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金属β内酰胺酶基因blaNDM重组酶聚合酶扩增方法的建立
目的 建立一种基于重组酶聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)扩增方法金属β内酰胺酶基因blaNDM的快速检测方法,为广泛耐药菌基因类型的确定提供技术支持.方法 遵照重组酶聚合酶扩增引物和探针设计原则,以blaNDM基因特异性序列为靶基因,设计相应的RPA扩增引物和探针.取梯度稀释已知拷贝数的DNA模板和致病菌核酸样品进行各扩增体系的RPA扩增实验,分析扩增体系的敏感性、特异性和重复性特征以便筛选和评价blaNDM基因的RPA扩增体系.结果 3组扩增体系的引物和探针能够有效的扩增靶基因,检出限达到2×102 copys/反应,与其他细菌样品无非特异性扩增反应,能够在2～7 min内实现靶基因有效扩增.结论 建立了金属β内酰胺酶基因blaNDM的重组酶聚合酶扩增体系,该反应迅速,检出限较低,具有较高的特异性,适用于耐药菌的现场检测.
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等温扩增法用于孕妇B族链球菌感染筛查的研究
目的 建立可用于快速筛查孕妇B族链球菌(GBS)的等温扩增法. 方法 培养GBS并提取基因组DNA.根据其cfb基因设计LAMP(环介导等温扩增)和RPA(重组酶聚合酶扩增)反应引物,进行目的基因扩增.采集临床标本50份,同时用两种方法进行检测,评价方法的特异性和敏感性. 结果 LAMP可在45 min完成基因扩增,RPA法可在15 min完成目的基因的扩增.二者均具有高度敏感性和特异性,低检出浓度均为0.01 ng DNA/μl.检测50份临床标本LAMP法4份阳性,RRP法5份阳性(其中1份假阳性). 结论 LAMP和RPA均不依赖特定仪器,在恒温条件下即可完成目的基因扩增,以LAMP方法操作更简单、快速,特异性更高,可用于女性孕期GBS感染筛查.
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重组酶聚合酶扩增结合横向流体试纸条快速检测人腺病毒
目的 建立一种快速、敏感的人腺病毒等温核酸扩增检测方法.方法 针对人腺病毒hexon基因保守区序列设计特异性重组酶聚合酶扩增(RPA)引物及探针、优化反应时间和温度、用横向流体试纸条(LFD)和毛细管电泳检测扩增产物,建立人腺病毒RPA-LFD快速检测方法,评价该方法的敏感度和特异性并与Real-time PCR法比较.结果 RPA-LFD方法检测人腺病毒的低检出限为2拷贝DNA分子/反应,且与其他呼吸道病原无交叉反应,临床样本检测结果与Real-time PCR法一致性为100％.结论 建立的RPA-LFD方法具有敏感性、特异性高、快速且不需要昂贵的仪器设备等优点,为人腺病毒快速检测提供了新工具.
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重组酶聚合酶扩增在铜绿假单胞菌检测中的应用
目的 建立一种优化的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法,用于临床快速检测铜绿假单胞菌. 方法 (1)提取1株铜绿假单胞菌标准菌株DNA模板,采用PCR、实时荧光定量PCR和RPA进行检测,统计3种方法检测的加样时长、扩增时长和检测时长.(2)取1株铜绿假单胞菌标准菌株,复苏摇菌后逐次稀释为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1 ×102、1×101集落形成单位(CFU)/mL7个浓度梯度,以恶臭假单胞菌为阴性对照,分别提取DNA模板,进行RPA、实时荧光定量PCR及PCR,分析3种方法检测铜绿假单胞菌的灵敏性.(3)取1株铜绿假单胞菌标准菌株和4株阴性对照菌(金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、白色念珠菌和恶臭假单胞菌),分别提取DNA模板,行RPA、实时荧光定量PCR及PCR,分析3种方法检测铜绿假单胞菌的特异性.(4)取28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株、1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株,以恶臭假单胞菌为阴性对照,分别提取DNA模板,行RPA.观察上述菌株是否出现阳性扩增信号,并计算其检出率.所有实验重复3次.采用GraphPad Prism 5.01统计软件对灵敏性结果进行分析. 结果 (1)RPA、PCR和实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌的加样时间均为20 min,其中PCR扩增98 min,凝胶检测20 min,共计138 min;实时荧光定量PCR扩增和检测可同步完成,需90 min,共计110 min;RPA中扩增和检测也可同步完成,需15 min,共计35 min.(2)3种检测方法中恶臭假单胞菌均未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果.实时荧光定量PCR和PCR中铜绿假单胞菌检测下限为1×101 CFU/mL,RPA中铜绿假单胞菌检测下限为1×102 CFU/mL.RPA、实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌浓度越高,出现阈值时间越短、循环数越少,即检测到阳性扩增信号的时间越短.实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌浓度为1×101～1×107 CFU/mL时,均能检测到阳性扩增信号.RPA中,铜绿假单胞菌浓度为1×101 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为0;浓度为1×102 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为67％;浓度为1×103～1×107 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为100％.(3)RPA、PCR和实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果,鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及恶臭假单胞菌4种阴性对照菌未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果.(4)RPA中,28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株及1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株均出现阳性扩增信号,恶臭假单胞菌未出现阳性扩增信号;29株临床铜绿假单胞菌阳性扩增信号检出率为100％.结论 本研究建立的优化的铜绿假单胞菌RPA快速检测方法,耗时短,灵敏性及特异性强,对临床快速检测铜绿假单胞菌感染具有重要应用价值.
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重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测拟态弧菌
根据编码拟态弧菌不耐热溶血素(Vibrio mimicus heat-labile hemolysin,VmhA)的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增(RPA)特异性引物,建立拟态弧菌vmhA基因的RPA检测方法并测试其特异性、灵敏度和应用效果.结果显示,建立基于RPA的检测方法特异性好,能够从拟态弧菌中扩增得到467 bp的特异性条带,仅需在37℃下恒温反应40m in,不需要特殊的仪器设备;对比RPA和PCR两种检测方法的灵敏度一致,均达到0.1 ng/μL.应用检测结果也表明该方法与传统培养方法相当.因此,本研究建立的RPA方法检测vmhA特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室快速检测.
