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干扰Itk表达抑制CVB3感染小鼠的炎症反应
目的 研究在病毒性心肌炎小鼠模型上敲减Itk蛋白的表达对小鼠炎症反应的影响.方法 BALB/c小鼠尾静脉注射表达Itk-shRNA的质粒后感染CVB3,第4天后观察Itk基因的抑制情况、小鼠存活率,PBMC增殖率及部分炎症性细胞因子的分泌水平.结果 Itk-shRNA转染至小鼠体内后脾细胞中Itk基因的mRNA水平与空白对照组及转染shRNAnon的对照组相比,敲减率约40％(P＜0.05).与转染shRNAnon组相比,Itk-shRNA组中Itk基因表达的抑制导致小鼠PBMC增殖活性降低约41％,小鼠的存活率提高(P＜0.05).Itk-shRNA组血清中细胞因子水平降低.结论 抑制Itk表达能有效降低小鼠PBMC的增殖,同时减少炎症相关细胞因子的分泌,提高小鼠的存活率.
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丁型肝炎病毒基因组RNA包埋锤头状核酶的活性研究
目的探讨用丁型肝炎病毒(HDV)基因组来包埋HBV靶向性核酶对核酶体内外活性产生的影响.方法用和HBV靶基因体外转录产物在不同反应条件下温育对HDV-核酶重组体的体外切割活性定量分析;与HBV基因组共转染Huh-7细胞以考察核酶在细胞内对HBV基因表达水平的抑制.结果体外实验发现,温度及核酶和底物的二级结构对包埋于HDV序列的核酶体外切割活性均有较大的影响.提高反应温度或消除二级结构都可使HDV包埋核酶的体外活性达到明显效果,与相同条件的裸露核酶活性没有太大差异.而细胞实验则表明,活性明显优于裸露核酶,可以将靶基因的表达抑制到极低水平.结论HDV RNA序列对所包埋核酶体外活性有一定的抑制作用,在细胞内则使核酶的活性得到显著增强.
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甲3型流感病毒M基因披甲RNA的研制
目的 研制内含甲3型流感病毒M基因RNA的披甲RNA.方法 将MS2噬菌体基因组中编码成熟酶蛋白、包膜蛋白和pac位点的DNA片段克隆到表达质粒pET30b中,构建重组质粒pAR-1.将甲3型流感病毒M基因连接到pAR-1 pac位点的下游,诱导表达出内含M基因RNA的披甲RNA AR-2,并进行纯化、定量和稳定性研究.结果 成功构建和表达了耐核糖核酸酶、内含M基因RNA的披甲RNA,每1 ml LB培养基可诱导表达出约8.9×1011个拷贝的AR-2.结论 制备的AR-2稳定,无生物传染危险性,可作为甲型流感病毒M基因核酸检测的标准品和质控品.
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HER-2/neu与RECK mRNA在乳腺癌组织的表达及其意义
目的 探讨乳腺癌组织中HER-2/neu与RECK mRNA的表达及其与乳腺癌恶性程度相关性,为临床预后提供参考.方法 采用RT-PCR技术检测92例乳腺癌组织标本及正常同源癌旁组织标本中HER-2/neu、RECK mRNA表达水平,同时对乳腺癌组织与癌旁组织中两基因的表达以及不同TNM分期和分化程度的乳腺癌组织中HER-2/neu、RECK mRNA表达情况进行对比分析.结果 乳腺癌组织中HER-2/neu mRNA表达水平高于癌旁组织,RECK mRNA表达水平低于癌旁组织.不同TNM分期乳腺癌组织中HER-2/neu 、RECK mRNA表达水平存在显著差异,TNM分期越高,HER-2/neu mRNA表达越多,RECK mRNA表达相对较少；而高分化癌组织中HER-2/neu mRNA表达水平较低,RECK mRNA表达相对较多,否则反之.结论 HER-2/neu mRNA与RECK mRNA在乳腺癌组织中表达异常,这两者之间相互作用,共同参与乳腺癌的发生、进展.
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人巨细胞病毒临床分离株UL131A-128mRNA转录方式的研究
目的 研究人巨细胞病毒( human cytomegalovirns,HCMV) UL131 A-128序列在临床低传代分离株中的转录方式.方法 用3'RACE技术扩增HCMV不同临床株,不同时期的UL131A,UL128,UL130的mRNAs并测序分析；利用PCR技术在HCMV临床株cDNA文库中筛选分别含有UL13IA,UL130,UL128序列的阳性克隆,测序并分析结果.结果 成功在临床低传代分离株中得到UL13IA,UL128,UL130基因的转录结构,UL131A,UL130的转录方式和文献报道一致,UL131A含有两个外显子,UL130为此区域内唯一不含内含子的基因.而UL128基因的转录本呈现了两种转录方式,一种结构包含三个外显子,长度为519 bp；而另一种结构包含三个外显子和第一内含子结构,长度为642 bp,在不同病毒株的不同时期均显示了包含第一内含子结构转录本的含量明显高于仅有外显子结构的UL128转录本的含量.UL131A-128三个基因在病毒的即刻早期,早期,晚期均存在.3'RACE得到结果与HCMV cDNA文库筛选得到的结果相一致.结论 UL131A,UL130和UL128基因的mRNA结构的起始位点不同,但他们在3’末端拥有共同的终止位点.HCMV临床株UL 131A-128基因转录方式的复杂结构可能在HCMV感染的不同时期具有重要作用.
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短双链RNA对柯萨奇B组3型病毒体外感染的抑制作用研究
目的 利用RNA干扰技术,在细胞、蛋白和基因水平上观察短双链RNA对柯萨奇病毒体外感染Hela细胞的增殖抑制作用、对病毒RNA复制和蛋白合成的影响.方法 应用病毒致细胞病变作用保护实验、空斑形成减少实验、Western Blot、RT-PCR等方法,在体外检测其抗CVB3病毒作用.结果 设计、合成的8条SiRNA中,针对基因组2B、VP4、2A、3C区的SiRNA-2、SiRNA-3、SiRNA-6、SiRNA-7具有不同程度的抑制病毒作用.其中,病毒基因组2B的SiRN-2作用效果好,对Hela细胞CVB3感染72 h后致细胞病变和空斑形成的抑制率为95%,抑制病毒蛋白的合成,病毒基因的复制水平也显著降低,在病毒0.1、0.01、0.001、0.0001 MOI感染水平上对CVB3致细胞病变作用的抑制率分别为30%、70%、88%和99%(48 h).结论 针对CVB3基因组2B的SiRNA-2具有较强的抑制柯萨奇B3型病毒感染的作用.
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乙型肝炎病毒基因扩增产物的固相酶联杂交定量分析
目的建立一种能快速、简便定量分析乙型肝炎病毒(HBV)基因的方法.方法用标记有生物素的引物做PCR,使扩增产物被标记,再加入碱性磷酸酶标记的链亲和素.利用酶促显色反应信号显示待测核酸模板的含量.结果对125份两对半表现不同的血清标本检测结果为:大三阳(HBsAg、HBcAb、HBeAg阳性)标本中 64.9%(24/37)PCR定量阳性,小三阳(HBsAg、HBcAb、HBeAb阳性)标本中 34.2%(13/38)PCR定量阳性,HBsAg和HBcAb阳性标本中6.7%(1/15)定量阳性,单项核心抗体(HBcAb)阳性标本中5.9%(2/34)PCR定量阳性.结论所建立的固相酶联杂交定量方法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、结果判断客观准确等优点,可广泛应用于临床.
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ITK蛋白调节小鼠脾淋巴细胞增殖分化的研究
目的 应用RNA干扰技术特异性抑制Itk基因的表达,观察Itk蛋白在淋巴细胞增殖和相应免疫因子合成分泌中的作用,进行Itk作为药物靶标的确认.方法 设计合成针对Itk基因的siRNA,将siRNA电转染至小鼠脾淋巴细胞,Western Blot检测Itk蛋白的表达、MTS方法检测细胞增殖率、ELISA方法检测细胞因子的含量.结果 实验组hk-siRNA在细胞水平上有效抑制了Itk蛋白的表达;Itk受抑制后细胞增殖率与对照组相比明显降低,差异有统计学意义,P<0.05;细胞因子IL-2,IL-4,IL-5,IFN-γ的分泌水平下降,P<0.05.结论 Itk表达受抑制后有效降低脾淋巴细胞的增殖率及细胞因子分泌的减少,研究验证了Itk在细胞增殖和炎性细胞因子分泌方面的重要免疫调节作用,为将其作为药物的靶基因提供实验依据.
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靶向流感病毒H7N9基因片段的人编码microRNA的生物信息学分析
目的 生物信息学预测靶向流感病毒H7N9基因片段的人编码microRNA (miRNA).方法 基于流感病毒H7N9基因片段(HA、NA、PB2、PA和PB1-F2)的保守区,利用miRNA预测软件(FindTar3),筛选出靶点落在保守区的miRNA,通过在线数据库(microRNA.org)分析其在肺组织细胞A549中的表达丰度,综合评估表达丰度及靶点自由能,预测调控流感病毒H7N9基因片段的佳人编码miRNA.结果 靶点分析得到种子区域匹配基因落在H7N9各基因片段保守区域的miRNA,分别是HA 51条、NA 37条、PB2 29条、PA 19条和PB1-F2 26条;经miRNA在肺组织细胞A549中的表达丰度分析,得到相对高表达、自由能小的miRNA,即调控流感病毒H7N9基因片段的佳人编码miRNA,分别是hsa-miR-16调控HA和PB2片段、hsa-miR-21调控NA片段、hsa-miR-9调控PA片段和hsa-miR-193b调控PB1-F2片段.结论 合理利用生物信息学在特定的组织细胞中预测靶向病毒基因片段的miRNA,可以为实验室的基础研究及临床治疗提供较可靠的靶miRNA.
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PBMC IP-10mRNA对慢性HBV感染相关肝衰竭预后的影响
目的 探讨外周血单个核细胞(PBMC) IP-10mRNA水平与HBV相关慢加亚急性肝衰竭患者预后的关系.方法 对2014年1月至2015年2月住院的HBV相关慢加亚急性肝衰竭患者50例,给予内科综合治疗并随访3个月,所有患者抽取外周静脉血检测单个核细胞IP-10mRNA水平;选取同时期20例慢性乙型肝炎(CHB)患者、20例乙肝后肝硬化患者和20例健康体检者作为对照,检测其PBMC中IP-10 mRNA表达水平,分析各组间的差异.同时分析肝衰竭生存组和死亡组IP-10mRNA表达的差异.结果 健康对照组、慢性乙型肝炎组、乙肝后肝硬化组和肝衰竭组患者PBMCIP-10mRNA水平分别为0.412 ±0.061,0.641 ±0.083,0.693±0.033,0.956±0.277.肝衰竭组患者PBMC IP-10mRNA水平显著高于其他三组(P＜0.01);慢性乙型肝炎组患者PBMC IP-10mRNA水平高于健康对照组(P＜0.01).肝衰竭死亡组PBMC IP-10mRNA水平为1.126±0.270,高于生存组的0.823±0.202,差异有统计学意义(t=-4.5296,P＜0.01).受试者工作特征曲线下面积为0.81,临界值为0.9255,大于界值组生存率为18.18％ (4/22),小于界值组生存率为85.71％(24/28),x2=22.803,P＜0.001.结论 HBV相关慢加急性肝衰竭患者PBMC IP-10mRNA水平与预后相关,检测患者PBMCIP-10mRNA,有助于评估HBV-ACLF的预后.
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单一时间点HC2-HPV-DNA和HPV E6/E7mRNA检测的临床研究
目的 研究在单一时间点上的人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA检测及HC2-HPV-DNA检测在宫颈疾病筛查中的应用.方法 对2008年1月至2009年7月就诊的130例患者进行HPV E6/E7 mRNA与HC2-HPV-DNA检测.以TCT结果为标准评价两种方法检测宫颈高度病变的效能.结果 HC2-HPV-DNA检测阳性检出率82.3%(107/130),HPV E6/E7 mRNA检测阳性检出率40.0%(52/130),两种方法在阳性检出方面差异有统计学意义(X2=24.5,P＜0.05).HC2-HPV-DNA检测宫颈高度病变的敏感性为90.1%、特异性为22.1%、阳性预测值为37.4%、阴性预测值为82.6%;HPV E6/E7mRNA检测宫颈高度病变的敏感性为65.9%、特异性为73.3%、阳性预测值为55.8%、阴性预测值为80.8%.结论 在单一时间点的宫颈癌筛查中结合HC2-HPV-DNA检测和HPV E6/E7 mRNA检测更具有潜在价值.
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卡介苗多糖核酸对支气管哮喘合并鼻炎患儿治疗的研究
目的 探讨卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)对支气管哮喘合并鼻炎患儿Th1/Th2功能及肺通气功能的影响.方法 37例哮喘患儿随机分为治疗组和对照组两组.按照分级治疗的标准给与相应的糖皮质激素吸入治疗,治疗组加用BCG-PSN,随访6个月,比较治疗前和治疗后血清IFN-γ、IL-4的浓度及IFN-γ/IL-4比值、血浆总IgE、肺功能、鼻炎积分、哮喘发作需急诊就诊的次数、呼吸道感染的次数.结果治疗后治疗组,IL-4、IgE明显下降,IFN-γ及IFN-γ/IL-4比值明显升高;差异有统计学意义(P＜0.05),而对照组无明显改变,差异无统计学意义(P＜0.05).两组肺功能均明显改善,差异有统计学意义(P＜0.05).治疗组哮喘发作需急诊就诊的次数为(0.81±0.20)次,对照组为(1.72±0.80)次,差异有统计学意义,(t=4.15,P＜0.05);治疗组呼吸道感染(1.15±0.55)次,对照组(3.21±0.73)次,差异有统计学意义,(t=3.98,P＜0.05);治疗组鼻炎发作(1.31±0.42)次、对照组(1.11±0.39)次,差异无统计学意义,(t=2.31,P＜0.05).结论 BCG-PSN具有纠正Th1/Th2失衡,减轻气道炎症,改善肺通气功能,提高免疫力的作用.对于哮喘合并过敏性鼻炎的患儿,除针对气道慢性炎症使用糖皮质激素进行抗炎治疗外,同时应重视免疫调节治疗.
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67例慢性丙型肝炎治疗过程及随访中血清ALT、病毒载量及肝纤维化指标的变化
目的 观察聚乙二醇干扰素α-2b联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎过程中肝功能、病毒复制及肝纤维化指标的改变情况.方法 检测67例慢性丙型肝炎患者在干扰素联合利巴韦林治疗开始(0周)、结束(48周)和停药12周(60周)时血清丙氨酸转氨酶(ALT)、丙肝病毒核糖核酸(HCV RNA)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原肽(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)和层粘连蛋白(LN)水平.结果 治疗后完全应答组(CR-S,43/67) ALT、HCV RNA及血清4项纤维化指标均显著下降(P ＜0.05或P＜0.01),部分应答组(CR-R,13/67)和无应答组(NR,11/67) ALT、HCV RNA及血清4项纤维化指标变化不明显,反跳甚至更高.结论 聚乙二醇干扰素α-2b联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎约65％患者完全应答,随着肝细胞炎症的改善,病毒RNA滴度、肝纤维化指标水平明显下降,表明干扰素联合利巴韦林能抑制HCV RNA复制,调节机体免疫功能,减轻肝脏炎症反应,改善肝功能,减少肝纤维化.
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379例HCV感染者丙型肝炎病毒载量与抗HCV及肝功能指标的相关性分析
目的 探讨丙型肝炎患者HCV RNA载量与抗HCV及肝功能指标的相关性.方法 回顾分析2011年1月至2013年12月间在本院门诊,住院,体检中丙型肝炎抗体阳性病人,男150人,女229人,年龄32-87岁,应用实时荧光定量PCR检测HCV RNA病毒,全自动生化分析仪检测肝功能8项指标,按HCV RNA病毒载量数分HCV RNA阴性组,HCV RNA低中水平组,HCV RNA高水平组.结果 三组年龄分布比例经统计学检验无明显差异(P＞0.05),但低中水平女性比例比男性略高;三组肝功能生化指标检测结果不完全相同(P ＜0.05或P＜0.01),其中HCV RNA低中水平组和高水平组血清ALT、AST、GGT、ALP、TBIL与阴性组比较均有差异(P＜0.05或P＜0.01);TP、ALB、DBIL三组间比较虽无明显统计学差异,但低中水平组和高水平组结果呈下降趋势,低中水平组和高水平组比较ALT、AST、TBIL也有明显差异(P＜0.05),病毒载量越高ALT、AST的结果越高,经干扰素治疗后随载量的下降肝功能酶类指标也随之下降.结论 不论病毒载量的高低只要HCV RNA持续阳性,都可导致肝细胞的损害和肝功能的异常,临床应尽早进行抗病毒治疗.PCR实时荧光探针技术方法先进,技术成熟,结果稳定,能早期诊断HCV感染者,有助于临床早期抗病毒治疗,防止HCV传播和发展.
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磁珠法提取核酸检测丙肝病毒RNA载量及其临床研究
目的 探讨磁珠法提取核酸检测丙肝病毒RNA载量的方法学评价及其临床应用.方法 采用精密度、检测下限、线性分析和干扰实验对磁珠法提取核酸进行方法学评价,采用磁珠法和柱抽提法对283份标本进行检测,进行相关性分析.结果 磁珠法的高值质控血清的批内精密度为6.64±0.11,CV为1.65％,批间精密度为6.68±0.14,CV为2.09％;低值质控血清的批内精密度为4.60±0.12,CV为2.66％,批间精密度为4.56±0.19,CV为4.10％;检测下限为用磁珠法检测20份500IU/L HCV血清标本,20份标本均扩增出曲线,阳性率为100％(20/20).磁珠法线性评估结果呈明显线性,相关系数r=0.999,P＜0.05,回归方程y=0.982x+ 0.092.磁珠法和柱抽提法提取核酸检测HCV-RNA载量的比较,磁珠法与柱抽提法的相关系数r=0.990,P＜0.05,回归方程y=0.965x +0.247.结论 磁珠法提取核酸检测丙肝病毒RNA载量的方法具有较高的特异性和灵敏度,较强的抗干扰能力,且方法简便易于自动化操作,是理想的实验室核酸提取方法.
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三种不同转染方法拯救病毒的比较研究
目的 比较3种不同转染方法,探索佳的拯救病毒策略.方法 3种转染方法包括:①含T7 RNA聚合酶启动子的全长肠道病毒71(EV71)感染性质粒(P-EV71)和T7RNA聚合酶真核表达质粒(VR-1a)共转染Vero细胞;②含T7RNA聚合酶启动子的EV71全长基因片段(PCR产物)与VR-1a共转染Vero细胞;③利用体外转录技术得到EV71病毒全长RNA,直接转染Vero细胞.分别观察3种方法转染后产生细胞病变效应(CPE)时间及病变情况,用RT-PCR扩增拯救病毒核酸,测序验证其正确性,用蛋白印迹方法检测拯救病毒抗原.结果 3种方法均可成功转染Vero细胞得到拯救病毒,三种转染方法转染效果比较:方法③优于②、②优于①.结论 三种转染方法均可成功拯救EV71病毒,以病毒RNA直接转染效果好.
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慢性HBV感染不同阶段肝组织HBV cccDNA含量与IL-10、IFN-γ的相关性研究
目前尚无特效药能够治愈慢性乙型肝炎,主要原因是HBV cccDNA的存在,HBV cccDNA是HBV前基因组RNA复制的原始模板,可稳定地存在于肝细胞核中.只有宿主的免疫系统能够清除HBV cccDNA.
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我国Q热立克次体菌株23S rRNA基因插入顺序的分析
目的 对我国伯氏考克斯体(Cb)分离株的23S rRNA基因插入片段(23S IVS)作核酸序列分析.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增7株Cb中国分离株和2株外国参考株的23S IVS,用双脱氧核苷酸法对扩增产物进行测序.结果 重庆,四川,内蒙分离株以及Henzerling和Grita等6株的IVS序列均相同,YS-8,YS-9和YH-11等云南分离株的IVS与前6株的比较仅少一个7个碱基的重复序列.结论 Cb 23S IVS为高度保守基因片段,与高度异质性的钩端螺旋体的同源性基因片段不同;云南株和其它6株的IVS差别与Cb分离株的地理分布的不同有关,云南分离株可能为一亚种.
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siRNA沉默肾上腺髓质素基因对A375黑素瘤细胞周期的影响
目的 研究小干扰RNA(siRNA)沉默A375黑素瘤细胞肾上腺髓质素(ADM)基因对其细胞周期的影响.方法 利用人工合成的ADM靶向小分子干扰RNA转染A375细胞,采用实时荧光定量-PCR(qRT-PCR)筛选出有效的siRNA,用选出的干扰效果好的siRNA转染的A375细胞为实验组;转染非特异序列的细胞为阴性对照组;未转染的细胞为空白对照组.流式细胞仪(FCM)检测干扰ADM基因48 h后A375细胞周期的情况.结果 FCM结果显示,siRNA干扰组G2/M期细胞比率为(11.360±1.224)%,明显高于未转染组的(1.020±0.990)%和非特异序列转染组的(4.150±1.032)%,差异有统计学意义(P<0.05);未转染组与非特异序列转染组差异无统计学意义(P>0.05).而siRNA干扰组G1/G0、S期细胞比率分别为(69.443±2.023)%、(19.197±0.890)%,与未转染组(68.567±3.653)%、(30.417±4.582)%和非特异序列转染组(70.530±3.008)% 、(23.313±4.645)%比较,差异均无显著性(P>0.05).结论 ADM能够将黑素瘤细胞阻滞在G2/M期,抑制细胞增殖.
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台湾地区专科护理师的发展
进阶护理角色(Advanced Practice Nurse,APN)的发展在全世界已蔚为风潮,它的发展反映出护理专业的进步和社会大众的需求.进阶护理角色泛指所有的进阶护理人员,包括临床护理专家(Clinical Nurse Specialist,CNS)、执业护理师(Nurse Practitioner,NP)、助产护理师(Certified Nurse Midwife,CNM)、麻醉护理师(Registered Nurse Anesthetist,RNA)及个案管理师(Case Manager,CM)等.
