中的意义.
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慢性乙型肝炎病毒感染者HBcAg特异性细胞毒性T细胞克隆的建立
目的 建立HLA-A*2402限制的HBcAg特异性CTL细胞克隆.方法 取HLA-A*2402阳性的慢性HBV感染者的PBMC,用限制性表位肽(HBV core 117-125,EYLVSFGVW)和重组HBcAg刺激,并以有限稀释法对活化的T细胞进行克隆化,用免疫荧光染色、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定.结果 PBMC经表位肽激活后,特异性细胞毒活性达到43.7%;从活化细胞获得11株T细胞克隆;除2株是CD4CT细胞克隆外,其余9株为CD8+T细胞克隆,其中2株为Tc1,3株为Tc2和4株为Tc0.9株CD8+T克隆在效/靶比例为2.5:1时均具有HBcAg特异性靶细胞溶解活性(33.9%～90.2%).结论 用HBVcore 117-125能激活HLA-A*2402阳性的慢性HBV感染者外周血CD8+T细胞,随之建立的9株CD8+T克隆均具有HBcAg表位特异性细胞毒活性.
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树突状细胞及其在血液恶性肿瘤生物治疗中的作用
树突状细胞(Dendritic cell,DC)是起源于骨髓的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cell, APC),具有极强的抗原递呈能力,是巨噬细胞的10～100倍.1973年Steinman和Cohn首次从小鼠淋巴结中分离成功,因其表面有众多的树突状突起而得名.近年来,由于DC具有的生物学特性以及在肿瘤生物治疗中的价值,日益被人们所重视.本文就近年来DC在血液系统恶性肿瘤生物治疗中的研究进展作一综述.
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树突状细胞活化的CTLs联合5-FU在裸鼠体内外对喉癌的抑制作用
目的 探讨树突状细胞(DCs)活化的细胞毒T细胞(CTLs)联合5-氟尿嘧啶(5-FU)在裸鼠体内外对喉癌的抑制作用.方法 MTT法检测DCs激活的CTLs联合5-Fu在裸鼠体外对喉癌细胞的抑制作用.裸鼠体内实验分为CTLs治疗组、5-FU治疗组、CTLs/5-FU治疗组及对照组,观察喉癌移植瘤的成瘤率、潜伏期、瘤重及瘤体积.结果 治疗组在裸鼠体外都能显著抑制喉癌细胞生长,以CTLs/5-FU治疗组的效果为显著(P＜0.01).在裸鼠体内实验中,治疗组的成瘤率、瘤体积、瘤重都显著降低,潜伏期延长,以CTLs/5-FU治疗组为显著(P＜0.01).结论 P联合应用DCs激活的CTLs及5-FU比单独应用CTLs或5-FU对喉癌的抑制效果更佳.
