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生长相关蛋白43与脊髓损伤
生长相关蛋白43(growth-associated protein 43,GAP-43)是一种胞膜磷酸蛋白质,它广泛存在于神经组织中,尤其是在生长、分化和再生的轴突末端以及突触前膜,被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子.GAP-43对于神经系统发育过程中的轴突生长和突触形成具有重要作用,周围神经损伤后.其含量可增加20～100倍[1-2].增强损伤脊髓组织中GAP-43的表达水平,能促进损伤脊髓神经元的再生和修复,对脊髓损伤起保护作用,近年对其研究日渐深入.
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嗅鞘细胞对正常及损伤脊髓神经元的保护作用
目的 研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)培养液对正常及损伤脊髓神经元的影响,进一步探讨OECs促进及保护脊髓神经元的作用机制.方法 取成年SD大鼠OECs制备OECs培养液(OEC culturemedium,OECCM),倒置相差显微镜观察细胞形态,行兔抗大鼠低亲和力神经生长因子受体p75抗体(nerve growth factorreceptor p75,NGFR p75)细胞免疫组织化学染色观察及纯度计算.取孕15～17 d SD大鼠制备脊髓神经元,并以H2O2制备损伤模型.观察OECCM对正常胚胎SD大鼠脊髓神经元生长发育的影响实验分为对照组(A组)和实验组(B组),OECCM对H2O2致脊髓神经元损伤模型的影响实验也分为对照组(C组)和实验组(D组).A、C组每孔加200 μL完全培养基,B、D组每孔加100 μL OECCM和100 μL完全培养基.4组细胞均作活性MTT比色分析.结果 OECs培养6～9 d后,细胞多呈双极形或梭形:脊髓神经元胞体较大,多呈圆形,培养5～7 d后,突起明显生长,多为双突起.NGFRp75细胞免疫组织化学染色观察示OECs细胞膜棕色深染,胞体清晰,呈梭性或三角形;OECs纯度>90%.培养6～9 d后,与A组相比,B组细胞生长旺盛,密度较高,胞体明显增大.A组胞体平均直径、单个神经元突起数目及细胞突起长度分别为(33.38±6.80)D/μm、(1.67±0.80)个和(91.19±62.64)L/μm,B组分别为(37.39±7.28)D/μm、(1.76±0.82)个和(121.33±81.13)L/μm,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05).A组MTT比色法所测吸光度(A)值为0.402 0±0.586 9,B组为0.466 0±0.479 0,两组比较差异有统计学意义(P<0.01).损伤后2 h,C、D组细胞数量明显减少,存活的神经元胞体皱缩、胞膜不清楚,细胞突起明显回缩或断裂.C组MTT比色法所测A值为0.1490±0.0300,D组为0.1840±0.052 0,两组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 OECCM可促进正常脊髓神经元生长,对损伤脊髓神经元有一定保护作用,OECs分泌的促神经生长因子是OECs发挥脊髓神经元保护作用的机制之一.
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原代培养大鼠脊髓神经元损伤前后Fos、TH及PNMT表达变化的研究
为了探讨多巴胺及肾上腺素在神经元损伤和修复过程中的作用,我们通过锐器切割原代培养的纯化大鼠胚胎脊髓神经元,模拟脊髓全横断后脊髓神经元损伤状态,观察了损伤前后Fos蛋白与儿茶酚胺类神经递质合成酶的表达变化.分离、培养、纯化孕14 d的Wistar大鼠脊髓神经元,10 d后在直视下进行脊髓神经元的锐器切割损伤.用免疫组化及Western blot技术研究损伤前后神经元内Fos蛋白与酪氨酸羟化酶(TH)、苯乙醇胺氮位甲基移位酶(PNMT)的共定位情况及表达水平变化.结果发现:脊髓神经元损伤10 min后Fos蛋白开始表达,2 h后Fos阳性达到高并同时表达TH及PNMT;Western blot结果也证实损伤后Fos、TH和PNMT表达均较损伤前上调.上述结果提示,神经元经损伤后激活的即刻早期基因c-fos,可作为信号分子活化受损神经元内儿茶酚胺类神经递质(TH和PNMT),多个分子共同作用可能参与了神经元的损伤和修复过程,其生物学意义有待进一步探讨.
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BDNF对体外培养的大鼠脊髓前角神经元内突触素Ⅰ与突触囊泡素表达的影响
探讨BDNF对体外培养的大鼠脊髓前角神经元内突触素Ⅰ与突触囊泡素(SYN)表达的影响.取孕14 d大鼠子宫内胎鼠的脊髓腹侧部分神经元,体外有血清培养.在培养7 d后,随机分成对照组、BDNF组和抗BDNF组.BDNF组培养液中加入BDNF(20 ng/ml),抗BDNF组培养液中加入BDNF抗体(20μg/ml),对照组加入等量Hanks液.3 d后在倒置显微镜下计数三组神经元存活数,并用NF-200、MAP-2、NSE的免疫组化反应对神经细胞进行鉴定.行突触素Ⅰ与SYN免疫组化反应,对部分细胞行突触素Ⅰ mRNA原位杂交反应,运用图像分析系统对突触素Ⅰ与SYN免疫组织反应阳性产物以及突触素Ⅰ原位杂交反应阳性产物作光密度分析.结果发现有血清培养时各组脊髓前角神经元的存活数无显著差异(P＞0.05);BDNF组突触素Ⅰ与SYN免疫反应阳性产物的平均光密度值高于其它两组,抗BDNF组低(P＜0.01).BDNF组突触素ⅠmRNA阳性产物的平均光密度值明显高于其它两组,抗BDNF组突触素Ⅰ mRNA阳性产物的平均光密度值低(P＜0.01).本研究结果提示BDNF对有血清培养时脊髓前角神经元的存活没有明显影响,但BDNF可明显上调培养的脊髓前角神经元内突触素Ⅰ与SYN的表达.
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嗅鞘细胞移植与脊髓损伤再生修复
嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是存在于嗅觉系统的一种特殊类型的大胶质细胞,分布于嗅神经、嗅球的第一、二层和嗅上皮.OECs能伴随嗅束进入中枢神经系统.OECs兼有星形胶质细胞和雪旺细胞的特点,并迁徙于周围神经系统和中枢神经系统.在受损的脊髓组织移植OECs后,OECs不仅能引导、支持损伤神经轴突再生、延伸和髓鞘化作用,还能促进神经轴突穿越脊髓损伤所形成的胶质瘢痕区.通过转基因技术使OECs携带某些促进脊髓再生的外源性基因,表达一些促脊髓再生的分子,从而改善脊髓损伤的内环境,诱导损伤的脊髓神经元再生,使得受损脊髓再生的潜力得以发挥,达到脊髓再生和功能恢复的目的.OECs移植被认为是治疗脊髓损伤有潜力、有希望的方法.
