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人caveolin-1基因慢病毒过表达载体构建及其对SMMC7721细胞凋亡的影响
目的 构建人caveolin-1基因慢病毒过表达载体,并研究其对人肝细胞癌株SMMC7721细胞凋亡的影响. 方法 应用慢病毒载体系统构建人caveolin-1基因pGC-FU-caveolin-1过表达质粒,并转导SMMC7721细胞,检测其转导效率、细胞内caveolin-1 mRNA和蛋白水平的改变和对细胞凋亡的影响. 结果 pGC-FU-caveolin-1过表达质粒慢病毒转导SMMC7721细胞72 h的转导效率为(96.3±1.6)%.转导72 h和120 h后caveolin-1 mRNA水平分别是阴性慢病毒感染组的(30.15±1.22)倍和(189.16±28.13)倍,两个时相点的差别均具有统计学意义(P<0.05).同期转导后120 h的蛋白水平检测明显升高.pGC-FU-caveolin-1过表达质粒慢病毒转导SMMC7721细胞120 h后能使早期细胞凋亡数减少约70%,两者差别具有统计学意义(P<0.05). 结论 成功构建的pGC-FU-caveolin-1过表达质粒慢病毒能在SMMC7721细胞中长期稳定表达,其过表达能显著抑制SMMC7721细胞凋亡.
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人notch1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定
目的 构建人notch1-shRNA慢病毒表达载体,为Notch信号通路的相关研究奠定基础.方法 根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pENTR/U6质粒,通过与pLenti6/BLOCK-iT-DEST载体的LR重组,构建notch1-shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导入293FT细胞,包装成慢病毒.用该慢病毒感染人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western blot法检测细胞notch1基因的表达.结果 目的 序列成功连接于载体并包装成较高滴度的慢病毒,细胞mRNA和蛋白质的检测均表明构建的notch1-shRNA慢病毒表达载体LR-ND-A能显著抑制SH-SY5Y细胞notch1基因的表达.结论 成功构建人notch1-shRNA慢病毒表达载体.
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乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定
目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的重组慢病毒载体pRRLsincPPT-hPGK-X-IRES-eGFP-WPRE(pRRL-X),并感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,以验证其在体外的感染效率.方法 采用PCR技术扩增出HBV X基因的DNA片段,用IN-Fusion技术构建表达载体pRRL-X并鉴定,jet-PEI转染试剂与三质粒共转染293T细胞后浓缩、计算慢病毒颗粒的滴度;用慢病毒液感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,120 h后初步观察慢病毒颗粒的感染情况.Real-time PCR和Western blot法检测细胞HBV X基因的表达.结果 成功构建HBV X基因的慢病毒表达载体质粒pRRL-X.经293T细胞包装后,用慢病毒感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,120 h后被感染的细胞内可见强弱不等的荧光.结论 成功构建HBV X慢病毒表达载体.
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慢病毒载体的研究进展
基因治疗作为一种相对理想、高效、特异的治疗手段，已成为治疗肿瘤和遗传病等难治性疾病的有效方法。目前，基因治疗已成为生命科学领域重要的研究之一。在2008年基因治疗的临床试验中，65％用于癌症，9％用于心血管疾病，8％用于单基因病，7％用于传染病，2％用于神经性疾病及眼部疾病［1］。目前用于基因治疗的载体大多数为病毒载体，要求能够严格控制目的基因表达，并确保治疗的有效性和减少毒副作用。以I型人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus type‐1，HIV‐1）为代表的慢病毒载体因其可感染非分裂细胞、免疫反应小、长期表达及安全性好等优点，同时人类细胞是该病毒的天然宿主，有着其他载体不可比拟的优势，因此非常适于体内基因治疗，现已成为基因治疗的首选载体系统。笔者就慢病毒载体及其在基因治疗中的研究进展作一综述。
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顺铂对沉默β-catenin的卵巢癌SKOV3增殖、凋亡的影响
目的:通过沉默Wnt/β-catenin信号转导通路的核心蛋白β-catenin,探讨顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的影响,为卵巢癌的耐药逆转提供新思路.方法:用包含β-catenin基因特异RNA序列的慢病毒转染人卵巢癌SKOV3细胞,沉默β-catenin蛋白表达.分组:SKOV3组、SKOV3-neg组(转染空载体)、SKOV3-RNAi组(转染β-catenin-RNAi慢病毒).Western blot法检测转染前后SKOV3细胞中β-catenin蛋白的表达.12.5μg/ml顺铂作用48h后,用MTT法检测顺铂对各组SKOV3细胞增殖抑制率的影响；流式细胞术检测各组中SKOV3细胞的凋亡率.结果:(1)Western blot结果显示,SKOV3-RNAi组中β-catenin蛋白表达水平显著低于SKOV3-neg和SKOV3组(P＜0.05).(2)相同浓度顺铂作用下,SKOV3-RNAi组的增殖抑制率显著高于SKOV3组及SKOV3-neg组(P＜0.05),而后两组的增殖抑制率无显著差异(P＞0.05).(3)流式细胞术检测结果显示,SKOV3-RNAi、SKOV3-neg和SKOV3组的细胞凋亡率分别为(18.8±4.3)％、(1.8±0.3)％、(1.9±0.3)％,SKOV3-RNAi组凋亡率显著高于其余两组(P=0.008 ＜0.05).顺铂作用后,SKOV3-RNAi、SKOV3-neg和SKOV3组的细胞凋亡率分别为(67.7±2.5)％、(33.3±2.6)％、(32.3±2.1)％；顺铂作用后,各组凋亡率均显著升高(P均＜0.05),且SK-OV3-RNAi组凋亡率显著高于其余两组(P=0.000＜0.05).结论:沉默β-catenin蛋白能有效增强SKOV3对cDDP的敏感性,β-catenin有可能成为逆转卵巢癌化疗耐药的治疗靶点.
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沉默IGF-1R表达对子宫内膜癌化疗敏感性的影响及其相关机制研究
目的:将慢病毒载体表达的靶向IGF-1R的干扰片段转染子宫内膜癌细胞HEC-1B,探讨转染前后HEC-1B对顺铂化疗敏感性的改变及可能的潜在机制.方法:构建IGF-1R基因RNAi慢病毒载体,转染HEC-1B细胞并检测转染效率,Real-time PCR及Western blot检测转染前后IGF-1R基因及相关蛋白的表达情况,采用MTT及流式细胞仪分析转染前后细胞增殖率及凋亡的改变.结果:慢病毒载体的转染效率高达78％,转染特异IGF-1R siRNA使内源性IGF-1R mRNA降低85％(P＜0.05),蛋白降低91.4％(P＜0.05)；Akt及Erk的磷酸化水平降低,分别是总Akt及Erk的(17.48±3.31)％与(11.55±3.27)％(P＜0.05)；转染前后的细胞暴露于不同浓度的顺铂作用48h,当顺铂浓度从10μmol/L增加到40μmol/L时,转染特异IGF-1R siRNA的细胞凋亡率从(22.21±4.63)％增加到(41.92±2.5)％(P＜0.05)；顺铂的IC50值从21.85μmol/L降到10.58μmol/L(P＜0.05),同时伴随着cleaved caspase-9的表达增强(P＜0.05).结论:沉默IGF1R的表达通过抑制下游信号通路的传导,增强子宫内膜癌对顺铂化疗敏感性.
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慢病毒介导的EZH2靶向RNA干扰对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响
目的:通过慢病毒介导的EZH2-shRNA干扰载体,沉默人卵巢癌SKOV3细胞中果蝇zeste基因的人类同源物(EZH2)的表达,探讨靶基因EZH2对卵巢癌细胞增殖的影响.方法:设计含EZH2基因序列的shRNA慢病毒干扰载体,转染人卵巢癌SKOV3细胞株；利用CCK-8比色法检测EZH2基因沉默后对SKOV3细胞增殖的影响；利用RTPCR、Western blot分别检测EZH2、PCNA mRNA及蛋白的表达情况.结果:EZH2-shRNA 载体感染SKOV3细胞后,可显著抑制SKOV3细胞生长(P＜0.05),并下调EZH2、PCNA mRNA和蛋白的表达(P均＜0.05),而在空白对照组和空载体转染组中,无抑制作用.结论:沉默EZH2基因可抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖,可能是一种新的基因治疗方法.
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慢病毒载体及其在肿瘤基因治疗中的研究应用
慢病毒载体(LV)是逆转录病毒载体中的特殊成员,已成为当前基因治疗载体研究的热点.研究表明LV可使目的基因稳定表达于肿瘤细胞,在消化系统、血液系统及妇科肿瘤等基因治疗中作为转运工具发挥了重要作用,为肿瘤基因治疗提供了新途径.
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AMPK过表达慢病毒载体的构建及稳定转染肺癌A549细胞株的建立
目的 通过构建表达载体,建立稳定转染腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的肺癌A549细胞株,观察过表达AMPK后对A549细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 扩增AMPK全长序列,双酶切目的基因并插入GV358载体,共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集慢病毒上清液后感染A549细胞,建立稳定过表达AMPK的A549细胞株.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting检测AMPK的表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)及Transwell法检测A549细胞增殖、侵袭能力的变化.结果 经限制内切酶鉴定及测序分析,成功构建了GV358-AMPK慢病毒表达载体质粒.与转染空载体相比,转染GV358慢病毒载体的A549细胞AMPK蛋白表达升高5.87倍(P=0.002),mRNA水平升高16.12倍(P ＜0.001);A549细胞过表达AMPK后,第4～5天细胞增殖活性显著降低(第4天:0.53±0.03∶0.64±0.05,P=0.021;第5天:0.58±0.04:0.80±0.07,P=0.002),侵袭能力显著减弱[(1.6±0.5) ×105∶(3.4±0.3) ×105,P =0.004].结论 成功构建了AMPK慢病毒表达载体和稳定表达A549细胞株,过表达AMPK可抑制A549细胞增殖及侵袭能力.
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慢病毒导入的CDC2582 siRNA对胰腺癌细胞CFPAC-1生物学行为的影响
目的利用已构建成功的、在人胰腺癌细胞株CFPAC-1中稳定抑制细胞分裂周期25同源体B(CDC2582)的重组慢病毒,建立CDC2582表达降低的细胞株,以研究该基因的作用.方法将产生CDC2582小干扰RNA(siRNA)分子的、携带绿色荧光蛋白的重组慢病毒感染CFPAC-1细胞后,用流式细胞仪筛选稳定表达的细胞株.应用RT-PCR和Western blot分别对细胞中CDC2582的mRNA和蛋白表达水平进行分析.应用MTT法、流式细胞仪、平板克隆形成和Transwell小室法分别检测其对细胞增殖、周期、细胞克隆形成能力和迁移侵袭能力的影响.结果 CDC2582 siRNA显著下调CFPAC-1细胞中CDC2582的表达,所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率,CFPAC-1细胞的增殖能力、克隆形成能力以及迁移侵袭能力显著增强,细胞周期无明显改变.结论 CDC2582基因可显著影响胰腺癌CFPAC-1细胞的增殖、克隆形成和迁移能力,为利用CDC2582所介导的信号通路进行肿瘤基因治疗提供了实验依据.
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特异性针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒载体的构建
目的 以小鼠VEGFa基因为靶基因,构建携带短发夹状干扰RNA(siRNA)的慢病毒载体.方法 设计并合成三对包含靶序列和一对针对无关序列的互补寡核苷酸链,克隆到pRNAT-U6.2/Lenti质粒;从小鼠NIH/3T3细胞扩增、纯化VEGFa cDNA,构建pCDNA-VEGF质粒;实验分6组,pCDNA-VEGF质柱或/和siRNA慢病毒质粒共转染NIH/3T3细胞,筛选有效siRNA慢病毒表达质粒;将筛选siRNA慢病毒表达质粒和pRNAT-Negative质粒与慢病毒包装质粒混合物混合,共转染293T细胞,48h后收集上清.结果 成功构建针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒质粒和质粒pCDNA-VEGF;慢病毒质粒有效抑制pCDNA-VEGF质粒增加NIH/3T3细胞VEGFa表达水平,pRNAT-siR-NA3抑制作用明显,VEGFa mRNA和蛋白表达分别下降80.O%和66.3%;纯化慢病毒滴度均为1×108 ifu/mL.结论 成功设计、筛选、生产针对小鼠VEGFa基因沉默的特异性siRNA慢病毒.
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晚期糖基化蛋白产物受体在帕金森病发病中的作用
目的 研究晚期糖基化蛋白产物受体(RAGE)在帕金森病(PD)模型小鼠发病中的作用.方法 将30只雄性C57BL/6小鼠随机分成正常对照组、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)组与MPTP+ RAGE-siRNA组,每组10只.MPTP、正常对照组分别腹腔注射MPTP、生理盐水,连续5周;MPTP+ RAGE siRNA组提前1周向黑质定位注射RAGE-siRNA慢病毒,后续处理同MPTP组.应用免疫印迹方法检测小鼠黑质中RAGE、酪氨酸单氧化酶(TH)及环氧合酶-2(COX-2)蛋白的表达.结果 与正常对照组比较,MPTP组小鼠黑质中RAGE、COX-2蛋白的相对表达量明显增高(F=62.25、17.83,q=14.92、8.15,P＜0.01),TH蛋白的相对表达量明显下降(F=8.87,q=5.85,P＜0.01);与MPTP组比较,MPTP+ RAGE-siRNA组RAGE、COX-2蛋白的相对表达量明显降低(q=10.75、5.47,P＜0.01),而TH蛋白表达明显升高(q=4.58,P＜0.05).结论 RAGE可能通过炎症机制参与PD发病,针对RAGE的靶向治疗有望成为未来PD的治疗策略.
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靶向G蛋白偶联受体91的小发夹RNA慢病毒载体的构建及功能初步检测
目的 构建靶向大鼠G蛋白偶联受体91(G protein-coupled receptor 91,GPR91)基因的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,探讨GPR91受体对高糖诱导下血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)释放的调节作用.方法 设计合成4对针对大鼠GPR91(NM_001001518)的特异性单链寡核苷酸链,两端分别引入Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点,退火后得到小片段带黏性末端的双链DNA,克隆入慢病毒载体pGCSIL-GFP,行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA测序鉴定重组体.将各慢病毒shRNA干扰载体和辅助包装载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并行浓缩滴度检测.将各慢病毒载体转染RGC-5细胞后,Western blot法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体.使用45 mmol· L-1的高糖刺激RGC-5细胞24 h,用ELISA法观察干扰GPR91后VEGF的表达情况.结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGCSIL-GFP-shGPR91构建正确;包装病毒颗粒后,pGCSIL-GFP-shGPR91-1、2、3、4组病毒浓缩液的滴度依次为1.5×109 TU·mL-1、1.5×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1、3.0×109 TU · mL-.将慢病毒颗粒感染RGC-5细胞后,Western blot检测显示NC组GPR91蛋白(0.60±0.08)空白组(0.62±0.07)的表达无明显差异(F =49.03,P＞0.05).而与空白组相比,4个慢病毒载体组(0.48±0.05、0.34±0.06、0.30±0.04和0.11±0.06)均能不同程度沉默GPR91的表达,差异有统计学意义(F=49.03,P＜0.01),其中pGCSIL-GFP-shGPR91-3干扰效率高.ELISA结果显示空白组、高糖组、高糖+NC组、高糖+pGCSIL-GFP-shG-PR91-3组VEGF蛋白表达分别为(25.63±4.52) pg·mL-、(72.74±8.24) pg·mL-、(71.68±8.31)pg· mL-1和(46.77±6.21)pg·mL-1,表明GPR91病毒干扰载体可显著降低高糖引起的VEGF分泌,差异有统计学意义(F=30.852,P＜0.01).结论 本实验成功构建了靶向大鼠GPR91的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装.所构建的慢病毒载体能够降低高糖作用下的VEGF表达,为进一步研究GPR91基因在糖尿病视网膜病变中的作用机制和动物基因治疗奠定基础.
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稳定沉默Rictor表达的前列腺癌CWR22RV1的构建
目的 应用RNA沉默技术下调前列腺癌CWR22RV1细胞株的Rictor基因表达,并筛选具有稳定转染Rictor-shRNA的细胞株,为进一步研究Rictor在前列腺癌中的作用打下基础.方法 针对Rictor基因设计合成siRNA序列;鉴定、测序并转染293T细胞观察基因表达情况;构建Rictor-shRNA慢病毒载体;进行Rictor-shRNA慢病毒包装及滴度测定;筛选稳定表达Rictor-shRNA的前列腺癌CWR22RV1细胞株;Western blot检测稳定转染前列腺癌CWR22RV1细胞株Rictor的表达水平.结果 Rictor-shRNA慢病毒成功包装后转染前列腺癌CWR22RV1细胞,进行嘌呤霉素筛选,获得沉默Rictor基因的前列腺癌CWR22RV1细胞株,Western blot检测显示该细胞株Rictor水平明显降低(P＜0.01).结论 成功构建了稳定沉默Rictor表达的前列腺癌CWR22RV1细胞株,为后续的实验了打下坚实的基础.
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慢病毒介导的shRNA靶向干扰β-catenin神经母细胞瘤稳定细胞株的建立
目的 建立稳定抑制β-eatenin基因表达的入神经母细胞瘤BE2C细胞株,为探讨Wnt/-eatenin信号在神经母细胞瘤发生中的作用提供细胞模型.方法 使用Real-time PCR、Westernblot的方法检测BE2C细胞中β-catenin在基因及蛋白水平的表达.于β-catenin基因编码区选择4个siRNA靶点及1个非编码序列(NC)合成5对shRNA干扰序列,分别与质粒PgLV-H1-GFP+ Puro载体连接,构建重组质粒；将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染BE2C细胞,筛选出干扰效果佳的shRNA序列,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株.RT-PCR、Western blot检测干扰组β-catenin抑制效率.结果 RT-PCR、Western blot检测显示BE2C细胞中β-catenin在基因及蛋白水平均有较好的表达；慢病毒的滴度达到1×108 TU/ml时,侵染BE2C细胞的效率可达到90％左右；通过RT-PCR和Western blot检测结果显示G1为有效的干扰靶点；通过嘌呤霉素筛选得到稳定靶向干扰β-catenin细胞株,抑制效率可达约90％.结论 成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制β-eatenin基因表达的人神经母细胞瘤BE2C细胞株,为进一步研究β-catenin在神经母细胞瘤发生中的作用提供了可靠的细胞模型.
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EGFL7基因RNAi重组慢病毒的构建及其对喉癌细胞侵袭的抑制
目的:构建类表皮生长因子域7( EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒,观察其对喉癌体外侵袭的抑制作用.方法:筛选确定的EGFL7基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pLV载体连接产生LV-sh EGFL7慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用重组慢病毒体外转导喉癌细胞,Western blot法检测喉癌细胞EGFL7蛋白表达.Boyden侵袭小室法实验观察转导shRNA后的喉癌细胞侵袭能力的变化.利用克隆形成实验检测EGFL7基因沉默对Hep-2细胞集落形成能力的影响.结果:成功构建EGFL7的慢病毒载体LV-sh EGFL7,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×108 TU/L.转导siRNA的喉癌细胞EGFL7蛋白表达阴性.EGFL7 siRNA转导后喉癌胞体外侵袭能力下降.EGFL7基因沉默组细胞克隆集落形成率与Hep-2组细胞及空载体组细胞比较,细胞克隆集落形成率显著减低.结论:成功构建人EGFL7基因RNAi慢病毒载体,EGFL7基因沉默对喉癌细胞体外侵袭有明显的抑制作用.沉默EGFL7后,Hep-2细胞集落形成能力显著减低,即下调EGFL7基因表达可在一定程度上抑制喉癌细胞的锚着不依赖性增殖能力.
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MMP-9小干扰RNA重组慢病毒抑制喉癌体内生长的实验研究
目的:探讨重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因沉默对喉鳞状细胞癌移植瘤生长的抑制作用.方法:构建喉癌移植瘤模型,采用RNA干扰技术,瘤内沣射MMP-9-RNAi-Lentivirus重组慢病毒,以空病毒载体作为对照,观察抑瘤效果.运用Western-blot方法检测移植瘤中MMP-9蛋白表达.运用免疫组织化学方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.评估其对细胞增殖的影响.结果:重组慢病毒MMP-9-RNAi-Lentivirus治疗后,治疗组裸鼠移植瘤平均重量为(1.484±0.391)g,明显小于对照组(2.618±0.465)g(P＜0.05).治疗组肿瘤平均体积为(1.177±0.270)cm3,明显小于对照组(2.034±0.366)C1TI.(P＜0.05),抑瘤率为43.32%.Western-blot结果显示治疗组MMP-9蛋白表达阴性7例,弱阳性3例,对照组MMP-9蛋白表达均阳性.免疫组织化学显示治疗组PCNA指数为(55.41±8.77)%,显著低于对照组(77.04±6.91)%(P＜0.05).结论:MMP-9-RNA-Lentivirus重组慢病毒能有效抑制喉痛移植瘤生长及增殖.
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慢病毒介导的GSK-3β基因稳定沉默表达的SH-SY5Y细胞系建立
目的 构建靶向糖原合成激酶3 β(GSK-3 β)基因的RNA干扰慢病毒载体,建立其对GSK-3 β基因沉默表达的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的细胞系模型.方法 根据GSK-3 β mRNA序列设计合成靶向目的基因的短发夹状RNA(shRNA)序列并构建慢病毒表达载体,经酶切和测序鉴定,将慢病毒重组载体与包装载体共转染293T细胞,获得纯化浓缩病毒液,侵染SH-SY5Y细胞,采用绿色荧光示踪观察细胞的转染情况,设为慢病毒干扰组(实验组)、阴性对照组(Lenti-NC组)、空白对照组(Blank组),利用qRT-PCR和Western blot法检测GSK-3β mRNA和蛋白表达水平.结果 成功构建了靶向GSK-3β的shRNA慢病毒,重组慢病毒转染人SH-SY5Y细胞,72 h后观察转染效率达90％以上,与对照组比较,靶基因变化结果显示,实验组中GSK-3 βmRNA和蛋白的表达均显著降低(均P＜0.01).结论 有效建立慢病毒介导的GSK-3β基因稳定沉默表达的SH-SY5Y细胞模型,为体外评价研究GSK-3β沉默后药物或行为治疗AD提供试验工具细胞模型.
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粒-巨噬细胞集落刺激因子与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体构建
目的:构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体.在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-GM-CSF导入病毒包装细胞293T,荧光显微镜检测基因的表达,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩,鉴定.用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测转染FUGW-GM-CSF细胞上清液GM-CSF表达水平,电子显微镜观察293T细胞中的慢病毒.结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的GM-CSF/PCR产物与GenBank中的数据完全吻合;GM-CSF准确克隆入FUGW的多克隆位点.慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞,荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光.转染FUGW-GM-CSF包装细胞上清液GM-CSF酶联反应阳性.电子显微镜下见慢病毒颗粒位于293T细胞胞浆的内质网中.结论:成功构建了GM-CSF与GFP融合基因慢病毒载体,为诱导DC提供了适合的稳定转染的载体.
关键词： 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 绿色荧光蛋白 慢病毒属 -
shRNA慢病毒转染串珠素对大鼠硬膜外瘢痕中成纤维细胞增殖能力的影响
目的 通过研究经shRNA慢病毒转染串珠素的大鼠硬膜外瘢痕组织成纤维细胞的增殖能力,探讨其对硬膜外瘢痕组织形成的影像. 方法 30只Wistar大鼠行椎板切除术,建立模型,于培养4周后提取硬膜外瘢痕组织.通过组织块贴壁法培养硬膜外瘢痕组织中的成纤维细胞并将细胞分为3组:未转染组(空白对照组)、荧光蛋白(GFP)慢病毒转染组(GFP组)和shRNA慢病毒转染组(shRNA组,内含GFP).成纤维细胞转染成功后,分别通过Western-blot、荧光定量PCR及MTT法检测3组的成纤维细胞的RNA、蛋白质表达及细胞增殖的差异. 结果 Western-blot检测显示shRNA组串珠素蛋白明显低于空白对照组和GFP组.荧光定量PCR检测显示shRNA组串珠素RNA表达低于空白对照组和GFP组.MTT检测显示0h各组吸光度(A)值差异均无统计学意义(P＞0.05),24 ～ 96 hshRNA组吸光度值(A)低于空白对照组和GFP组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 经shRNA慢病毒转染串珠素能抑制大鼠硬膜外瘢痕组织成纤维细胞的增殖.
