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肝纤维化自发逆转的相关信号转导通路研究
目的 探讨肝纤维化自发逆转过程中不同信号转导通路的改变.方法 通过四氯化碳(CCl4)注射SD大鼠8周,随后停药6周建立肝纤维化自发逆转的动物模型.采用cDNA微阵列杂交、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等检测多种信号通路成员的表达变化.结果 除MAPK/EKR信号通路外,与肝纤维化自发逆转相关的差异表达基因属于数条信号转导通路,包括:SAPK/JNK信号通路中的SAPKβ,Jun B原癌基因、Jun D原癌基因、p53;MEK5信号通路中的MAPKK5;P13K/Akt信号通路中的1,4,5-三磷酸肌醇3-激酶、1,4,5-三磷酸肌醇3-激酶B、HSP90 β、v-akt;Notch信号通路中的PS2.针对SAPK β、MAPKK5、1,4,5-三磷酸肌醇3-激酶及PS2的RT-PCR检测,结果 与cDNA微阵列杂交相吻合.SAPK/JNK及Notch信号通路中的关键基因表达降低,MEK5、P13K/Akt信号通路中的核心激酶表达水平上升,均可能促进肝细胞增殖、抑制其凋亡,从而诱导肝纤维化逆转.结论 SAPK/JNK、MEK5、P13K/Akt及Notch信号通路可能通过协同效应,在肝纤维化的自发逆转过程中发挥重要作用.
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TGF- β -Smad通路在病毒性心肌炎慢性期病毒感染作用机制及卡托普利干预研究
目的 通过实验研究观察TGF-β -Smad转导通路在病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化形成中的作用及卡托普利治疗机制.方法 50只健康雄性Balb/c小鼠中的40只间断多次腹腔注射柯萨奇病毒B3,建立VMC心肌纤维化模型,另外10只注射不含病毒的Eagle's MEM液作为正常对照组.2个月后模型制作成功.存活的小鼠随机分为模型组和卡托普利组.予卡托普利进行治疗,每日灌胃给药1次.45 d后结束,制作病理组织切片、HE染色及Masson染色观察纤维化程度.采用半定量RT-PCR法检测TGF-β1的基因表达.免疫组织化学染色检测小鼠心肌Smad2/3和Smad7蛋白表达情况.结果 感染CVB3后,小鼠心肌出现心肌细胞的变性、坏死,少量炎症细胞浸润,心肌细胞间可见纤维化和钙化,Masson染色可见心肌胶原纤维明显增多.TGF-β1表达水平较正常对照组升高,Smad2/3蛋白表达也升高,而Smad7表达减少,与正常对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 阻断TGF β -Smad通路可能是卡托普利抑制慢性病毒性心肌炎心肌纤维化的机制之一.
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p38 MAPK 信号转导通路研究进展
丝裂原活化蛋白激酶( mitogen activated protein kinase, MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它存在于大多数细胞内,是真核细胞转导细胞外信号到细胞内引起细胞反应的一类重要信号系统.它通过影响基因的转录和调控,进而影响细胞的生物学行为,如细胞增殖、分化、转化及凋亡等 [1].研究发现,其中的 p38 MAPK信号通路参与了细胞的生长发育及细胞间功能同步等多种生理过程,并与炎症、应激反应的调控密切相关,被认为是细胞信息传递的交汇点和共同通路.
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Notch信号串话与肿瘤的关系
Notch信号通路在细胞分化发育过程中起重要作用,许多肿瘤形成都有Notch信号的参与.肿瘤的形成多是多因素共同完成的,研究发现Notch信号与Ras、Wnt、NF-kB、VEGF等的串话在肿瘤的发生、发展中发挥着协同或者拮抗的作用.本文就Notch信号的组成、活化及其串话进行综述.
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气虚血瘀证大鼠子二代大脑中动脉栓塞脑缺血耐受性及ERK信号转导通路的实验研究
目的:观察气虚血瘀证大鼠子二代大脑中动脉栓塞(MCAO)脑缺血耐受性及细胞外信号调节激酶(EPK)信号转导与正常健康同龄大鼠有无差异,研究其是否存在缺血性脑卒中遗传易感性.方法:获取MCAO气虚血瘀证大鼠子二代,并随机选取获取的MCAO气虚血瘀证大鼠子二代10只及随机选取正常同龄大鼠20只,分为3组:正常对照组大鼠予预缺血3rmin,再灌注3天后给予2h的MCAO,再灌注22h后处死；子二代组MCAO气虚血瘀证大鼠予预缺血3min,再灌注3天后给予2h的MCAO,再灌注22h后处死；假手术组正常大鼠利用假手术(SS)代替预缺血,SS 3天后给予2h的MCAO,再灌注22h后处死,模型建立后观察其神经功能缺损评分,免疫组化法检测其缺血脑组织ERK的表达.结果:各组大鼠的神经功能缺损评分存在差异(P＜0.05).组间比较,子二代组大鼠的神经功能损缺评分高于正常对照组,差异有显著性意义(P＜0.05),而与假手术组相比无明显差异(P＞0.05)；正常对照组的ERK蛋白表达均高于假手术组及子二代组,差异有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)；而子二代组的ERK蛋白表达与假手术组相比,差异无显著性意义(P＞0.05).结论:MCAO气虚血瘀证大鼠子二代与正常同龄SD大鼠相比,对脑缺血的耐受性及修复能力降低,其机制可能与其ERK信号转导通路异常有关.
关键词： 大脑中动脉栓塞(MCAO) 气虚血瘀证 大鼠子二代 ERK 信号转导通路 -
ClC-3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究进展
细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程,如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等[1, 2].在低渗环境刺激下,容积激活性氯通道参与细胞容积调节,对维持细胞容积起着重要调节作用.
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肾性高血压大鼠主动脉Gαq介导的信号转导通路的变化
目的:探讨肾性高血压主动脉Gαq介导的细胞信号转导系统的动态变化及其在高血压中的发病学意义.方法:制作两肾一夹肾性高血压大鼠模型,分别于术后周1、2、4和8测定颈动脉血压;血浆血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)活性;免疫印迹法测定主动脉Gαq蛋白含量;以[3H]二磷酸磷脂酰肌醇为底物测定主动脉细胞膜蛋白PLC活性磷脂酶C活性.
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血小板衍生生长因子受体在肾血管性高血压肥大心肌中的变化
目的:探讨血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)介导的信号转导通路在肾血管性高血压引起的心肌肥大中的作用.方法:以二肾一夹(2K1C)高血压大鼠为动物模型,术后2、4、8周以四导生理记录仪观察记录颈动脉血压、左心室±dp/dt max的变化,以左心室湿重与体重之比作为心肌肥大指数衡量心肌肥大程度,以马尿酰-组氨酰-亮氨酸为底物,测定心脏血管紧张素转换酶(ACE)活性的变化,采用免疫印迹法(Western blot)测定心脏PDGF-β的含量.结果:术后2周2K1C组动脉血压明显升高(P＜0.05),4周、8周时动脉血压维持在高水平,心肌肥大逐渐加重,但各组左心室+dp/dtmax无显著差异,表示机体处于心肌肥大的代偿阶段,尚未出现心力衰竭.术后2周,心脏ACE活性为122.40±34.10(μmg·min-1·L-1),与假手术组76.76±20.86相比增加59.46%(P＜0.05),心脏PDGF-β含量为200.52±31.39低于假手术组水平37.30%(P＜0.05),术后4周和8周心脏ACE活性分别为122.65±49.90, 88.18±12.20,与假手术组相比分别增加53.20%(P＜0.01)和4.57%(P＜0.05),心脏PDGF-β含量分别为348.22±64.38,363.39±22.64,分别高于假手术组94.99%(P＜0.05)和69.60%(P＜0.05).结论:血管紧张素Ⅱ除经其偶联的受体引起肾血管性高血压心肌肥大外,还可能通过PDGF受体上调促进肾血管性高血压心肌肥大的发生.
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山莨菪碱对H2O2所致内皮细胞凋亡的保护及其分子机制--对NF-κΒ/I-κΒ信号转导通路的影响
心肌保护不当是婴幼儿心脏术后死亡率较高原因之一.由于婴幼儿与成人在心肌结构、代谢、功能上存在差异,所以临床上采用的ThomasⅡ停搏液可能并不适合婴幼儿心肌.
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葛根素在心肌细胞氧化应激损伤中的保护作用
目的：探讨葛根素（puerarin， Pue）在心肌细胞氧化应激损伤中的保护作用。方法：利用H2O2处理心肌H9c2细胞，建立氧化应激损伤模型。采用激光扫描共聚焦显微镜成像法测定线粒体膜电位。用MTT法观察Pue对细胞增殖的影响。利用Western blotting法检测Pue对GSK－3β和Akt活性的影响。结果：Pue明显减轻H2 O2诱发的心肌细胞线粒体损伤，但是PI3K抑制剂渥曼青霉素对此作用没有影响；Pue能够增加GSK－3β（ Ser9）蛋白的表达，而对Akt （ Ser473）蛋白表达没有明显影响。结论：Pue通过使GSK－3β失活，抑制mPTP的开放，从而减轻氧化应激诱发的心肌细胞损伤，而PI3K／Akt信号转导通路并未参与此过程。
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养血活血解毒及其拆方对PMA诱导人真皮微血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成及相关信号转导通路的影响
目的：通过佛波酯诱导内皮细胞增生体外模拟银屑病新生的病理状态，比较养血活血解毒方及其组分药物血清对人皮肤微血管内皮细胞及相关信号转导通路的干预效应。方法：佛波酯诱导内皮细胞24 h造模，10％中药含药血清作用细胞24 h。采用CCK－8比色法检测全方及拆方药物血清对内皮细胞增殖的影响；Transwell小室法检测药物血清对细胞迁移的影响；Ma－tril胶法用于检测药物血清对内皮细胞管腔形成的影响；采用real－time PCR和Western blot法分别观察药物血清对血管新生相关信号转导通路及产物的影响。结果：养血活血解毒方及其养血活血、解毒组分含药血清均可显著抑制PMA诱导的HDMEC细胞增殖及迁移，其中全方作用强，拆方组均具有一定的抑制作用，但不及全方。仅全方组药物血清可显著抑制细胞的管腔形成，拆方组均无作用。全方可明显降低血管新生相关的VEGF／VEGFR及Ang／Tie2通路蛋白及mRNA表达；而拆方组效果不一，总体趋势不如全方。结论：临床优化组方养血活血解毒方可通过干预银屑病血管新生的病理环节发挥其治疗作用，且中药组方药效作用优于单个拆方组分，为临床科学组方用药提供实验依据。
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LPS对人脐静脉内皮细胞的F-actin和VE-cadherin细胞定位和结构的影响
目 的:应用免疫荧光技术,通过观察人脐静脉内皮细胞株ECV304的F-actin和VE-ca dherin的细胞定位和结构变化,从形态学的角度阐述LPS对内皮细胞的直接作用.方法:将EVC304细胞以1×108/L接种在微孔小皿上,培养至单层铺满皿底开始实验.对VE-cadherin的观察分为正常组、VE-cadherin一抗阴性对照组和LPS l00、200、300、400、500 μg/L刺激组 .LPS各组先用不同浓度的LPS直接刺激细胞30 min,PBS洗3次,2%多聚甲醛固定20 min, 加一抗(Goatpolyclonal l∶100)4℃2 h,而后加VE-cadherin荧光二抗(Rabbit-Anti-Goat-FITC l∶200)4℃ 1 h,PBS洗3次共10 min(避光);对F-actin观察组,先用2%的多聚甲醛、0. 5 %TritonX-100混合PBS液固定和膜打孔20 min、洗涤,罗丹明-鬼笔环肽(2×103 U/ L)染色40 min,P BS洗3次,后用NikonTE300荧光倒置显微镜镜检,Kodak 200胶卷照相.结果:[ HTSS〗1.VE-cadherin的变化:正常组可见内皮细胞间紧密连接处染色轮廓清晰,可见膜内侧有较弱的染色, 胞浆无染色;低浓度的LPS(100、200 μg/L)对VE-cadherln的细胞分布没有明显影响;300 、400、500 μg/L LPS组可看到细胞间紧密连接处染色明显减少,部分视野细胞回缩,有明显的细胞间隙形成,膜内侧有较强的染色;一抗阴性对照组没有染色.2.F-actin的变化:正常组F-actin主要分布在细胞的周边,分布均匀、排列整齐,细胞间连接紧密,没有间隙形成;低浓度的LPS(100、200 μg/L)对F-actin的分布及重组没有明显影响;高浓度的LPS(3 00、400、500 μg/L)刺激后,内皮细胞周边的F-actin基本消失,出现明显的应力纤维(变粗、变短、紊乱,排列呈明显的极向分布),可见伪足,并伴随细胞间缝隙形成.讨论: LPS(脂多糖)是内毒素的活性成分,作用于细胞的机制很复杂,此前众多学者对LPS作用于细胞的信号转导通路做了大量的研究,但是对于LPS直接对内皮细胞刺激的情况下,真正从形态学的角度着手的很少.本实验从形态学入手,结果表明,LPS在体外高浓度的(大于300 μg/L) 直接刺激下,引起骨架蛋白的重组和细胞内的重新分布,具体表现为F-actin排列紊乱,可见伪足,进而细胞间隙形成:VE-cadherin染色部分缺失是细胞间隙形成的直接证据.结论 :高浓度的LPS(大于300 μg/L)通过某种途径直接作用于内皮细胞,可影响F-actin和VE-c adherin的重组和细胞内分布.
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p38 MAPK在LPS诱导的小鼠肺组织诱导性一氧化氮合酶(iNOS)表达中的作用
革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)在导致休克的同时,可以诱导多个器官和组织iNOS及一系列细胞因子的表达和产生,这些介质在休克发生发展过程中起着重要的作用.然而,参与休克过程的细胞和分子机制到目前为止仍属未知.目的:观察LPS诱导小鼠肺组织iNOS 表达的变化趋势及信号转导通路--p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)在内毒素休克发生发展中的调控作用.方法:1)用不同剂量的LPS对小鼠进行不同时间的处理, 收集血液后处死小鼠,取肺组织,液氮速冻保存所有样本,采用Griess法检测血浆一氧化氮(NO)水平,分别用Western blotting和RT-PCR检测肺组织iNOS蛋白和mRNA表达情况.2)复制内毒素休克模型 ,将戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔麻醉的BALB/c小鼠在立体分离显微镜(SMZ-1B,Nikon)下进行一侧颈动脉插管,与4道生理记录仪连接,记录血压.腹腔注射LPS(5 mg/kg),记录血压变化及发生休克的时间.3)用p38 MAPK特异性抑制剂SB 203580(12.5 mg/kg和25 mg/kg, 口服) 对小鼠进行处理1 h后,按前述方法复制休克模型,检测血浆NO水平,iNOS蛋白和mRNA的表达.结果:1)未经LPS处理时,麻醉小鼠平均动脉压为(127.5±9 .0) mmHg;LPS(5 mg/kg)处理后小鼠动脉压呈现双峰型进行性下降,6 h后平均动脉压降到(42.0±3.0) mmHg,导致重度休克.2)血浆硝酸盐和亚硝酸盐(一氧化氮, NO)的浓度, 肺组织中iNOS蛋白及mRNA的表达以及肺组织湿重/干重比值, LPS处理组显著高于对照组.LPS处理4 h后iNOS蛋白和mR NA表达,12-48 h表达显著;其中LPS剂量为20 mg/kg时,在同一观察时间段与其他剂量组相比,iNOS的表达强度大.3)经SB 203580处理1 h后,可以显著降低内毒素休克小鼠血浆NO水平和肺组织湿重/干重比值,并可显著抑制肺组织中iNOS蛋白和mRNA的表达,但是对血压下降并没有显著影响.结论: 1)LPS可诱导小鼠血浆一氧化氮(NO)水平升高,肺组织中 iNOS蛋白和mRNA表达增加,并存在时间和剂量依赖性;2)p38 MAPK信号转导通路可能在内毒素休克肺组织iNOS表达中起重要调节作用,提示可以通过抑制信号转导通路来降低iNOS表达及其它细胞因子的产生,可能对内毒素休克时组织损伤的防治有重要意义.
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p38 MAPK在细胞内的定位及其对LPS刺激的反应
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)转导通路调节着生长、分化、凋亡、细胞周期、应激反应等多种细胞过程.p38通路是新近鉴定的一条MAPK信号转导通路,参与了炎症、应激、细胞周期和凋亡等病理生理过程.蛋白激酶特定的细胞内定位及其在特定刺激作用下的移位是细胞信号维持特异性转导的重要机制之一.为了探讨p3 8信号转导的过程及其特异性机制,本研究应用激光共聚焦显微镜对p38 MAPK 4种不同的亚型在单核细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和内皮细胞在静息和受到不同刺激的条件下的细胞内定位进行了观察,发现未受刺激的静止单核细胞,p38(α)蛋白激酶处于未激活状态,弥漫性地分布于细胞中;单核细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和内皮细胞在受到LPS刺激后,p38( α)由胞浆移位到胞核;LPS 刺激单核细胞15 min后,p38开始出现明显的细胞核移位,于L PS刺激后45 min入核量(核区荧光强度)达到峰值,之后维持于平台期.LPS诱导RAW细胞p 38激酶活性呈一过性增强,在LPS刺激后2 h其活性逐渐恢复到接近基础水平.LPS刺激RAW细胞 p38移位入核明显滞后p38激活过程,提示p38移位后入细胞核依赖于p38磷酸化活化,p38磷酸化活化及由细胞浆移位到细胞核是一系列相继发生的连续事件.用p38-红色荧光蛋白融合表达载体在哺乳动物细胞的转染实验也证实了上述结果.
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HI-SIV和HIVgp120干预CD3/CD4信号转导通路的研究
目的和方法:在HIV感染的早期及无症状的病毒携带者体内CD+4T淋巴细胞对抗原和有丝分裂原刺激缺乏IL-2表达和增殖反应,甚至在CD+4T淋巴细胞进行性减少之前就已经有明显的免疫缺陷.形成这一损伤的确切机制尚不十分清楚,但已有研究证实HIVgp120和CD4分子结合,从而抑制T淋巴细胞抗原受体(TCR)信号转导有关.本研究采用Western Blot及电泳迁移率改变检测法(EMSA)观察了HIVgp120多肽片段和灭活SIV病毒(HI-SIV)对CD3/CD4活化刺激诱导的TCR信号转导通路的影响,了解病毒蛋白作用下淋巴细胞活化信号转导的特征.结果:利用酪氨酸磷酸化的单克隆抗体对全细胞提取物蛋白磷酸化水平的检测结果表明,HIVgp120和HI-SIV对～70 kD、～40 kD组分的磷酸化水平有明显的抑制作用,HIVgp120和HI-SIV都具有阻断CD3/CD4活化刺激诱导的细胞蛋白磷酸化作用.选用抗ERK2(42 kD)抗体对～40 kD、～70 kD组分进行Western blot分析,结果HIVgp120和HI-SIV对ERK活性有明显的抑制作用.利用NF-κB和AP-1结合通用序列研究CD3/CD4活化信号诱导的NF-κB和AP-1活化,HIVgp120和HI-SIV则完全阻断了其活化作用,在转录水平上调控CD3/CD4活化信号.结论:HIVgp120和完整SIV病毒都具有抑制CD4辅佐的刺激活化信号,下调ERK、NF-κB和AP-1活性,抑制～70 kD蛋白的磷酸化水平等作用,从而阻断了TCR的信号转导,可能是导致HIV感染者淋巴细胞功能缺陷的机制之一.
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人参二醇皂苷对"失血-内毒素双打击"大鼠肝脏保护作用与机制的研究
目的:探讨人参二醇皂苷对失血-内毒素打击大鼠肝脏LPS介导的信号转导通路的影响,为人参二醇皂苷临床治疗的应用奠定基础.方法:Wistar大鼠(230-250 g),随机分为假手术对照组(SCG);失血-内毒素双打击组,(HLG);失血-内毒素双打击地塞米松预治疗组(HLDG);失血-内毒素双打击人参二醇皂苷预治疗组(HLPG).①应用"失血-回输-内毒素入血"三种因素相继作用机体的方法,复制大鼠"双打击"模型.大鼠失血性休克1 h后,将放出的1/2血液加等容积的生理盐水缓慢回输,再经腹腔注射LPS(2 mg/kg),复制二次打击模型,观察6 h后处死动物.HLDG和HLPG于腹腔注射LPS前10 min腹腔注射地塞米松(2 mg/kg)和人参二醇皂苷(45 mg/kg).②取肝脏组织,10%中性福尔马林固定,脱水、浸蜡,常规包埋切片,HE染色,光镜观察.③取肝脏组织,提取mRNA和核蛋白,用RT-PCR和Western blotting等方法检测肝脏组织CD14,IκBα,NF-κB,TNFα,II-18的表达.
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EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中通过NFκB促进Igκ表达
利用已建立的受四环素调控LMP1表达的鼻咽癌细胞系,用受CMV启动子调控的NFκB报道基因质粒pNFκB-luc的荧光素酶表达分析NFκB的活性,并以核蛋白的Western印迹方法观察LMP1表达前后核内NFκB组分p65量的改变,用全蛋白Western印迹分析Igκ蛋白质的表达等方法,探讨在鼻咽癌中,EB病毒LMP1蛋白是否通过核转录因子NFκB促进免疫球蛋白κ轻链(Igκ)基因的表达.结果显示在诱导LMP1表达的状态下,NFκB活性增强,NFκB的p65蛋白呈核内聚集现象,Igκ的表达增高,而导入反义LMP1表达质粒后,NFκB活性下降,Igκ的表达减弱;加入硫代磷酸化的反义NFκB p65或p50后,Igκ表达水平下降.因此,在鼻咽癌细胞中,NFκB作为LMP1信号转导通路上的枢纽,可能介导了LMP1对Igκ的表达调控.
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KCa3．1在软脂酸诱导的单核细胞迁移中的作用及其调控机制
目的：观察中电导钙激活钾离子通道（intermediate－conductance Ca2＋－activated K ＋channel， KCa3．1）在软脂酸（palmitic acid， PA）诱导的单核细胞跨内皮迁移中的作用及其调控机制。方法：分离2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells ， PBMCs）并培养人单核细胞株（THP－1 cells），以PA刺激，通过Western blotting、RT－PCR、ELISA及细胞迁移实验观察PA对PBMCs及THP－1细胞跨内皮迁移的影响及其与KCa3．1的关系、KCa3．1与MCP－1之间的关系并探讨其信号转导通路。结果：100μmol／L PA上调体重指数（body mass index， BMI）位于20～27．9 kg／m2的T2DM患者PBMCs KCa3．1的表达并促进其跨内皮迁移，对BMI≥28 kg／m2的T2DM患者PBMCs无影响；KCa3．1特异性阻滞剂TRAM－34、NF－κB阻滞剂PDTC（100μmol／L）和Bay11－7082（10μmol／L）抑制PA诱导的BMI位于20～27．9 kg／m2的T2DM患者PBMCs跨内皮迁移；TRAM－34和KCa3．1特异性siRNA显著减少PA（200μmol／L）诱导的THP－1细胞跨内皮迁移及THP－1细胞中MCP－1的分泌和表达，anti－TLR2／4（4 mg／L）、p38MAPK抑制剂SB203580（10μmol／L）及 SB202190（10μmol／L）、PDTC（100μmol／L）和Bay11－7082（10μmol／L）显著减少PA诱导的THP－1细胞中KCa 3．1和MCP－1的表达。结论：PA通过TLR2／4－p38MAPK－NF－κB通路上调KCa3．1促进MCP－1的表达，进而诱导单核细胞的跨内皮迁移。
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胆固醇线粒体转运蛋白（StAR）对脂肪酸引起的肝细胞脂质沉积及胰岛素抵抗的作用及其机制
目的：探讨胆固醇线粒体转运蛋白对脂肪肝细胞模型糖脂代谢、炎症反应及其胰岛素敏感性的作用及其机制。方法：1．32 mmol／L油酸＋0．66 mmol／L软脂酸共同作用小鼠原代肝细胞建立脂肪肝细胞模型，携带StAR基因的腺病毒转染细胞得到StAR高表达组。 Real－time PCR和Western blot检测糖脂代谢、炎症反应相关分子的变化；相关试剂盒检测肝细胞内甘油三酯、胆固醇及糖原水平；Western blot检测胰岛素信号转导通路上关键蛋白的表达，并用PI3K抑制剂抑制该通路后观察StAR的作用。结果：StAR过表达降低脂肪酸合成关键分子、炎症因子（ TNF－α、MCP1）及糖异生关键分子的表达，升高糖原合成关键分子的表达，且减少脂肪肝细胞模型内甘油三酯和胆固醇的水平，提高该模型的糖原合成能力及葡萄糖利用能力；StAR过表达降低细胞内二酰基甘油含量，减少PKCε的磷酸化，从而升高胰岛素受体底物1及Akt的磷酸化；PI3K被阻断后，StAR对糖脂代谢的作用消失。结论：StAR对脂肪酸引起的脂质沉积及胰岛素抵抗的肝细胞有保护作用，且该作用通过胰岛素信号转导通路介导。
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切应力诱导内皮细胞表达IL-8基因的信号转导
目的:现已确定动脉粥样硬化是一种炎症疾病,单核/巨噬细胞在动脉内膜下集聚是导致动脉粥样硬化损伤发展的基础;血流低切应力促进其损伤的发展.趋化细胞因子MCP-1对单核/巨噬细胞起强力趋化和激活作用,并有报告切应力可诱导其基因的表达.新近报道在层流作用下IL-8亦是单核/巨噬细胞与内皮细胞相互作用的重要调节因子.本研究旨在观察切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞IL-8 mRNA的表达,探讨Toll/NF-κB信号转导通路对其基因激活的介导作用.方法:4.2 dyn/cm2层流切应力处理人脐静脉血管内皮细胞,提取总RNA,应用RT-PCR和Northern杂交技术检测切应力作用不同时间后IL-8、TLR-2和TLR-4 mRNA的表达.免疫印迹技术检测IκB磷酸化和降解.免疫荧光细胞化学染色检测NF-κB胞核易位.结果:切应力作用0.5 h后IL-8 mRNA表达逐渐增高,2 h时达到很高水平.胞浆蛋白IκB和磷酸化IκB的免疫印迹显示4.2 dyn/cm2层流切应力作用10 min后磷酸化IκB水平即显著增加,30 min后又逐渐下降,与之相应IκB含量随切应力作用时间而逐渐下降,到1 h时几乎测不出,表明在切应力作用下内皮细胞胞浆NF-κB抑制因子IκB发生了磷酸化和降解.NF-κBp65亚基免疫细胞化学染色显示在4.2 dyn/cm2切应力作用0.5 h后内皮细胞核逐渐着色,1.5 h时细胞核几乎全着色,表明胞浆NF-κB在切应力作用下发生了易位,从胞浆进入胞核.RT-PCR检测和Northern杂交分析显示内皮细胞固有表达TLR-2和TLR-4 mRNA,在4.2 dyn/cm2切应力作用1 h后TLR-4 mRNA的表达显著增强,而TLR-2 mRNA的表达变化不明显.结论:流体切应力可诱导血管内皮细胞表达IL-8,活化转录因子NF-κB.在切应力作用下内皮细胞TLR-4 mRNA表达增强,提示Toll/NF-κB信号转导通路可能参与动脉粥样硬化性炎症反应.
