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非编码RNA调节自噬参与缺血性心脏病的发生和发展
缺血性心脏病严重危害人类身体健康.心肌缺血再灌注损伤是缺血性心脏病临床治疗中常见的一种病理损害,如何预防或减轻心肌缺血再灌注损伤已成为研究热点,但其具体机制仍不明确.近年来,非编码RNA及自噬在缺血性心脏病中的作用备受关注.本文就非编码RNA调节自噬参与缺血性心脏病的相关研究进展进行综述,以期为缺血性心脏病的治疗提供新思路.
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人膀胱癌荷瘤鼠中shRNA沉默△Np63基因对肿瘤的抑制和cdk4的影响
目的:利用RNAi(RNA interference,RNA干扰)技术,通过抑制△Np63基因的表达,研究其对人膀胱癌裸鼠皮下移植模型的抑瘤作用,同时检测△Np63基因被抑制后对cdk4(细胞周期素依赖性激酶4,cyclin-dependent kinase 4)的影响.方法:建立人膀胱癌裸鼠皮下移植模型,构建△Np63基因特异性shRNA(short hairpin,短发卡)表达质粒,将表达质粒转染荷瘤鼠瘤体,观察肿瘤生长情况,HE染色法观察质粒治疗后瘤组织的病理改变,RT-PCR方法检测△Np63基因的表达变化,SP免疫组化检测△Np63和ckd4蛋白表达变化.结果:转染质粒8周后,△N p63-shRNA组、Control-shRNA组与生理盐水组比较,△Np63-shRNA组与生理盐水组瘤体积有显著性差异(p＜0.01),抑瘤率为74.44%,Control-shRNA组与生理盐水组体积无显著性差异(p＞0.05).病理学结果发现:△Np63-shRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞核分裂相减少,可见大量肿瘤细胞坏死和凋亡、炎症细胞浸润.RT-PCR结果显示△Np63-shRNA组△Np63基因表达降低,免疫组化结果显示△Np63和ckd4蛋白表达均降低.结论:△Np63特异性shRNA质粒表达载体沉默△Np63基因后,可显著抑制人膀胱癌裸鼠肿瘤的生长,△Np63可能通过抑制ckd4的表达而抑制肿瘤的细胞增殖.
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FHL2基因表达改变对急性红白血病细胞生物学功能的影响
目的 探讨FHL2基因对人类急性红白血病细胞生物学功能的影响.方法 应用Western blot检测常见白血病细胞系(K562、HEK293T、U937、HL-60、Kasumi-1、SKNO-1、NB-4及Nalm-6)FHL2蛋白表达情况.采用RNA干扰技术设计并合成FHL2 mRNA特异性shRNA,构建pLKO.1-puro干扰载体,制备慢病毒并感染人类急性红白血病K562细胞;应用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测干扰效率;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测干扰FHL2对细胞增殖能力的影响;用流式细胞术分析细胞凋亡的变化.结果 FHL2在K562、Kasumi-1和Nalm-6等白血病细胞系中表达,尤其在K562细胞中高表达.Western blot检测显示干扰FHL2的K562细胞FHL2蛋白相对表达水平较转染阴性对照序列的K562细胞明显下降(相对表达水平分别为1、0.284,t=8.872,P=0.0004),干扰K562细胞中FHL2基因表达能够抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡.结论 FHL2基因在多种白血病细胞系中表达升高.shRNA靶向干扰FHL2基因的表达可有效抑制K562细胞的增殖,促进其凋亡.
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Apollon特异性siRNA序列的筛选及功能鉴定
目的 筛选干扰Apollon基因表达的siRNA序列并鉴定其功能.方法 采用化学方法合成针对Apollon基因不同位点的siRNA序列;应用Lipofectamine 2000转染人类乳腺癌MCF-7细胞;反转录PCR(RT-PCR)检测Apollon mRNA表达水平;细胞免疫荧光结合激光共聚焦技术定量分析Apollon蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)和流式细胞术分别检测siRNA干扰Apollon后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响.结果 合成的3对siRNA序列均能抑制Apollon mRNA表达,其siRNA1、siRNA2、siRNA3对ApollonmRNA的抑制率分别为(36.201±11.629)％、(67.308±7.686)％、(47.123±12.000)％,与对照组相比差异均有统计学意义(均P＜ 0.05);siRNA2转染MCF-7细胞后Apollon蛋白的荧光强度为(14.97±2.08)％,增殖抑制率达(73.361±2.118)％,凋亡率为(28.793±0.743)％.结论 筛选出的siRNA2序列可有效沉默Apollon基因的表达,显著抑制MCF-7细胞的增殖和促进其凋亡,为肿瘤靶向治疗提供实验依据.
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小干扰RNA逆转三氧化二砷耐药的白血病K562/AS2细胞Topo Ⅱ基因表达的实验研究
目的 研究小干扰RNA片段(shRNA)对三氧化二砷(ATO)耐药的白血病细胞株K562/AS2细胞的Topo Ⅱα、TopoⅡβ基因表达及其功能的影响.方法 设计并合成针对Topo Ⅱα和TopoⅡβ基因序列的shRNA各3对,在脂质体的介导下转染K562/AS2细胞;用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)分析Topo Ⅱα、TopoⅡβmRNA的表达水平;流式细胞术检测Topo Ⅱα、TopoⅡβ蛋白表达.结果 针对Topo Ⅱα-shRNA、TopoⅡβ的shRNA作用于K562/AS2细胞24 h后,Topo ⅡαmRNA水平和蛋白水平大下调为(78.22±0.01)%、(31.17±1.27)%(P<0.05),TopoⅡβmRNA水平和蛋白水平大下调为(57.36 ±0.01)%、(23.98 ± 1.22)%(P<0.05).结论 转染24 h后针对TopoⅡ的shRNA可抑制对ATO耐药的白血病细胞株K562/AS2细胞TopoⅡ基因的表达.
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多发性骨髓瘤骨髓单个核细胞缺氧诱导因子1α mRNA的表达及其临床意义
目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)患者缺氧诱导因子1 α(HIF-1 α)基因mRNA表达和临床各指标的相关性,了解HIF-1 α基因在MM患者中的表达和意义.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)28例检测MM患者和22例骨科外伤患者或非血液系统恶性肿瘤患者(对照组)骨髓单个核细胞中的HIF-1 α mRNA,以β-actin作为内参照,用SDS分析软件测定Ct值,用2-△△Ct表示目的 基因的量.结果 HIF-1 α mRNA在MM骨髓单个核细胞中表达为对照组的12.68倍,HIF-1 α mRNA水平(以-△Ct表示)与患者血清β2-微球蛋白(r=0.575,P=0.000)、红细胞沉降率(r=0.522,P=0.000)、乳酸脱氢酶(r=0.286,P=0.044)、C反应蛋白(r=0.356,P=0.011)水平呈正相关,与患者血红蛋白(Hb)水平呈负相关(r=-0.556,P=0.000).结论 HIF-1 α mRNA在MM组织中高表达,与临床多项指标有关,可作为临床监测指标之一,有可能成为肿瘤分子靶向治疗中新的靶点.
关键词： 多发性骨髓瘤 RNA 缺氧诱导因子1 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 -
腺病毒载体介导的发夹状RNA抑制三氧化二砷耐药的K562/AS2细胞MRP1基因表达的实验研究
目的 构建MRP1特异性发夹状RNA(shRNA)重组腺病毒载体,并研究其对耐三氧化二砷(ATO)的白血病K562/AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用.方法 构建MRP1特异性shRNA重组腺病毒,并感染K562/AS2细胞;用荧光实时定量PCR法分析MRP1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRP1蛋白表达;MTT法检测该细胞对ATO及依托泊苷(VP_(16))的细胞毒作用.结果 pAd-EGFP-U6.MRP1.shRNA重组腺病毒感染前后,K562/AS2细胞中MRP1 mRNA和蛋白表达水平分别为(34.70±0.28)、(4.19±0.03)(P<0.05)和(26.40±0.16)、(10.85±0.37)(P<0.05);感染前后K562/AS2细胞对ATO及VP16耐药倍数分别为(11.4078±0.3183)、(1.6126±0.3015)和(5.9141±0.0149)、(1.7664±0.1038),逆转倍数分别为(7.2409±1.3668)和(3.3555±0.1886)(P<0.05).结论 成功构建了pAd-EGFP-U6-MRP1.shRNA重组腺病毒载体,该载体感染K562/AS2细胞后可抑制细胞MRP1基因表达以及逆转该细胞对ATO和VP16的耐药.
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婆罗双树样基因4 shRNA干扰载体的构建及其对THP-1细胞的转染
目的 构建针对婆罗双树样基因4(SALL4)的特异性shRNA干扰载体,并转染THP-1细胞,以期为更深入了解SALLA对白血病的作用,为后续研究提供实验工具.方法 设计4条针对不同靶点的SALL4特异性siRNA和一条阴性干扰siRNA,分子克隆方法构建pGPU6/GFP/Neo/SALIAshRNA干扰载体,转染THP-1细胞,比较未转染细胞、阴性干扰转染细胞和4条SALL4 shRNA转染细胞的SALL4表达情况,找出干扰效果好的SALL4 shRNA.结果 4种SALL4 shRNA均能有效转染THP-1细胞,实时定量PCR(RT-PCR)与Western blotting结果均显示针对靶点mRNA-1122的pGPU6/GFP/Neo/SALL4 shRNA-B干扰效果佳,SALL4表达减少量多(P<0.05).结论 成功构建SALL4 siRNA干扰载体,可选择SALL4 shRNA-B载体进一步完成对SALL4基因功能的研究工作.
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microRNA及其在淋巴瘤中的表达
micro RNA(miRNA)是一类长度大约为22 nt的非编码小片段RNA,其进化保守,通过与mRNA的3'UTR相互作用进而调控mRNA的翻译,广泛作用于发育、炎症、凋亡和肿瘤等各个生物学过程.在T淋巴瘤中发现miR-106a和miR-17-92过度表达;在弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡细胞淋巴瘤中的miR-155,miR-221和miR-21表达上调,并与肿瘤的亚型有关.miR-17簇过度表达可使凋亡水平下降,表明这些miRNA的主要作用是抑制细胞的死亡.miRNA既可促进肿瘤的发生,又能抑制肿瘤,但其确切机制尚不明.随着研究的深入,miRNA的遗传表型调节功能将会越来越清楚.
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短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的实验研究
目的 研究短发夹RNA(shRNA)对耐三氧化二砷(As2O3)的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的抑制作用.方法 设计并合成3条针对MRPI基因的shRNA序列,在脂质体的介导下转染K562/AS2细胞;用荧光实时定量PCR分析MRPI mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRPI蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量.结果 经MRPI shRNA作用24 h后,K562/AS2细胞株中MRPImRNA和蛋白表达水平明显下降,大下调幅度分别为(79.1±0.07)%和(62.48±0.86)%(P<0.05),同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加(P<0.05).结论 MRPI shRNA可抑制As2O3耐药的白血病细胞株K562/AS2细胞MRPl基因的表达.
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有效bcl-2 siRNA对HL-60细胞生长的抑制作用
目的 应用RNA干扰(RNAi)技术观察有效bcl-2 siRNA对白血病细胞HL-60凋亡的影响.方法 将有效bcl-2 siRNA 转染人HL-60细胞;用MTT法、流式细胞术(FCM)及Hoechst 33258荧光染色法观察细胞增生及凋亡情况.结果 有效bel-2 siRNA有抑制HL-60细胞生长及促进细胞凋亡的作用.结论 有效bcl-2 siRNA 能特异性促进HL-60细胞凋亡,抑制其生长.
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siRNA对HL-60细胞c-myc蛋白表达的影响
目的 研究小干扰RNA(siRNA)对白血病细胞c-myc蛋白表达的影响,探寻白血病基因治疗的新方法.方法 应用针对c-myc的siRNA转染HL-60细胞,分别收集转染后24、48和72 h细胞及对照组细胞,提取细胞总蛋白,用Western blotting方法检测c-myc蛋白的表达情况.结果 与对照组相比,转染c-myc siRNA后,细胞c-myc蛋向表达水平明显下降,且c-myc蛋白含量随作用时间的延长而逐渐降低,转染24 h后c-myc蛋白含量下降约42%,48 h下降66%,72 h下降78%;单因素方差分析显示与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 c-myc siRNA能降低HL-60细胞c-myc蛋白的表达,其作用具有序列特异性和时间依赖性,有望成为白血病靶向基因治疗的新工具.
关键词： 原癌基因蛋白质c-myc RNA 小分子干扰 白血病 HL-60细胞 -
siRNA对HEK293细胞WT1表达的抑制作用及对K562细胞增生的影响
目的 探讨以WT1基因为靶标治疗白血病的可行性,筛选有效抑制WT1基因表达的siRNA并观察其对K562细胞增生的影响.方法 制备特异性WT1 siRNA3条,转染HEK293细胞株,采用荧光定量RT-PCR方法 检测WT1基因mRNA表达,Western blotting法检测WT1蛋白表达;MTY法检测细胞增生的影响.结果不同位点的siRNA对WT1基因抑制作用不同.si-wt1-1对WT1mRNA抑制明显(P＜0.05),si-wt1-2、si-wt1-3对WT1mRNA无抑制(P＞0.05).100 nmol/L si-wt1-1能使WT1mRNA的表达在转染后24h和48 h分别降低至对照组的(42.5±1.0)%(P＜0.05)、(25.3±1.5)%(P＜0.01),但72 h恢复至对照组水平.siRNA作用无明显剂量依赖性,不同浓度si-wt1-1对WT1mRNA抑制作用的比较差异无统计学意义(P＞0.05).Western blotting法榆测证实转染siRNA 48、72、96 h后,si-wt1-1对WT1蛋白抑制明显(P＜0.05),且96 h抑制作用强;si-wt1-2、si-wt1-3无明显抑制作用(P＞0.05).si-wt1-1对K562细胞增生有抑制作用,si-wt1-1处理组与阴性对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 siRNA可有效抑制HEK293细胞WT1基因的表达,且mRNA水平抑制效果优于蛋白水平.si-wt1-1可有效抑制K562细胞的增生.
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靶向人类WT1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定
目的 制备编码人类WT1基因的shRNA(short hairpin RNA)质粒表达载体.方法 设计合成WT1shRNA的DNA模板单链,在两端加入限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点,退火形成双链,质粒pGenesil-1的BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切线性化,稀释退火片段与线性化Pgenesil-1质粒表达载体经T4DNA连接酶连接,酶切、测序鉴定.结果 经酶切、测序鉴定,pWT1shRNA构建成功.结论 成功构建了针对人类WT1基因的shRNA质粒表达载体,为探讨WT1的生物学功能及白血病的基因治疗奠定了基础.
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RNA分析技术在法医学中的应用
RNA是近年来分子生物学技术领域的研究热点之一,随着分子生物学技术的发展与成熟,RNA技术逐渐在法医学领域得到应用,用来处理传统的DNA分析方法难以解决的法医学问题,如推断死亡时间(PMI),检测伤口形成时间以及体液鉴定等.本文综述介绍目前RNA分析技术在法医学中的国际发展趋势以及目前存在的局限性,为今后该技术在法医学领域的更广泛应用奠定基础.
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RNA指标在死后人体皮肤组织中稳定性研究
目的 探讨多种RNA指标的表达水平在死后人体皮肤组织中的稳定性.方法 收集死亡时间(PMI)明确的人体皮肤组织样本10例,提取总RNA,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测ACTB、GAPDH、18S、miR-203、5S、let-7a、RPS29、U6共计8个RNA指标的表达水平.geNorm软件评估各RNA指标表达水平的稳定性,挑选出稳定的内参指标并分析其表达水平与相关因素(年龄、性别、死因)的关系.结果 人体皮肤组织中5S、U6和miR-203表达水平为稳定,其平均表达量与年龄、性别、及死因无关(P＞0.05).结论 5S、U6和miR-203可以作为qRT-PCR方法研究PMI的理想内参指标.
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人参叶cDNA文库构建中的问题与对策
人参是传统中药的典型代表且具有很高的药用价值.作为一种广泛种植的中药材,它的次生代谢产物种类多,但目前关于人参有效成分如人参皂苷的生物合成途径及其调控的基础研究相对缺乏.本文以人参叶组织为材料,总结了构建人参叶cDNA文库过程中存在的一些关键问题和应采取的对策,为今后人参和其它药用植物的RNA提取、构建高质量的cDNA文库来保存珍贵基因资源、克隆和研究与有效成分合成相关的基因及EST文库等,提供技术参考和理论指导.
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人体脑组织RNA表达水平与早期PMI的相关性
目的 探讨人体脑组织多种RNA指标的表达水平与早期死亡时间(PMI)的相关性. 方法 选取12例已知PMI (4.3～22.5 h)的个体,提取脑组织总RNA.选取8种常用RNA指标(β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9、miRNA-125b),通过实时荧光定量PCR技术检测其在脑组织中的表达水平.运用geNorm软件筛选早期PMI表达稳定的内参指标,并分析其表达水平与相关因素(年龄、性别、死亡原因)的关系.运用R软件将内参标准化的RNA指标代入前期研究建立的数学模型推断PMI,计算推断PMI的误差率以验证模型精确性. 结果 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b表达稳定,其表达水平与年龄、性别、死亡原因无关.利用β-actin推断PMI的误差率为24.6％,GAPDH为41.0％. 结论 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b在死亡早期表达稳定,适合作为人体脑组织的内参指标.β-actin表达水平与PMI相关性良好,有望成为推测早期PMI的辅助指标.
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不同温度下大鼠脑组织RNA降解与早期PMI的相关性
目的 探讨大鼠脑组织8种RNA指标,在不同温度下的表达水平与早期死亡时间(PMI)的相关性.方法 将222只SD大鼠随机分为对照组(死后0 h)和4个实验组,实验组断颈处死后分别置于5℃、15℃、25℃和35℃的环境中,于死后1~24 h内9个时间点提取脑组织RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测8种RNA指标(β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9及miRNA-125b)的表达水平,geNorm软件选取合适内参,SPSS软件对内参标准化RNA指标进行回归分析,R软件构建推断PMI的数学模型,另选6只已知PMI的SD大鼠予以验证.结果 5S rRNA、miR-9和miR-125b表达稳定,可作为内参指标.β-actin和GAPDH具有良好的时序性降解规律,在24 h内随PMI延长不断降解.R软件拟合得ΔCt值随PMI和温度变化的数学模型可用以推断PMI.运用β-actin和GAPDH验证模型的平均误差率分别为14.1%和22.2%.结论 β-actin和GAPDH表达水平与PMI和环境温度相关性良好.本研究建立的数学模型可为温度变化条件下的早期PMI推断提供参考.
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HO－1对脂多糖诱导大鼠肝细胞内质网应激的作用
目的：探讨抗氧化蛋白血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）对脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导大鼠肝细胞内质网应激的影响。方法大鼠正常肝细胞系BRL细胞培养，筛选有效HO-1 siRNA。用LPS、LPS+HO-1 siRNA、HO-1 siRNA和PBS溶剂分别处理大鼠肝细胞。用台盼蓝拒染实验检测细胞活力，Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡，Western印迹法检测GRP78、CHOP、caspase-12以及HO-1蛋白表达。结果 LPS能剂量依赖和时间依赖性诱导大鼠肝细胞HO-1蛋白表达上调，引起GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达增高，细胞活力降低和细胞凋亡率增高；HO-1 siRNA预处理明显抑制LPS对HO-1蛋白表达上调的诱导作用，并加剧LPS引起的内质网应激和细胞损伤。结论 HO-1抑制LPS诱导大鼠肝细胞内质网应激介导的细胞损伤。
