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痰液标本结核分枝杆菌RNA恒温扩增检测的应用价值
目的 探讨恒温扩增检测法在检测肺结核患者痰液标本结核分枝杆菌RNA中的应用价值.方法 选取2015年12月至2016年12月就诊的60例肺结核患者作为试验组,并选取60例非结核性肺部感染患者作为对照组.比较恒温扩增法、痰培养法及痰涂片抗酸染色法对两组痰液标本中的结核分枝杆菌RNA的检测结果.结果 试验组中恒温扩增法、痰培养法、痰涂片抗酸染色法对肺结核患者的痰液标本阳性检出率分别为53.33％(32/60)、38.33％(23/60)、35.00％(21/60),恒温扩增法的阳性检出率高于痰培养法和痰涂片法,差异有统计学意义(P<0.05).恒温扩增法对痰培养阳性患者的检测率高于对痰涂片抗酸染色阳性患者的检测率[95.65％(22/23)比85.71％(18/21)],差异有统计学意义(P<0.05).结论 恒温扩增检测法对痰液标本中结核分枝杆菌RNA的阳性检测率较高.
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恒温扩增HPV检测技术应用于子宫颈癌筛查的效果评价研究
为了评价人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)恒温DNA扩增检测技术用于高危型HPV检测和宫颈癌早期及癌前病变筛查的准确性和可行性.本研究于2016年6月至8月,在我国内蒙古地区招募2 774例30～64岁有性生活史的妇女进行宫颈癌筛查;采用薄层液基细胞学技术完成细胞学诊断.采用恒温DNA扩增HPV检测技术(Isomega)和第二代杂交捕获技术(Hybrid Capture 2,HC2)平行检测宫颈标本;对于Isomega检测为HPV16/HPV18阳性的标本和两种方法检测不一致的标本,使用线性探针法(INNO-LiPA)进行分型验证.以病理诊断为金标准,评价Isomega用于筛查宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)2级及以上患者的灵敏度和特异度.结果表明,Isomega与HC2检测高危型HPV的总一致率为92.72％ (Kappa=0.74),阳性一致率为86.78％,阴性一致率为93.77％;以INNO-LiPA分型结果为标准,Isomega检出HPV16和HPV18的准确率分别为96.97％和86.11％.以病理诊断为金标准,Isomega筛查CIN2+的灵敏度和特异度分别为87.76％和82.94％.Isomega能准确检测HPV16、HPV18和其他高危型别HPV,有较高的筛查灵敏度和特异度.
关键词： 宫颈癌 人乳头状瘤病毒(HPV) 筛查 恒温扩增 -
切刻内切酶介导恒温扩增技术条件优化
目的 采用切刻内切酶介导恒温扩增技术(nicking enzyme mediated isothermal amplification,NEMA)扩增蜡样芽孢杆菌质粒,考察缓冲体系、温度、离子浓度等条件对扩增效率的影响.方法 通过独特的引物设计,采用NEMA技术扩增蜡样芽孢杆菌质粒,通过系列实验优化了缓冲体系、温度和离子浓度等条件,采用琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.结果 通过设计不同长度片段的扩增产物,证明采用NEMA技术进行恒温扩增引物设计的正确性.扩增反应中,缓冲体系的组成、扩增温度、体系镁离子及二甲基亚砜(DMSO)的浓度会影响切刻内切酶恒温扩增效率,而海藻糖添加与否在本实验中与扩增效率无关.在优条件下,NEMA恒温扩增方法对于蜡样芽孢杆菌质粒的灵敏度达到1.7 pmol/L.结论 NEMA可以用来进行较长片段的扩增,有望成为一种常规的恒温扩增技术,应用到战时或者应急条件下的快速核酸诊断中.
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恒温扩增试纸条法快速检测痰标本中结核分枝杆菌
目的 评价恒温扩增试纸条法快速检测痰标本中结核分枝杆菌的试验效果,寻求更简便、快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法,评估结核分枝杆菌恒温扩增试纸条法在基层实验室应用的可行性.方法 采用痰涂片抗酸染色法、罗氏培养法和恒温扩增试纸条法对痰标本中的结核分枝杆菌进行检测,对3种方法的检出率进行比较,并采用PNB试验对培养阳性菌株进行菌型鉴定.结果 恒温扩增试纸条法检测痰标本中结核分枝杆菌的检出率高(18.40％),罗氏培养法次之(14.41％),痰涂片抗酸染色法的检出率低(9.09％);恒温扩增试纸条法与培养法比较的灵敏度为100.00％ (65/65),特异性为99.34％ (368/386);恒温扩增试纸条法检测痰结核分枝杆菌的灵敏度和特异性均为100.00％.结论 恒温扩增试纸条法检测痰结核分枝杆菌具有快速、敏感、特异等优点,并可对结核分枝杆菌复合群进行确认,技术操作简便,所需仪器设备简单,适于在基层实验室推广.
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志贺菌依赖解旋酶DNA恒温扩增技术建立
目的 利用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA),建立一种快速检测志贺菌(Shigella)的新方法.方法 根据志贺菌的ipaH基因序列设计特异性引物,优化反应体系和反应条件；并对方法进行特异性和灵敏度评价.结果 对21株实验菌株检测,3株志贺菌均为阳性,其余18株非志贺菌均为阴性,灵敏度为5.1×103 cfu/mL,与普通PCR方法检测结果相当.结论 HDA法检测志贺菌具有特异、灵敏及仪器要求低等特点,具有广阔的应用前景.
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核酸恒温扩增-免疫层析技术在布鲁菌病诊断中的应用
目的:探讨核酸恒温扩增-免疫层析检测方法对布鲁菌病(布病)诊断的应用价值,为核酸检测标准化推广应用提供实验室参考依据.方法:分别以全血和血清为样本提取布鲁菌核酸,应用恒温扩增技术进行核酸扩增,以免疫层析检测装置直接判读核酸扩增结果；免疫学检测应用试管凝集试验(SAT)；数据处理应用配对校正x2检验.结果:29例就诊者全血核酸扩增阳性率为55.2％,血清核酸扩增阳性率为23.1％,二者比较差异有统计学意义(P＜0.05)；以全血为核酸提取样本,190例不同病程SAT诊断为阳性和阴性的就诊者核酸检测结果与SAT检测结果符合率为57.9％；93例首诊SAT诊断为阳性和阴性的急性早期就诊者核酸检测结果与SAT检测结果符合率为63.4％.结论:核酸恒温扩增-免疫层析检测方法作为一项实验室辅助诊断和治疗的参考依据,对急性早期的布病患者具有较高的临床应用价值,在鉴别诊断布病患者和非患者方面无参考价值.
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恒温扩增技术及其在病原生物学应用中的研究进展
核酸扩增是为重要的生物技术之一.目前,PCR是应用范围广的体外核酸扩增技术,但该技术需要温度循环仪器才能扩增目的基因,因此限制了其在基层和现场的应用.随着分子生物学技术的发展及其与相关交叉学科的结合,新的扩增技术相继出现,其中以恒温扩增技术为主导.按是否直接扩增目的基因,恒温扩增技术可分为靶核酸直接扩增技术和信号放大技术.该文就恒温扩增技术及其在病原生物学中的应用作一综述.
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恒温扩增-核酸试纸在副溶血性弧菌快速检测中的应用
副溶血性弧菌是广泛分布于沿海地区的海洋性细菌,为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一.由于副溶血性弧菌传统的培养方法繁琐、费时[1],为了实现快速检测目前常采用实时荧光定量PCR技术[2-3],该方法虽然特异、敏感、快速,但由于需要昂贵的荧光定量PCR检测设备,难以在基层医疗单位尤其是乡一级卫生院开展.恒温扩增技术是近年继PCR技术后发展起来的一种新的体外核酸扩增技术[4-6],浙江省CDC建立了交叉引物恒温扩增副溶血弧菌核酸,并结合核酸试纸条显色来判定检测结果,整个反应过程不需打开反应管盖子,杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性.
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三向连接构造组合引物介导的滚环扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立
目的：建立三向连接构造（3WJ）组合引物介导的滚环扩增（ PG-RCA）技术检测肠道病毒71型（ EV71）的方法，并验证其检测效果。方法根据EV71的VP1基因保守区设计引物模板、引物以及环状探针前体，确立反应体系及反应条件，实时荧光PCR仪监测扩增结果。采用已建立的3WJ组合PG-RCA技术检测16例手足口病患儿咽拭子标本（ EV71阳性12例、柯萨奇病毒A阳性2例、柯萨奇病毒B阳性2例）。结果已建立的3 WJ组合PG-RCA技术能检测到amol级的EV71 RNA，说明方法建立成功。 EV71阳性标本扩增曲线荧光强度均超过阈值；柯萨奇病毒A、B阳性标本扩增曲线荧光强度均低于阈值。结论成功建立3WJ组合PG-RCA技术检测EV71的方法，检测效果好。
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食源性疾病监测中副溶血性弧菌现场快速检测方法的建立与应用
目的 建立食源性病原菌副溶血性弧菌的快速检测方法,应用于基层实验室食源性暴发疫情病原的现场快速检测.方法 采用恒温扩增-核酸试纸条方法、荧光定量PCR和典型生化联合筛检法对239份临床样本、152份食品样本进行平行检测比较.通过标准菌株试验,观察方法的敏感性与特异性.结果 用恒温扩增-核酸试纸条法、实时荧光定量PCR法、典型生化联合筛检法同时对239份临床患者腹泻样本和152份食品样本进行检测,结果临床样本的阳性检出率均为11.72％,食品样本的阳性率分别为19.73％、20.39％、20.39％,3种方法的阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).3种检测方法的食品检测、特异性试验结果差异均无统计学意义(P＞0.05),但敏感性试验结果检测下限恒温扩增-核酸试纸条法、实时荧光定量PCR法均为10-5稀释度(菌量22 cfu/ml),典型生化联合筛检法为10-4稀释度(菌量186 cfu/ml).结论 恒温扩增-核酸试纸条方法具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、仪器简单等优点,可应用于基层实验室的现场快速检测.
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一种新型检测乙型肝炎病毒核酸方法的建立
目的:建立一种新型快速检测乙型肝炎病毒核酸(HBVDNA)的方法.方法:根据乙肝病毒S保守区设计3对引物进行乙肝病毒DNA切口酶核酸恒温扩增,产物在密封装置中进行试纸条的显色反应,根据显色深浅进行定量.结果:恒温扩增试纸条技术检测血清HBVDNA的特异性100%,敏感度达到100拷贝/毫升.结论:恒温扩增试纸条法检测时间短,不受接收标本时间限制随时可以检测,特异性强,敏感度高,不需昂贵的定量PCR检测仪,便于更多医院检验科的开展.
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恒温滚环扩增技术检测肠道病毒71型
目的:建立一种三向连接构造(three-way junction formation,3WJ)组合引物介导的滚环扩增技术(primer generation-rolling circle amplification,PG-RCA)检测肠道病毒71型(EV71). 方法:根据EV71 VP1基因保守区设计3WJ模板T、3WJ引物P以及环状探针CP前体. 对EV71进行恒温滚环扩增,检测患者咽拭子中EV71. 结果:建立的新的滚环扩增技术能检测到amol级的合成RNA,检测临床标本时特异性强、敏感度好. 结论:3WJ组合PG-RCA恒温滚环扩增技术检测肠EV71特异性强、敏感性好、不需昂贵的PCR荧光检测仪,便于基层医院开展.
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恒温扩增芯片法在下呼吸道病原体检测中的应用
目的 评价恒温扩增芯片法在下呼吸道感染病原体检测中的效果.方法 收集合格痰标本94例,通过恒温扩增芯片法和细菌培养法检测病原体,痰涂片抗酸染色、RNA恒温扩增,静脉血γ干扰素释放试验检测结核分枝杆菌.结果 42例标本通过恒温扩增芯片法检测到病原体,阳性率44.7%.主要病原体为流感嗜血杆菌(13株)、肺炎链球菌(10株)、铜绿假单胞菌(9株)、结核分枝杆菌(8株)、金黄色葡萄球菌(6株)、肺炎克雷伯菌(7株)、大肠埃希菌(4株)、嗜麦芽窄食单胞菌(4株)、鲍曼不动杆菌(1株)、衣原体(1株),未检测到肺炎支原体、嗜肺军团菌.结论 恒温扩增芯片法操作简便、快速,可同时检测12种病原体并可筛选耐甲氧西林葡萄球菌的mecA基因.其对流感嗜血杆菌、肺炎链球菌检出率显著高于传统细菌培养法,对结核分枝杆菌的检测显著优于γ干扰素释放试验和涂片抗酸染色.该技术有利于下呼吸道感染的快速诊断和及时地针对性治疗.
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交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用
目的：探讨交叉引物扩增技术（CPA）快速检测系统在结核病诊断中的价值。方法收集唐山市第四医院2015年3～5月206例结核病就诊患者的痰液标本，其中肺结核患者95例（其中痰涂片阳性26例，阴性69例），非结核患者111例，分别采用RT‐PCR法实时荧光定量聚合酶链反应法（RT‐PCR）检测标本中的结核分枝杆菌，对结果进行统计分析。结果涂片法、罗氏培养法、EasyNAT ? TB‐CPA 法检测初诊疑似肺结核患者痰液的灵敏度分别为：27．37％（26／95）、50．53％（48／95）、56．84％（54／95）、51．58％（49／95）。以罗氏培养结果为诊断金标准，EasyNAT ? TB‐CPA 法灵敏度为89．58％（43／48），特异度94．94％（150／158）；RT‐PCR法的灵敏度为83．33％（40／48），特异度94．30％（149／158）；EasyNAT ? TB‐CPA与 RT‐PCR法相比，总体一致性为98．54％（203／206）， Kappa指数值为0．92。结论 TB‐CPA法在检测痰液标本中具有较高的临床应用价值，且方法简便、快速。
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环介导恒温扩增技术在百日咳鲍特菌检测中应用研究进展
核酸扩增技术是病原微生物检测的重要武器,其中聚合酶链反应(PCR)技术已经在临床检验中广泛应用.与PCR 相比,环介导恒温扩增(LAMP)技术具有操作简便,快速灵敏,对仪器和样本质量要求低等优点,尤其适合病原微生物的即时检验.
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重组酶聚合酶扩增在铜绿假单胞菌检测中的应用
目的 建立一种优化的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法,用于临床快速检测铜绿假单胞菌. 方法 (1)提取1株铜绿假单胞菌标准菌株DNA模板,采用PCR、实时荧光定量PCR和RPA进行检测,统计3种方法检测的加样时长、扩增时长和检测时长.(2)取1株铜绿假单胞菌标准菌株,复苏摇菌后逐次稀释为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1 ×102、1×101集落形成单位(CFU)/mL7个浓度梯度,以恶臭假单胞菌为阴性对照,分别提取DNA模板,进行RPA、实时荧光定量PCR及PCR,分析3种方法检测铜绿假单胞菌的灵敏性.(3)取1株铜绿假单胞菌标准菌株和4株阴性对照菌(金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、白色念珠菌和恶臭假单胞菌),分别提取DNA模板,行RPA、实时荧光定量PCR及PCR,分析3种方法检测铜绿假单胞菌的特异性.(4)取28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株、1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株,以恶臭假单胞菌为阴性对照,分别提取DNA模板,行RPA.观察上述菌株是否出现阳性扩增信号,并计算其检出率.所有实验重复3次.采用GraphPad Prism 5.01统计软件对灵敏性结果进行分析. 结果 (1)RPA、PCR和实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌的加样时间均为20 min,其中PCR扩增98 min,凝胶检测20 min,共计138 min;实时荧光定量PCR扩增和检测可同步完成,需90 min,共计110 min;RPA中扩增和检测也可同步完成,需15 min,共计35 min.(2)3种检测方法中恶臭假单胞菌均未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果.实时荧光定量PCR和PCR中铜绿假单胞菌检测下限为1×101 CFU/mL,RPA中铜绿假单胞菌检测下限为1×102 CFU/mL.RPA、实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌浓度越高,出现阈值时间越短、循环数越少,即检测到阳性扩增信号的时间越短.实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌浓度为1×101～1×107 CFU/mL时,均能检测到阳性扩增信号.RPA中,铜绿假单胞菌浓度为1×101 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为0;浓度为1×102 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为67％;浓度为1×103～1×107 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为100％.(3)RPA、PCR和实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果,鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及恶臭假单胞菌4种阴性对照菌未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果.(4)RPA中,28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株及1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株均出现阳性扩增信号,恶臭假单胞菌未出现阳性扩增信号;29株临床铜绿假单胞菌阳性扩增信号检出率为100％.结论 本研究建立的优化的铜绿假单胞菌RPA快速检测方法,耗时短,灵敏性及特异性强,对临床快速检测铜绿假单胞菌感染具有重要应用价值.
