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LBH589对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖和凋亡影响的研究
目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖和凋亡的作用.方法 将25、50、100nmol/L不同浓度的LBH589处理SH-SY5Y细胞24h后,通过Western Blot法检测组蛋白H4乙酰化水平,进一步用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测SH-SY5Y细胞增殖能力；用流式细胞仪(FcM)分析细胞周期和凋亡.结果 LBH589处理SH-SY5Y细胞后,组蛋白H4的乙酰化水平增强；LBH589呈浓度依赖性抑制SH-SY5Y细胞增殖,增加G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例,增加Annexin V阳性细胞百分数.结论 LBH589可 增强组蛋白H4乙酰化水平,对SH-SY5Y细胞具有抑制增殖、G1期阻滞以及促凋亡作用,对人神经母细胞瘤有潜在治疗价值.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对多发性骨髓瘤细胞MM1R的抑制作用
本研究探讨新一代组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589单药或者联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米,对多发性骨髓瘤(MM)细胞的抗瘤效应.采用MTT法检测LBH589( 10、20、50 nmol/L)及50 nmol/L分别联合硼替佐米(10、20 nmol/L)作用于人多发性骨髓瘤MM1R细胞24,48 h后的细胞增殖抑制作用；采用流式细胞术检测LBH589对MM1R细胞周期和细胞凋亡的影响；采用Western blot分析LBH589(10、20、50 nmol/L)作用MM1R细胞24 h后组蛋白H4乙酰化的程度.结果表明,LBH589单药及与硼替佐米联合均能够抑制MM1R细胞增殖,并与药物浓度和作用时间呈正相关.MM1R细胞经药物作用48 h后,G0/G1期细胞逐渐增多,G2/M期及S期细胞逐渐减少,细胞阻滞在G0/G1期,同时可见MM1R细胞的凋亡率增加,作用呈浓度依赖性,且LBH589与硼替佐米联合作用均较单药作用更加明显(均P ＜0.001)；Western blot分析显示,不同浓度LBH589作用MM1R细胞24 h后组蛋白H4乙酰化的程度上调,呈浓度依赖性.结论:LBH589能够抑制MM1R细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,且与硼替佐米联合对骨髓瘤细胞有协同作用.
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LBH589联合多烯紫杉醇对人卵巢癌卵巢癌细胞Akt、mTOR和p70S6K蛋白表达的影响
目的 观察新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589联合多烯紫杉醇(DCT)对人上皮性卵巢癌细胞细胞IGROV-1 Akt、mTOR、p70S6K蛋白表达的影响,探讨LBH589联合DCT诱导IGROV-1细胞凋亡的分子机制.方法 采用不同浓度LBH589、DTX或两者联合处理IGROV-1细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力,Western blot方法检测卵巢癌细胞IGROV-1 Akt、mTOR、p70S6K蛋白表达水平.结果 LBH589、DTX均能抑制IGROV-1细胞增殖,诱导凋亡,小剂量LBH589联合DTX作用更强.经Calcusyn软件分析证明两者联合具有明显的协同作用.Western blot结果显示LBH589联合DCT处理的IGROV-1细胞的Akt、mTOR、p70S6K蛋白水平均明显低于对照组.结论 Akt、mTOR、p70S6K通路可能在LBH589联合DCT诱导IGROV-1细胞凋亡中起作用.
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依维莫司和LBH589对耐药急性髓系白血病细胞增殖、凋亡及多药耐药相关蛋白表达的影响
目的 探讨雷帕霉素衍生物依维莫司(RAD001)或联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对耐药急性髓系白血病细胞株HL-60/ADM细胞增殖、凋亡和逆转耐药的影响.方法 采用不同浓度RAD001或联合LBH589处理HL-60/ADM细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活力,Hoechst33342染色法和AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡、阿霉素摄取率和多药耐药相关蛋白1(MRP1)表达评估逆转耐药效应.进一步检测处理前后细胞信号通路蛋白变化,探讨其机制.结果 10～50 μmol/L RAD001均能够抑制HL-60/ADM细胞增殖、诱导凋亡,在作用48和72 h时30 μmol/L药物浓度达到大抑制效果,进一步增加药物浓度细胞增殖抑制率并没有明显增加(P＜0.05).不同浓度RAD001和LBH589联合处理HL-60/ADM细胞,没有明显的协同抑制增殖作用[协同指数(CI)≥1.0].10 μmol/LRAD001处理HL-60/ADM细胞可以明显下调细胞表面MRP1表达(93.90%±4.20%比79.10%±3.28%,P＜0.05),提高HL-60/ADM细胞阿霉索蓄积率(8.53%±0.68%比15.37%±1.46%,P＜0.01).深入机制研究表明,RAD001可以阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路活性,通过上调P53抑制MRP1蛋白的活性.结论 RAD001与LBH589联合没有协同抑制HL-60/ADM细胞增殖作用.但RAD001单药能够有效抑制HL-60/ADM细胞增殖,诱导凋亡,通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞MRP1蛋白的表达,提高细胞阿霉素摄取率而逆转耐药.
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LBH589或联合硼替佐米逆转髓系白血病耐药及其分子机制研究
目的 探讨新一代组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米逆转急性髓系白血病(AML)细胞耐药效应及其分子机制.方法 耐药AML细胞株HL-60/ADM和难治性AML原代细胞与不同浓度LBH589、硼替佐米或两者联合进行体外培养,采用MTT法检测细胞增殖活力,Hoechst33342染色和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,用阿霉素摄取率并结合细胞增殖抑制率评估逆转耐药效应.进一步检测处理前后细胞MRP1及信号通路蛋白变化.结果 LBH589、硼替佐米均能够抑制HL-60/ADM和难治性AML原代细胞增殖,诱导凋亡,其中21 nmol/LLBH589和12 nmol/L硼替佐米联合时作用强,经Calcusyn软件分析证明两者联合具有明显的协同作用(CI值分别为0.531和0.498).联合组MRP1阳性率为(57.78±3.34)%,显著低于LBH589、硼替佐米单药组[(76.06±5.17)%和(71.83±4.53)%,P值均＜0.05],而单药组与对照组之间差异也有统计学意义(P值均＜0.01).联合组细胞内阿霉素摄取率为(64.81±3.69)%,明显高于单药组[(28.96±2.52)%和(37.29±3.71)%](P值均＜0.05).LBH589联合硼替佐米可以明显抑制磷酸化Akt和磷酸化IKKα/β蛋白的表达,降低PI3K/Akt/NF-κB通路的活性,明显上调P53蛋白的表达,抑制NF-κB P65、Bcl-2、XIAP和MRP1蛋白活性,促进Caspase-8、Caspase-3和PARP的裂解激活.结论 LBH589、硼替佐米能够抑制耐药AML细胞增殖和促进凋亡,并逆转耐药,两者联合具有明显的协同作用.PI3K/Akt/NF-κB信号传导通路受抑或阻断可能是其主要的作用机制.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对多发性骨髓瘤复发、难治患者骨髓单个核细胞的抑制作用
目的 探讨单用LBH589或联合硼替佐米及地塞米松对多发性骨髓瘤复发、难治患者骨髓单个核细胞的作用.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,检测LBH589(15、25、50)nmol/L及50 nmol/L分别联合硼替佐米(15、25)nmol/L及地塞米松(5、10)μmol/L对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞作用24,48 h后的细胞增殖影响;采用流式细胞术测定LBH589对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞细胞周期及细胞凋亡的影响;用Westernblot测定LBH589(15、25、50 nmol/L)对复发、难治患者骨髓单个核细胞作用24 h后组蛋白H4乙酰化的变化程度.结果 单用LBH589或联合硼替佐米及地塞米松均能够使复发、难治患者骨髓单个核细胞增殖受到抑制,且与药物剂量和时间变化呈正比例.药物作用于MM复发、难治患者骨髓单个核细胞48 h后,G0/G1期细胞逐渐增加,G2/M期及S期细胞则逐渐降低,细胞在G0/G1期发生阻滞,可观察到细胞凋亡现象,且凋亡程度与药物剂量变化呈正比例,三药联合作用均较单药作用更加显著(P均<0.01);Westernblot测定显示,不同浓度LBH589对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞作用24 h后组蛋白H4乙酰化的程度上调,且与药物剂量变化呈正比例.结论 LBH589能够使MM复发、难治患者骨髓单个核细胞增殖受到抑制,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡,且三药联合对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞有加强抗瘤细胞作用.
关键词： LBH589 MM复发、难治患者骨髓单个核细胞 组蛋白乙酰化 -
LBH589调控Th17/Treg平衡抑制免疫性肝损伤的实验研究
目的 建立大鼠免疫性肝损伤模型,探究Th17/Treg平衡状态与疾病进展的相关性及LBH589对Th17/Treg失衡的免疫调控.方法 将雌性Wistar大鼠随机分为慢性肝损伤模型组(CC组)、干预组(LBH组)和健康对照组(HC组)3组.尾静脉注射刀豆蛋白A(ConA)建立动物模型.生化法检测肝功能,ELISA法检测肝脏纤维化指标,取肝脏做病理分析,流式细胞分析术(FCM)检测Th17细胞和Treg细胞频率变化;ELISA法检测外周血IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β等相关细胞因子的质量浓度,免疫组化法检测肝脏局部IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β、Foxp3、RORγt蛋白表达情况.结果 与HC组比较,CC组肝功受损,纤维化指标(HA、TIMP-1)水平升高(P＜0.05),肝脏结构破坏,Th17细胞频率及细胞相关因子(IL-17、IL-6等)水平升高(P＜0.05),Treg细胞频率及细胞相关因子(TGF-β、IL-10、Foxp3等)水平显著升高(P＜0.05),Th 17/Treg比值较HC组下降(P＜0.05).LBH589干预后,与CC组相比,LBH组肝功、纤维化指标(HA、TIMP-1)水平及肝脏病理明显改善,差异有统计学意义(P＜0.05);与CC组相比,LBH组Th17细胞频率及细胞其相关因子(IL-17、IL-6等)水平下降,Treg细胞频率及细胞相关因子(TGF-β、IL-10、Foxp3等)水平也下降,但Th 17/Treg比值较CC组上升(P＜0.05).体外试验中,与对照组相比,各LBH治疗组IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β等相关细胞因子的含量显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)并呈现剂量依赖关系.结论 大鼠慢性肝损伤中,存在Th 17/Treg失衡,LBH589可以纠正Th17/Treg失衡状态,对肝脏进行免疫调控,抑制肝病的发展.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589体外诱导人多发性骨髓瘤细胞株U266凋亡及其机制
目的 研究新一代组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂LBH589单药或联合中药禹州漏芦含药血清对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株U266诱导凋亡作用及其机制.方法 利用免疫印迹技术(Western blot)分析不同浓度LBH589作用HDAC6特异底物α-微管蛋白乙酰化水平;采用免疫沉淀(IP)法检测不同浓度LBH589作用后热休克蛋白90(HSP90)与其客户蛋白的亲和力.结果 Westernblot分析显示不同浓度LBH589(0、20、50 nmol/L)单药及50 nmol/L与禹州漏芦含药血清(1g/ml)联合均能够抑制U266细胞增殖,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,α-微管蛋白乙酰化水平、HSP90乙酰化的程度逐渐上调,变化呈剂量依赖性(P＜0.05),且LBH589与禹州漏芦含药血清联合组抑制作用较单药组明显(均P＜0.05).结论 LBH589能够抑制MM细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导人MM细胞株U266凋亡.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589逆转多发性骨髓瘤细胞耐药机制的体外研究
目的 探讨新一代组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589作用于多发性骨髓瘤(MM)耐药细胞产生的相关基因表达变化,分析其逆转MM细胞耐药的机制.方法 采用Western blot法分析LBH589单药(0、20、50 nmol/L)及50 nmol/LLBH589联合5μmol/L地塞米松作用MM1R细胞24h后组蛋白H4乙酰化的表达程度及bcl-X基因的表达变化.采用实时荧光定量PCR分析LBH589(0、20、50 nmol/L)及50 nmol/L LBH589联合5μmol/L地塞米松分别作用MM1R细胞24、48 h后TOSO基因的表达变化.结果 Western blot分析显示不同浓度LBH589单药及联合地塞米松作用MM1R细胞24 h后随着药物浓度的升高,组蛋白H4乙酰化的程度逐渐上调[(0.205±0.008)％、(0.346±0.009)％,(0.580±0.053)％、(0.986±0.012)％,F=992.957,P=0.032]；bcl-X基因的表达则逐渐下调[(1.210±0.160)％、(0.930±0.036)％、(0.730±0.017)％、(0.488±0.029)％,F=56.432,P=0.028],变化呈剂量依赖性,且联合组的作用效果强于单药组(均P＜ 0.05).实时荧光定量PCR分析显示不同浓度LBH589单药及联合地塞米松作用MM1R细胞24、48 h后随着药物浓度的增加和时间的延长,TOSO基因的表达逐渐下调[24 h:(1.00±0.00)％、(0.55±0.01)％、(0.47±0.01)％、(0.38±0.01)％,F=1006.344,P=0.040;48 h:(1.00±0.00)％、(0.39±0.04)％、(0.05±0.01)％、(0.03±0.00)％,F=2383.977,P=0.045],变化呈剂量-时间依赖性,且联合组的作用效果强于单药组(均P＜0.05).结论 组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589通过影响bcl-X及TOSO基因的表达,恢复MM1R对地塞米松的敏感性,促进组蛋白乙酰化,诱导细胞凋亡,达到治疗肿瘤的目的.
