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伏马菌素B1免疫检测方法的研究
本研究建立了用于检测粮食、饲料中伏马菌素B1(FB1)的快速、灵敏、简便的免疫检测方法-建立在单克隆抗体基础上的直接竞争性酶联免疫吸附测定方法(DC-ELISA法);其低检出浓度为10ng/ml,线性范围在10ng～5μg/ml.对新疆、安徽、黑龙江、哈尔滨四省市玉米样品中的FB1含量进行了测定,结果表明156份样品中有34份检出FB1,阳性率为21.79%,含量在0.18～31.32μg/g范围内,平均含量为12.04μg/g.
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抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备及试剂盒的研制
目的为了能够快速检测粮谷类食品中伏马菌素B1的污染水平,研制具有我国自主知识产权的针对伏马菌素B1快速检测试剂盒.方法制备了能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了敏感、特异、快速的酶联免疫吸附试验检测方法,终形成具有中国自主知识产权的伏马菌素B1快速检测试剂盒.结果该试剂盒所用单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,亲和常数为8.3×10-8mol/L.该抗体与其他结构类似物无明显交叉反应,具有较高的特异性.试剂盒对伏马菌素B1低检出限5ng/ml,标准曲线的线性范围(50～500ng/m1),回归方程Y=-0.582X+1.793(r=0.99,P＜0.05);对玉米作50ng/ml,200ng/ml和500ng/ml 3个加标浓度的回收率在71.89%～112.95%之间;试剂盒在常温状态下有效期至少10个月;实验室内的变异系数和实验室间的变异系数均小于20%.
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常见镰刀菌素与细胞凋亡的研究进展
某些常见镰刀菌素如伏马菌素B1、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯酮-X可以诱导多种细胞发生凋亡,如肝细胞、肾细胞、胃肠细胞、免疫细胞和传代细胞.这些镰刀菌素诱导细胞凋亡的机制较为复杂,可能与神经鞘氨醇、某些基因如P21、蛋白激酶、CAMP信号系统、细胞内Ca2+水平等许多因素有关.
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毛细管电泳-化学发光联用法检测粮食中的伏马菌素B1
目的 建立一种基于毛细管电泳-化学发光联用法检测粮食中伏马菌素B1的快速检测方法.方法 基于伏马菌素B1对鲁米诺-三价银[Ag(Ⅲ)]化学发光体系有抑制作用,结合毛细管电泳分离技术,对检测方法进行优化,选择5×10-3 mol/L硼砂为电泳缓冲溶液,鲁米诺浓度为2×10-3 mol/L,Ag(Ⅲ)浓度为3×10-5 mol/L溶解于0.01 mol/L NaOH.结果 经过条件优化后进行试验,伏马菌素B1的线性范围为1～ 200 μg/ml,检出限(S/N=3)为1 μg/ml.对200μg/ml的伏马菌素B1进行8次平行测定,其出峰时间和峰高的相对标准偏差分别为2.64％和7.86％.结论 该方法操作简便、快速、准确可靠,可用于伏马菌素B1的检测,适用于玉米中伏马菌素B1的测定,结果比较理想.
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生物毒素和中毒控制中常见毒物快速测定技术研究简介
为改变生物毒素和中毒控制领域常见毒物的检测缺乏快速、灵敏、简便技术的现状,选择该领域有代表性的难新问题进行攻关.分别建立了检测粮油食品中AFB1的2个ELISA方法,低检出浓度分别为0.01μg/kg和0.1 μg/kg,回收率均在80%以上,同时研制出拥有我国自主知识产权的2个AFB1 ELISA试剂盒,建立了2条年产量分别为1.5万盒和2000盒的生产线.建立了检测河NFDA8鱼中河豚毒素的直接和间接ELISA方法,低检出浓度分别为0.1 μg/L和1 μg/L,回收率均高于70%.研制出基于直接法的河豚毒素 ELISA试剂盒,筛选出了国产可食的河NFDA8鱼种.建立了检测粮食中伏马菌素B1的ELISA方法,低检出浓度为5 μg/L,回收率75.24%～117.65%,研制出检测伏马菌素B1的ELISA试剂盒.建立了食品和中毒样品中亚硝酸盐、甲醇等20种毒物的快速检测方法,所建方法与国标法相比检测结果差异无显著性,但检测时间缩短50%以上、检测成本降低80%～95%.自行设计研制出便携式智能化微型光电比色仪和光反射传感器,与建立的20种毒物快速检测技术配套使用,实现了中毒样品的现场智能化、自动化快速定量检测.研制出携带方便、便于中毒现场使用的毒物检测箱,建立了一条年产量2000套的生产线.整个课题申请专利5项,批准2项;获奖2项;产生2项国家标准和1项企业标准.在国内外杂志上共发表文章28篇.快速检测技术各项指标均达到国际同等、国内领先水平.
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抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备和特性
目的:建立敏感、特异和快速的针对伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA)检测方法,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒.方法:利用B细胞杂交瘤技术,建立能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果:用伏马菌素B1-牛血清白蛋白(FB1-BSA)偶联物免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立了1个稳定分泌抗伏马菌素B1毒素抗体的杂交瘤细胞株,命名为5A9.将杂交瘤细胞打入BALB/c小鼠腹腔,获得含抗伏马菌素B1毒素单克隆抗体的腹水,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化,得到单克隆抗体.该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为2.56×106,参考工作浓度为3.2×105.纯化后抗体的IgG含量为10.4 g/L,亲和常数为8.3×10-8 mol/L.该抗体与其他结构类似物无交叉反应,具有较高的特异性.结论:制备了具有高特异性和亲和力的抗伏马菌素B1单克隆抗体,初步形成了针对伏马菌素B1的ELISA检测试剂盒.
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伏马菌素B1对BALB/c小鼠的亚急性经口毒性研究
目的 研究伏马菌素B1(FB1)对BALB/c小鼠的亚急性经口毒性.方法 将30只健康SPF级BALB/c小鼠按体重随机分为三组,分别为对照(去离子灭菌水)组和0.75、7.50 mg/kg FB1染毒组,每组10只,雌雄各半.采用经口灌胃方式进行染毒,染毒容量约为0.04 ml/g,每天1次,连续染毒28 d.观察小鼠的一般情况,检测血液学指标(全血白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白含量、红细胞比积、血小板计数、白细胞分类),生化学指标[血清(丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE))],观察主要脏器的病理学改变并计算脏器系数.结果 观察期内,小鼠未出现中毒和死亡现象.各组小鼠未出现体重、进食量和食物利用率的变化.各组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、睾丸和子宫系数间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,7.50 mg/kg FB1染毒组雌性小鼠的血清ALT和AST活力均升高(P＜0.05).对于雄性动物,7.50 mg/kg FB1染毒组的白细胞计数降低(P＜0.05),红细胞计数升高(P＜0.05);而对于雌性动物,0.75 mg/kg FB1染毒组的中性粒细胞百分比降低和淋巴细胞百分比上升,7.50 mg/kg FB1染毒组的中性粒细胞降低及单核细胞百分比升高.另外,7.50 mg/kg FB1染毒组小鼠出现肝脏病理学改变,其余脏器病理学组织观察未见异常.结论 伏马菌素B1对小鼠具有肝毒性,且雌性小鼠比雄性小鼠更为敏感.
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伏马菌素B1的毒性研究进展
伏马菌素B1是国际癌症研究机构认定的2B类致癌物.伏马菌素B1是由串珠镰刀菌产生的毒性代谢产物,是一种真菌毒素,广泛分布于世界范围内的玉米中,严重危害人类健康,成为全球性公共卫生问题.文章综述了伏马菌素B1引起实验动物的各类毒性,包括肝毒性、肾毒性、遗传毒性、生殖发育毒性和致癌性,并对伏马菌素B1的代谢进行了概述,对其毒性机制进行了展望.
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伏马菌素B1免疫学检测方法的建立
目的建立应用单克隆抗体的伏马菌素B1(fumonisin B1,FB1)间接竞争酶联免疫吸附检测方法.方法利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗FB1单克隆抗体,建立FB1间接竞争酶联免疫吸附方法.结果建立稳定分泌抗FB1毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分泌的抗体为IgG1亚类,分子量150KD,腹水稀释度为1:2.0×108,亲和常数为6.72×109L/mol.FB1间接竞争酶联免疫吸附方法的低检出浓度为5μg/L,校正曲线的线性范围50～500μg/L,线性方程Y=-0.582X+1.793(r=0.99,P＜0.05);与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素均无交叉反应.回收率71.89%～112.95%,平均回收率100.23%.结论所建立的检测方法具有快速、简便、灵敏的特点,可满足实际工作需要.
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伏马菌素B1单抗ELISA检测试剂盒研制
目的 研制快速检测粮食中伏马菌素B1(FB1)的试剂盒.方法 在制备抗FB1单克隆抗体基础上,利用间接竞争酶联免疫吸附方法研制FB1快速检测试剂盒.结果 该试剂盒低检出浓度为5 ng/ml,校正曲线线性范围50～500 ng/ml,线性方程Y=-0.582X+1.793(r=0.99,P＜0.05).与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素均无交叉反应.回收率在71.89%～112.95%之间,平均回收率为100.23%.试剂盒常温下可保存225 d,实验室内的变异系数和实验室间变异系数均＜20%.结论 该试剂盒快速、简单、灵敏,可满足实际工作需要.
关键词： 伏马菌素B1 酶联免疫吸附试验(ELISA) 单克隆抗体 -
高效液相色谱法测定粮食中伏马菌素B1
目的 建立伏马菌素B1(FB1)的高效液相色谱检测方法;了解辽宁地区玉米产品中FB1的污染状况.方法 利用强离子交换固相提取柱(SPE柱)净化样品提取液,选用C18反相柱,以甲醇:NaH2PO4为流动相,流速1 ml/min;荧光检测器检测.结果 1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml 3个加标浓度的回收率在71.77%～102.68%之间,平均回收率为84.72%,总变异系数为12.17%.检测78份玉米样品,阳性率为32.05%,阳性样品中FB1平均含量为(0.74±0.05)μg/g.结论建立了用高效液相色谱法检测FB1的方法;本实验检测结果提示辽宁地区玉米样品的FB1污染率较低.
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伏马菌素B1单抗制备及其ELISA方法的研究
目的 建立应用单克隆抗体的伏马荫素B1(FB1)的间接竞争酶联免疫吸附检测方法.方法 利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗FB1单克隆抗体,建立FB1间接竞争酶联免疫吸附方法.结果 制备了稳定分泌抗FB1毒素单克隆抗体的杂交瘸细胞株,分泌的抗体为IgGl亚类,亲和常数为6.72×109L/mol.该方法低检出浓度为5μg/L,校正曲线的线性范围50～500 μ/L,线性方程Y=-0.582X+1.793(r=0.99,P<0.05).回收率在71.89%～112.95%之间,平均凹收率为100.23%.实验室内的变异系数和实验室间的变异系数均小于20%.结论 分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株稳定,检测方法快速、灵敏、特异.
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伏马菌素B1免疫学检测方法的研究
目的 制备抗伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)单克隆抗体,在此基础上建立一种可用于定量检测玉米中FB1含量的间接竞争ELISA方法.方法 人工合成免疫原BSA-FB1和包被抗原OVA-FB1,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术制备抗FB1的单抗,并对其特性进行鉴定.以OVA-FB1作为包被抗原,FB1为竞争抗原,两者与一定量的抗FB1单抗竞争反应,建立检测FB1的间接竞争ELISA方法,对玉米样品进行初步检测应用.结果 获得了1株稳定分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞(命名为5H12-C6-C2).对间接竞争ELISA方法进行反应条件优化后,建立了检测FB1的标准曲线,回归方程为y=1.113-0.313x,相关系数R2为-0.990,适可测范围为10ng/ml～1000ng/ml,灵敏度为90.88 ng/nl,低检测限为7.83 ng/ml,方法的批内和批间平均变异系数分别为3.24%和2.45%,样品添加平均回收率为94.32%.结论 成功地制备了抗FB1特异性单抗,建立了FB1的间接竞争ELISA检测方法,为进一步研制FB1检测试剂盒奠定了基础.
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江西省市售大米伏马菌素B1污染现况调查
目的:通过对江西省市售大米中伏马菌素污染情况的检测分析,为相关部门制定防控措施提供理论依据.方法:采用随机抽样方法,抽取江西省从南到北5个市超市的大米,每个市随机抽取3个超市,每个超市至少抽取3份样品,总共63份样品;应用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术,检测大米样品中是否存在伏马菌素B1.结果:所有抽取的样品均未检测到伏马菌素B1.结论:江西省市售大米暂未发现伏马菌素B1的污染,符合国家标准.
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伏马菌素B1检测的免疫芯片技术研究
目的:建立用于伏马毒素B1检测的免疫芯片技术方法.方法:伏马菌素B1(FB1)是一种小分子半抗原,可与牛血清白蛋白(BSA)免疫原载体蛋白偶联为FB1-BSA,成为抗原.在醛基化玻璃片表面固定抗FB1抗体,将待测物FB1与一定量的CY3标记的FB1-BSA同时加到芯片上,采用竞争法实验原理进行免疫芯片的技术研究.结果:伏马毒素B1的低检测限为1μ/ml.结论:对伏马毒素B1进行了免疫芯片的制作,可以实现待测物的测定.
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伏马菌素B1对人结肠腺癌细胞培养倍增时间的影响
目的 观测伏马菌素B1(FB1)对培养细胞倍增时间的影响 ,探讨FB1诱发肿瘤的可能机理.方法 利用荧光分光光度法测定原位溶解的人结肠腺癌培养细胞的DNA,以DNA总量的倍增作为培养细胞数目的倍增,通过比较对照组和FB1处理组DNA倍增的时间,判断出FB1对该细胞株细胞倍增时间的影响.结果 对照组结肠腺癌细胞的倍增时间在39～42小时,FB1处理组细胞的倍增时间为34～36小时.结论 伏马菌素B1可明显缩短人结肠腺癌细胞株的倍增时间.
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食管癌高发区玉米中伏马菌素B1的检测
目的:检测串珠镰刀菌主要代谢产物Fumonisin B1在华北食管癌高发区玉米中的含量并比较高发区和低发区的含量差别.方法:反相高效液相色谱柱前衍生荧光法.结果:正常玉米FB1的阳性率为90.90%,平均含量为1.40±0.50 μg/g.霉变玉米的阳性率为100%,平均含量为88.91±13.07 μg/g.结论:高发区的串珠镰刀菌污染率和FB1含量比较高,可能与食管癌的发生有关.
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赣州市大米中伏马菌素B1的污染状况调查
目的:调查串珠镰刀菌主要代谢产物伏马菌素B1在赣州市大米中的污染状况.方法:采用反相高效液相色谱柱前衍生荧光法检测.结果:赣州市大米中伏马菌素B1的阳性率为100%,污染水平在109.1～1 639.6ng/g之间,平均值为869.7ng/g.结论:赣州市大米中伏马菌素B1污染水平较高,但在瑞士标准范围之内,不会对人体的健康造成危害.
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抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定
目的 建立抗伏马菌素B1(FB1)的单克隆杂交瘤细胞株,制备抗FB1的单克隆抗体(McAb).方法 采用FB1-KLH偶联物小剂量长周期免疫BALB/c小鼠后,采用细胞融合方法获得分泌抗FB1的杂交瘤细胞株,采用多次亚克隆的方法建立了4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株.腹水诱生法获得大量McAb,采用抗体亚类测定试剂盒鉴定抗体的亚类,SDS-PAGE测定抗体分子量,McAb的特异性和灵敏度用间接竞争抑制ELISA.结果 免疫小鼠血清检测结果显示经过5次免疫后血清的效价稳定在1×10-6,经过4次亚克隆后建立4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株,获得腹水,纯化抗体,抗体亚类属于IgG2a类,轻链为κ轻链和重链的相对分子质量分别是55 000和32 000,ELISA检测抗体特异性显示可与FB1发生特异性反应,采用此抗体建立间接竞争抑制ELISA方法的线性范围在2～500 ng/ml.结论 制备了特异性和灵敏度较高的抗FB1单克隆抗体,为建立伏马菌素免疫学检测方法打下良好基础.
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伏马菌素B1特异单链抗体的同源建模及分子对接模拟研究
目的 分析伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)与其特异单链抗体的分子互作模式.方法 通过同源建模构建和优化抗FB1单链抗体的三维结构,结合Procheck和Verify 3D等方法评价得到稳定的抗体模型,利用分子对接研究单链抗体与其抗原FB1的结合特性、疏水性和表面静电力作用.结果 单链抗体的互补决定区参与同其抗原FB1的结合,抗体与抗原之间不仅形成稳定的氢键,疏水性和静电力的匹配也很好.结论 氢键结合力、分子间疏水相互作用和静电力的共同作用,使得单链抗体形成一个能够与FB1高度互补的相互作用区域,并在抗体与抗原的特异性识别及结合稳定性等方面起着关键作用.
