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肿瘤患者丙肝病毒抗体结果在HCV现症感染诊断中的临床价值
目的 探讨肿瘤患者丙型肝炎病毒抗体S/CO值在HCV现症感染诊断中的临床价值.方法 回顾性分析2013年1月至2015年4月间在中国医科院肿瘤医院住院并经病理学诊断的肿瘤患者,男240例,女150例,年龄25至83岁,应用雅培i2000免疫分析仪和罗氏实时荧光定量PCR分别检测HCV抗体和RNA水平,在肝癌组和非肝癌组分别观察HCV抗体S/CO值与RNA检测的相关性.结果 肝癌组与非肝癌组在年龄、性别和HCV 抗体水平的分布上有明显统计学差异( P＝0.004,P＜0.001和P＜0.001),两组患者在HCV RNA阳性率的分布上无统计学差异(P＝0.528),随着S/CO值的增大两组患者HCV RNA阳性率都升高.使用ROC曲线分析,感染HCV的肿瘤患者诊断现症感染的佳界值为10.0,此时敏感度为97.6%,特异度为81.3%;根据ROC曲线结果,肝癌组和非肝癌组的佳界值差别不大,分别为11.4和10.4.结论 感染HCV的肿瘤患者诊断HCV现症感染的佳界值为10.0时,诊断效率较高.
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基于细菌16S rRNA基因的PCR扩增与测序分析在临床不常见菌鉴定中的应用
目的 探讨细菌16S rRNA基因的广谱PCR扩增与测序分析在临床分离的少见病原菌的鉴定及分类中的价值.方法 收集2010年12月至2011年9月来自7家不同医院和机构,常规方法难以鉴定或具有特殊表型的少见菌48株,以及仪器法连续监测报警阳性、但二次传代无细菌生长的液体增菌培养瓶7个,采用细菌16S核糖体核糖核酸(rRNA)基因MicroSeq 500试剂盒、通用引物27f-1492r、27f-1525r进行广谱PCR扩增及目的片段的基因测序.运用美国国立生物信息中心“基于局部比对算法的搜索工具( Blast)”,结合“具有法定分类学地位的原核生物名称目录(http://www.bacterio.cict.fr/)”提供的分类学信息,比较待鉴定细菌与近缘种模式菌株基因序列的相似程度；参考美国临床与实验室标准化协会(CLSI) MM18-A的解释标准,以确定待鉴定细菌的种属及分类学位置.结果 采用广谱PCR测定,7份假阳性血培养瓶中,2份扩增到细菌的16S rRNA基因,经序列分析鉴定均为肺炎链球菌.48株不同来源、不同种属的少见菌,均扩增到16S rRNA基因目的片段并成功测序,参考CLSI MM18-A的解释标准,35株(72.9％)直接鉴定到“种”,11株(22.9％)鉴定到“属”,另2株鉴定为可能的新属新种.进一步结合细菌的生化反应特征及其他管家基因序列分析结果,则可鉴定到“种”的细菌可增加到42株(87.5％),其中包括链杆菌、嗜二氧化碳噬纤维菌、玫瑰单胞菌、奴卡菌、弯曲菌、分枝杆菌等具有明确临床意义的少见菌,以及多株近十年内命名的新细菌,如小不动杆菌、富西哑分枝杆菌、黏液玫瑰单胞菌、Halomonas johnsoniae等.此外,还发现了1个新亚型的胎儿弯曲菌.结论 16S rRNA基因测序鉴定能明确提供细菌的遗传学信息,且无种属选择性,对临床少见菌、苛养菌、以及固体培养基不生长的纯培养物等具有独特的优势,是病原微生物鉴定的发展方向.
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原发性胆汁性肝硬化患者lncRNA表达谱芯片分析及功能研究
目的 分析原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血单个核细胞(PBMC)中长链非编码RNA(lncRNA)表达谱,为PBC的发病机制、临床诊断和治疗提供新的方向.方法 收集PBC及健康对照组外周抗凝血各30份,分离PBMC,从中各选取4份进行lncRNA表达谱芯片测定,并用逆转录PCR(RT-PCR)验证芯片结果.对芯片结果进行生物信息学分析,如 Cis/Trans 靶基因分析、Gene ontology(GO)分析、Pathway分析和共表达网络预测,并设计小干扰RNA(siRNA)干扰lncRNA的表达,进行靶点验证.结果 相对于健康对照组,PBC患者PBMC中共发现749个异常表达的lncRNA, 230个异常表达的信使RNA(mRNA).PBC组核受体(NR4A3)基因表达水平下调78%,而在NR4A3基因下游20000 bp左右的lncRNA linc-pbc的表达上调2.56倍.转染针对linc-pbc 的siRNA后, PBMC中linc-pbc的水平下降,而NR4A3的mRNA表达水平及蛋白质水平均上调,叉头状转录因子(FOXP3)的表达也上调.结论 linc-pbc或许通过招募多梳蛋白抑制性复合物(PRC2),使NR4A3基因启动子区甲基化,下调NR4A3基因的表达水平,使其调控靶基因转录的活性降低,导致下游的靶基因FOXP3的表达下降,进而引起外周血及肝组织局部具有免疫抑制功能的调节性T细胞(Treg)细胞数量减少,打破机体免疫耐受平衡,促进PBC的发生和发展.
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血浆环状RNA hsa_circ_0009024表达在肺结核诊疗中的应用价值
目的 检测肺结核患者血浆中环状RNA(circRNA)hsa_circ_0009024的表达水平,探讨其在肺结核诊断中的应用价值.方法 病例对照研究.采用实时荧光定量PCR法对2016年1月至12月江西省胸科医院收治的90例未经治疗的活动性肺结核病患者(结核病组)、75名健康体检者(健康组)和84例其他疾病患者(其他疾病组)血浆中hsa_circ_0009024的表达水平进行检测.90例肺结核患者据肺部空洞情况分为无空洞组(55例)和有空洞组(35例);据肺部病灶范围分为<2个肺野组(49例)和≥2个肺野组(41例).对41例接受抗结核治疗的肺结核患者治疗前及治疗后3个月血浆hsa_circ_0009024水平进行动态监测.应用ROC曲线分析hsa_circ_0009024诊断肺结核的敏感度和特异度.两组间比较采用Mann-Whitney U检验,多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验.结果 肺结核患者血浆hsa_circ_0009024表达水平[1.98(1.42,2.71)]显著高于健康组[1.03(0.78,1.33)]和其他疾病组[1.13(0.77,1.51)],差异有统计学意义(H=76.58, P<0.0001).肺部空洞组血浆中hsa_circ_0009024水平显著高于无空洞组(U=392.50,P<0.0001);肺部病灶范围≥2个肺野组血浆中hsa_circ_0009024水平显著高于<2个肺野组(U=590.50,P=0.0008).与抗结核治疗前[2.01 (1.47,2.71)]相比,肺结核患者血浆hsa_circ_0009024表达水平在抗结核治疗后3个月[1.22(0.85, 1.47)]显著降低(U=292.50,P<0.0001).ROC曲线分析显示,血浆hsa_circ_0009024在鉴别结核病组与健康组、其他疾病组的曲线下面积(AUC)分别为0.841、0.811.结论 血浆hsa_circ_0009024有望作为肺结核诊断和疗效监测的潜在生物标志物.
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环状RNA hsa_circ_0031739与2型糖尿病关系的初步研究
目的 筛选高糖处理人脐静脉内皮细胞中差异表达环状RNA,分别在细胞模型中和2型糖尿患者外周血中进行验证,为探索2型糖尿病的生物学诊断标志物奠定基础.方法 以脐静脉内皮细胞作为实验模型,设置对照组(n=3)与高糖组(n=3),分别使用正糖(5.5 mmol/L)及高糖(30.0 mmol/L)条件进行处理,运用高通量测序技术初步筛选差异表达环状RNA.通过PCR和实时定量PCR(q-PCR)技术,在内皮细胞模型中对差异表达环状RNA进行验证.随后,在2型糖尿患者外周血(n=32)及正常人外周血(n=28)中,进一步验证上述差异表达环状RNA.运用t-检验、相关性分析和ROC曲线,对实验结果进行分析.结果 高通量测序共筛选出1087个差异表达环状RNA,其中554个上调,533个下调.从中挑选出6个上调环状RNA在脐静脉内皮细胞模型中初步验证,发现,PCR结果及q-PCR结果与测序结果基本一致.再从中挑选出3个上调为明显的环状RNA在外周血中进一步验证.本研究发现,环状hsa_circ_0031739在外周血样本中的差异表达也具有统计学意义(0.015±0.0025 vs.0.006±0.0013,P=0.0059<0.05),ROC曲线下面积为0.730,并且与血糖和糖化血红蛋白水平正相关(r=0.317,P=0.0137<0.05;r=0.348,P=0.0064<0.05).结论 人脐静脉内皮细胞作为糖尿病研究中常用的细胞模型,高糖处理后存在差异表达环状RNA谱.环状RNA hsa_circ_0031739在细胞模型和2型糖尿病外周血样本中的差异表达均具有统计学意义,与血糖及糖化血红蛋白相关,具有一定的诊断意义.因此,环状RNA hsa_circ_0031739有望成为糖尿病新型生物学诊断标志物,有助于2型糖尿病的综合诊断和疾病机理研究.
关键词： 糖尿病 2型 RNA 生物标记 高通量核苷酸序列分析 -
TT病毒核酸的检测
目的初步测定献血员、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及慢性非甲～戊型,非庚型肝炎患者中TT病毒的感染情况,分析不同TT病毒感染者血清中TT病毒开放读码框架2区部分基因序列.方法以套式聚合酶链反应测定TT病毒核酸,取献血员(TX2)、慢性乙型肝炎(TX3)、慢性丙型肝炎(TX4)及慢性非甲～戊型,非庚型肝炎患者(TX1)各1例TT病毒PCR阳性产物,以双脱氧核苷酸链终止法测定核苷酸序列.结果检测20例献血员、29例慢性乙型肝炎、31例慢性丙型肝炎及32份慢性非甲～戊型,非庚型肝炎标本,TT病毒核酸阳性者分别占5.0%(1/20)、6.9%(2/29)、29.0%(9/31)和34.4%(11/32).与N22克隆相比,TX1、TX2、TX3与TX4在核苷酸水平的同源性分别为95.41%、98.47%、97.45%和97.96%.结论本组献血员、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及慢性非甲～戊型,非庚型肝炎患者中均存在TT病毒感染者.从本组不同TT病毒感染者血清中分离出4株TT病毒序列,其开放读码框架2区部分基因序列高度保守.
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血浆长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1在乳腺癌中的表达及其临床意义
目的 观察乳腺癌患者血浆中长链非编码RNA(lncRNA)肺腺癌转移相关转录本1 (MALAT1)的表达变化,并探讨其临床意义.方法 应用实时荧光定量PCR方法评估MALAT1不同区域片段在10名健康人血浆中的表达,并检测102例术前、64例术后乳腺癌患者、47例良性乳腺肿瘤患者以及50名健康对照者血浆中内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和MALAT1的表达水平.分析GAPDH的表达与健康人及患者各临床资料的关系,判断其稳定性.应用受试者工作特征曲线(ROC)分析MALAT1鉴别诊断乳腺癌的效能,并与CA153和CEA作比较.分析MALAT1的表达与患者临床病理特征之间的关系以及比较手术前后血浆中MALAT1的表达.正态分布计量资料采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,各组间MALAT1的相对表达量比较采用非参数秩和检验.结果 GAPDH在女性外周血中表达稳定,不受年龄和病理因素的影响(P>0.05),可以用作血浆lncRNAs检测的内源性参照.血浆MALAT1以片段形式存在,各片段表达差异有统计学意义(χ2=27.042,P<0.001).乳腺癌组术前血浆MALAT1的相对表达量5.58(2.17~12.34)高于良性组1.08 (0.61~2.58)(Z=6.209,P<0.001)及健康对照组1.63(0.98~3.51)(Z=4.871,P<0.001),而良性组与健康对照组之间,差异无统计学意义(Z=-1.675,P=0.094).Ⅰ-Ⅱ期乳腺癌患者术前血浆MALAT1较良性组异常高表达,差异有统计学意义(Z=5.593,P<0.001).术后血浆MALAT1相对表达与术前相比降低(Z=-2.248,P=0.025).ROC曲线分析结果显示MALAT1、CA153和CEA曲线下面积AUC分别为0.744、0.619和0.553;三者敏感度分别为54.1%、60.0%、70.0%;特异度分别为86.3%、66.7%、44.1%.乳腺癌患者血浆MALAT1的表达与TNM分期(Z=-1.982,P=0.047)、淋巴结转移(Z=-2.186,P=0.029)和病理分化程度(Z=-2.435,P=0.015)相关.结论 乳腺癌患者血浆中MALAT1高表达,可能是乳腺癌辅助诊断的一项潜在检测指标.
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丙型肝炎患者病毒基因型与抗HCV水平的相关性研究
目的 探讨丙型肝炎患者抗-HCV水平性与病毒基因型的相关性.方法 采用回顾性研究方法,收集2013至2014年上海市15家医疗机构抗-HCV阳性标本603份,应用雅培Architect I1000免疫分析系统进行复检.对复检阳性标本检测HCV RNA及进行基因分型,并以患者的抗HCV浓度水平的四分位间距为区间,分析不同基因型患者抗HCV浓度水平的分布规律,探讨机体对病毒应答的抗体产生与病毒基因型的相关性.各基因型在不同抗体浓度区间分布率比较采用x2检验.结果 603份标本中抗HCV双试剂复检阳性412份(68.33％),其中174(42.3％)份标本检测出HCV RNA;174份HCV RNA阳性标本中169份得到丙肝基因型结果.以抗体浓度四分位间距为区间,不同基因型患者中不同抗体浓度患者的分布为:1a型(8份)1/8、11/8、4/8、2/8;1b型(112份)25.9％(29/112)、17.0％(19/112)、25.9％(29/112)、31.3％ (35/112);2a型(14份)3/14、4/14、5/14、2/14;3a型(11份)3/11、6/11、2/11、0/11;3b型(16份)4/16、11/16、1/16、0/16;6a型(8份)为2/8、2/8、1/8、3/8.在HCV患者中不同基因型的HCV患者的抗体浓度不同,1b、2a、6a型患者抗体浓度分布均匀,1a型患者的抗体浓度(13.65)相对较高,3b型的患者的抗HCV水平(8.77)相对较低,各基因型在不同抗体浓度区间分布率有差异(x2=35.2,P＜0.05).结论 HCV患者的抗体水平与病毒基因型可能存在相关性.由于部分基因型的例数较少,相关性需要更大标本量的研究证实.
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MALAT1降低非小细胞肺癌对吉非替尼药物敏感性的研究
目的：研究人肺腺癌转移相关转录本1基因（ MALAT1）在非小细胞肺癌患者血清中的表达，通过观察转染MALAT1-小干扰RNA（ siRNA）前后表皮生长因子受体（ EGFR）野生型细胞株A549对吉非替尼敏感性的变化，探讨MALAT1与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（ EGFR-TKI）耐药之间的关系。方法应用实时荧光定量PCR方法定量检测2015年4至9月大连医科大学附属第一医院90例非小细胞肺癌、30例肺良性肿瘤患者血清中MALAT1，并与30名健康体检者比较。检测4种非小细胞肺癌细胞株A549、H1299、95D、HCC827中MALAT1表达水平及对吉非替尼半数致死率（IC50），细胞增殖毒性检测（CCK）法检测转染MALAT1-siRNA前后A549细胞对吉非替尼IC50变化，流式细胞术检测转染后细胞凋亡水平，组间比较采用单因素方差分析。结果非小细胞肺癌患者与健康对照组相比，血清中MALAT1表达存在差异（非小细胞肺癌为1.88±2.51，健康对照为1，t＝3.347，P＜0.01）。 MALAT1在EGFR野生型细胞株中较EGFR突变型表达上调（ HCC827为1，A549为4.44±1.05，95D为3.55±0.63，H1299为1.44±0.05）。转染后A549细胞对吉非替尼的耐药性下降至原来的32.1％，流式细胞术检测转染后凋亡率增加[ NC为（9.20±1.85）％、M为（10.24±3.43）％、NC＋G为（14.57±0.41）％、M＋G为（21.48±2.47）％]。结论血清中MALAT1可以初步反映非小细胞肺癌疾病进展程度， MALAT1能够降低非小细胞肺癌对吉非替尼药物敏感性， MALAT1可在一定程度上逆转A549对吉非替尼的耐药。（中华检验医学杂志，2017，40：55-59）
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大环内酯类不敏感卡他莫拉菌的分子流行病学特点及耐药机制
目的 研究大环内酯类不敏感卡他莫拉菌的分子流行病学特点及耐药机制.方法 从2岁以下健康婴幼儿鼻咽部共分离出383株卡他莫拉菌,利用Etest法测定383株卡他莫拉菌对大环内酯类的低抑菌浓度( MIC)；采用头孢硝噻吩色原法测定β内酰胺酶的产生情况；利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对菌株分型；通过聚合酶链反应(PCR)及序列分析对大环内酯类耐药机制进行研究；采用X2检验对6个城市(北京、上海、济南、南京、武汉、东莞)卡他莫拉菌对抗菌药物的不敏感率进行分析比较.结果 按照美国临床和实验室标准化协会( CLSI)判定折点,383株卡他莫拉菌对红霉素和阿奇霉素的不敏感率分别为40％和23％；按照药物代谢动力学/药物效应动力学(PK/PD)判定折点,其对红霉素和阿奇霉素的不敏感率分别为59％和60％.不同城市间卡他莫拉菌对大环内酯类的不敏感率存在显著差别,相对靠北部城市如北京和济南,其不敏感率明显高于相对靠南部城市(P＜0.05).在383株卡他莫拉菌中,有92％( 353/383)的菌株β内酰胺酶阳性；用PFGE方法将选取的37株高耐大环内酯类(MIC ＞256 mg/L)卡他莫拉菌分为14个型,其中有43％ (16/37)的菌株被认为与A型相关.但未发现ermA、ermB、mefA及mefE等耐药基因.在23S rRNA中,A2982T、A2796T及A2983T等突变位点与大环内酯类耐药可能有关.其中A2982T和A2796T突变可能主要介导高水平耐药,A2983T突变可能介导低水平耐药.结论 本研究发现大量大环内酯类不敏感的卡他莫拉菌；其耐药机制可能与23S rRNA位点发生突变有关,且突变位点与大环内酯类的MIC值存在一定关系.
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ITS序列鉴定真菌性鼻窦炎病原的方法评价
目的 建立ITS(包括ITSI-5.8 rRNA-ITS2)测序鉴定真菌性鼻窦炎病原的方法.方法 收集北京同仁医院2006-2008年,经临床与CT诊断为真菌性鼻窦炎,并行鼻内镜手术切除的组织标本270份.所有标本分别进行组织病理检查、压片直接镜检、真菌培养鉴定和核糖体RNA转录间隔区测序分析,通过方法比较,评价序列分析直接鉴定病原真菌的可行性,同时分析真菌性鼻窦炎病原学特征.结果 在270份标本中,组织病理阳性率为80.0%(216/270),压片阳性率为80.0%(216/270),真菌培养阳性率为53.0%(143/270),ITS测序阳性率为63.0%(170/270).经培养得到22个种,6个属.ITS测序鉴定32个种.培养与ITS序列种水平符合率为76.1%(102/143).结论 ITS测序可成为真菌鉴定的辅助工具.
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18S rRNA基因序列分析在临床常见酵母样真菌鉴定中的应用
目的 应用18S rRNA基因序列分析技术对临床分离的常见酵母样真菌进行种的分类鉴定,且与传统方法比较,分析基因序列分析法鉴定临床常见酵母样真菌的可行性.方法 收集北京同仁医院微生物室菌库酵母样真菌115株,提取的DNA用18S rRNA通用引物进行PCR扩增,扩增产物直接测序,测序结果提交GenBank通过核酸序列比对对微生物种属进行鉴定,同时进行真菌显色培养基鉴定、Vitek 32 YBC鉴定,比较3种不同方法鉴定酵母样真菌的种鉴定准确率,阐明应用基因序列分析法鉴定临床酵母样真菌的可行性.结果 18S rRNA基因序列分析法与表型鉴定法相比较,有13株酵母样真菌鉴定结果存在差异:显色培养基仅鉴定出102株,与基因序列分析鉴定的符合率为89.2%(91/102),Vitek 32 YBC鉴定结果与基因序列分析鉴定的符合率为91.3%(105/115);显色培养基、Vitek 32 YBC和18S rRNA基因序列分析鉴定到种的比例分别为88.7%(102/115)、100%(115/115)、100%(115/115).结论 18S rRNA基因序列分析法呵对常见酵母样真菌进行准确分类.
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18S rRNA基因序列分析在临床常见酵母样真菌鉴定中的应用
目的 应用18S rRNA基因序列分析技术对临床分离的常见酵母样真菌进行种的分类鉴定,且与传统方法比较,分析基因序列分析法鉴定临床常见酵母样真菌的可行性.方法 收集北京同仁医院微生物室菌库酵母样真菌115株,提取的DNA用18S rRNA通用引物进行PCR扩增,扩增产物直接测序,测序结果提交GenBank通过核酸序列比对对微生物种属进行鉴定,同时进行真菌显色培养基鉴定、Vitek 32 YBC鉴定,比较3种不同方法鉴定酵母样真菌的种鉴定准确率,阐明应用基因序列分析法鉴定临床酵母样真菌的可行性.结果 18S rRNA基因序列分析法与表型鉴定法相比较,有13株酵母样真菌鉴定结果存在差异:显色培养基仅鉴定出102株,与基因序列分析鉴定的符合率为89.2%(91/102),Vitek 32 YBC鉴定结果与基因序列分析鉴定的符合率为91.3%(105/115);显色培养基、Vitek 32 YBC和18S rRNA基因序列分析鉴定到种的比例分别为88.7%(102/115)、100%(115/115)、100%(115/115).结论 18S rRNA基因序列分析法呵对常见酵母样真菌进行准确分类.
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实时荧光逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA的临床应用
目的 探讨实时荧光逆转录(RT)-PCR方法检测急性戊型肝炎患者血清戊型肝炎病毒(HEV)RNA的意义.方法 采用实时荧光RT-PCR方法,对HEV ORF3基因保守区进行扩增和检测.收集北京佑安医院住院和门诊434例急性戊型肝炎患者血清;甲型肝炎患者40例、乙型肝炎患者100例、健康献血员110名作为对照组;提取HEV RNA进行荧光RT-PCR检测.结果 434例急性戊型肝炎患者血清中232例(53.5%)为HEV RNA阳性.对照组血清HEV RNA检测均为阴性.与血清抗-HEV IgM检测比较,434例急性戊型肝炎患者HEV RNA检测的总符合率为67.1%,两种检测方法差异有统计学意义(Kappa=0.308,P=0.000).5例患者的首份血清检测为HEV RNA阳性,但抗-HEV IgM为阴性,系列追踪检测,相继出现抗-HEV IgM阳性.急性戊型肝炎患者的血清HEVRNA的检出多在发病的2～10 d内.结论 荧光RT-PCR方法有较高的特异性,应用实时荧光RT-PCR方法能对Ⅰ和Ⅳ戊型肝炎病毒感染的患者血清中的RNA进行定性检测.在临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平.
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肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药性及耐药机制研究
目的 了解肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)对大环内酯类抗生素的耐药情况及耐药机制.方法 对370份咽拭子标本进行MP分离培养,应用套式PCR扩增MP种特异16S核蛋白体RNA(16SrRNA)基因对临床分离株进行分子鉴定;通过药物敏感实验测定MP分离株对大环内酯类药物的MIC并筛选出耐药株;设计套式PCR扩增红霉素作用靶位23S核蛋白体RNA(23SrRNA)基因,扩增产物进行全自动DNA测序,测得序列与NCBI已登录的MP标准株M129(登录号X68422)23SrRNA基因作比对.结果 370份临床标本中分离MP 50株,分离阳性率为13.5%.50株中敏感株4株,耐药株46株(占92%).耐药菌株的红霉素、阿奇霉素、交沙霉素MIC值均升高.4株敏感株和肺炎支原体国际标准株FH的23SrRNA基因序列与基因库的MP基因序列相同,46株耐药株的23SrRNA基因发生点突变,41株突变位点在23SrRNA V区中心环的2063位,其中40株发生了A→G的点突变,1株发生了A→C的点突变;另5株突变位点在2064位,A→G.结论 MP对大环内酯类抗生素耐药率高,耐药性的分子基础是23SrRNA基因的点突变,其中2063位点突变占主导地位.23SrRNA基因发生点突变的肺炎支原体对红霉素、阿奇霉素及交沙霉素的MIC值均升高.
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增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建
目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.
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△Np73基因沉默对结肠癌细胞5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响
目的 探讨小干扰RNA(siRNA)调节导致的△Np73抑制对结肠癌细胞SW620 5-氟尿嘧啶(5-FU)药物敏感性的影响,为结肠癌治疗提供新途径.方法 将△Np73 siRNA转染人SW620结肠癌细胞,观察其对结肠癌细胞△Np73表达的影响.并与5-FU联合使用,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测细胞活力,流式细胞技术检测细胞凋亡.分别将转染△Np73 siRNA和阴性对照siRNA的SW620细胞注射裸鼠成瘤,瘤中注射5-FU观察体内肿瘤的生长情况.结果 △Np73 siRNA可显著抑制SW620结肠癌细胞△Np73的表达,但本身均不能抑制SW620结肠癌细胞的生长.同时应用△Np73 siRNA和5-FU共同处理的SW620细胞的凋亡率达到42.9%,显著高于单纯5-FU处理组(18.9%)和单纯△Np73处理组(8.8%).在转染△Np73 siRNA的成瘤小鼠的瘤中注射5-FU,能明显抑制癌细胞体外生长(t=15.32,P<0.05).结论 △Np73 siRNA可通过抑制△Np73的表达,从而增强对化疗药物的敏感性.
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噬菌体宿主谱改变核酸分析研究
目的探讨一种高效提取RNA噬菌体核酸的新方法,并通过核酸分析从基因水平了解宿主谱改变对噬菌体核酸的影响.方法采用传统的聚乙二醇(PEG)沉淀-蛋白酶消化-酸性酚提取法、Tripure 提取法以及抗体沉淀-盐酸胍一步法3种方法分别提取大肠埃希菌f2噬菌体及其宽宿主谱株的RNA,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度.采用兼并引物逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及随机引物随机扩增多态性DNA 聚合酶链反应(RAPD-PCR)比较分析噬菌体宿主谱改变前后其核酸序列组成的变化.结果抗体沉淀-盐酸胍一步法提取的噬菌体核酸具纯度高、条带完整等优点;f2噬菌体及其宽噬株均为6 000 bp左右的单链RNA噬菌体;两噬菌体基因cDNA扩增出的RAPD-DNA片段差异明显,其中26条为可区分的DNA带型;噬菌体f2 cDNA在450 bp附近出现重复性较好的扩增片段,而其宽噬株cDNA在相同条件下未出现扩增产物.结论抗体沉淀-盐酸胍一步法较其他两种RNA病毒核酸提取法具有明显的优势,具有应用价值的新的RNA噬菌体核酸的提取方法;宽宿主谱噬菌体的宿主特异性裂解效应已从基因水平发生了变化.
关键词： RNA 噬菌体 逆转录聚合酶链反应 随机扩增多态DNA技术 -
肿瘤标志物的临床应用与研究进展
恶性肿瘤严重威胁人类健康，提高恶性肿瘤的早期诊断水平，可有效降低其病死率、改善预后。肿瘤标志物的合理应用评价及高效诊断肿瘤的标志物筛选研究仍然是目前面临的重点和难点。各种技术平台特别是新一代测序技术及相关转化医学的发展与应用，肿瘤标志物研究在蛋白质、DNA和RNA水平等均取得了迅速进展。相信随着对肿瘤发生发展基础研究的不断深入，以及临床确证技术的进步，通过前瞻性多中心研究进行科学合理地评价，制定适用于我国人群不同肿瘤的肿瘤标志物诊断策略必将成为可能。（中华检验医学杂志，2014，37：641-644）
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长链非编码 RN A在原发性肝癌中的临床应用
长链非编码RNA（long noncoding RNA， lncRNA）是一类长度大于200nt、不能编码蛋白质的RNA，参与了基因调控的各个层面。近来的研究发现，多种lncRNA在肝癌组织中表达异常，可能在肝癌发生、发展中起着重要的调控作用。（中华检验医学杂志，2014，37：665-668）
