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shRNA稳定转染抑制氯离子通道蛋白1基因的表达对小鼠肝癌细胞的影响
目的 将shRNA 稳定转染至小鼠肝癌细胞株Hca-F 中,使得氯离子通道蛋白1(CLIC1)基因表达抑制,观察肿瘤细胞的增殖、细胞周期、凋亡情况以及迁移能力的变化.方法 设计并合成理论上佳的shRNA 序列,进而将其插入pGPU6 /GFP /Neo 质粒中,经测序和双酶切验证载体构建成功后以梭华-Sofast 将DNA 质粒稳定转染至小鼠肝癌细胞株Hca-F 中,经Real-time RT-PCR 验证CLIC1 mRNA 表达下调后,应用CCK-8 试剂盒和流式细胞仪检测干扰前后的Hca-F 细胞,对比观察细胞的增殖、细胞周期和凋亡情况的变化,应用Transwell 小室检验其迁移能力的变化.结果 pGPU6 /GFP /Neo-shRNA 对CLIC1 mRNA 抑制效果明显,抑制率达57%.经该表达质粒的干扰后,Hca-F 细胞的增殖能力明显增强,停留于G2 /M 期的细胞明显增多,凋亡细胞显著减少,Transwell 小室中穿膜细胞数量明显减少.结论 CLIC1 基因具有抑制小鼠肝癌细胞的增殖和促进其凋亡的作用,并且参与细胞周期中G2 /M 期的调节,同时能够促进肿瘤细胞的迁移.
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人核小体结合蛋白1小分子干扰RNA重组慢病毒抑制非激素依赖性前列腺癌体内生长的实验研究
目的 探讨重组慢病毒介导的人核小体结合蛋白1(NSBP1)基因沉默对非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145移植瘤生长的抑制作用及机制.方法 慢病毒lentivirus-NSBP1 转染非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145.用转染细胞成瘤,观察抑瘤效果.运用实时RT-PCR 和Western blot 方法检测移植瘤中NSBP1、cyclinB1 与Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表达.结果 体内实验证实NSBP1 表达水平的降低,对肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用.同时随着NSBP1 表达水平的降低,cyclinB1 和Bcl-2 的mRNA 及蛋白的表达也降低.结论 NSBP1-RNAi-lentivirus 重组慢病毒能有效抑制DU145 细胞移植瘤的生长,NSBP1 可能通过调控cyclinB1、Bcl-2 基因的变化影响肿瘤细胞的生长.
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Notch1 siRNA对骨髓瘤细胞硼替佐米药物敏感性的影响
目的：探讨Notch1 siRNA对体内外人骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞硼替佐米药物敏感性的影响。方法体外采用Notch1 siRNA转染RPMI-8226细胞，CCK-8实验检测细胞增殖及硼替佐米药物的敏感性；Western blot检测各组细胞Notch1蛋白表达变化；将RPMI-8226细胞皮下注射于NOD/SCID小鼠，建立人多发性骨髓瘤（MM）小鼠移植瘤模型，将成瘤小鼠分为三组：NS＋bortezomib（Notch1 siRNA转染联合硼替佐米）组；CS＋bortezomib（Control siRNA转染联合硼替佐米）组；UN＋bortezomib（硼替佐米）组，观察各组肿瘤体积变化，免疫组化染色法观察Notch1变化，TUNEL法检测细胞凋亡。结果 Notch1 siRNA有效下调骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞Notch1蛋白表达；Notch1 siRNA在96 h抑制细胞增殖作用明显增加，与CS及UN组比较对细胞增殖的作用可见明显差异（P＜0.01）；Notch1 siRNA 转染组细胞对硼替佐米 IC50值为1.21μmol/L，与Control siRNA 转染组及未转染组相比均存在统计学差异（P＜0.01）；Notch1 siRNA 降低移植瘤Notch1蛋白表达，Notch1 siRNA转染组细胞的AI明显高于Control siRNA转染组及未转染组（P＜0.01）；Notch1 siRNA转染联合硼替佐米组肿瘤体积明显减小，13、17及21 d与Control siRNA转染联合硼替佐米组比较均有统计学差异（P＜0.05）。结论体外实验Notch siRNA抑制人骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞增殖增加硼替佐米的敏感性，体内试验证实Notch siRNA联合硼替佐米可以明显减小荷瘤MM小鼠肿瘤体积、增加凋亡，提示Notchl是治疗MM的有效分子靶点。
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探讨肝再生磷酸酶3在脑胶质瘤细胞SHG-44中作用
目的研究肝再生磷酸酶3（PRL-3）在胶质瘤细胞SHG-44中作用。方法采用siRNA干涉的方法下调SHG-44中PRL-3表达水平，通过Western blot方法检测干涉效果，绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期及凋亡以观察下调PRL-3对SHG-44细胞的影响。结果 Western blot提示siRNA能够下调PRL-3在SHG-44细胞中的表达，细胞生长曲线显示下调PRL-3能够抑制细胞的增殖，流式细胞仪检测发现下调PRL-3的表达可以促进SHG-44细胞G1期阻滞，S期减少，凋亡增加。结论下调PRL-3能够明显抑制SHG-44细胞的增殖，PRL-3很可能成为脑胶质瘤基因治疗的新靶点。
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特异性小干扰 RNA 靶向沉默 RIP1基因表达对人大肠癌 Lovo 细胞生物学行为的影响
目的探讨 RNA 干扰沉默 RIP1基因表达对人大肠癌 Lovo 细胞生物学行为的影响。方法将人大肠癌Lovo细胞常规分为空白对照、阴性对照组和实验转染组。体外化学合成RIP1基因序列特异性小干扰RNA（siRNA），Hegene介导转染人大肠癌细胞株Lovo细胞；采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测特异性siRNA对RIP1基因在mRNA水平上沉默效果；转染后采用噻唑蓝（ MrI′r）比色法检测siRNA对细胞增殖的影响；流式细胞周期法检测siRNA对细胞周期的影响；Transwell试验体外检测细胞迁移和侵袭能力。结果成功转染RIP1 siRNA的大肠癌Lovo细胞，RT-PCR显示RIP1 mRNA和蛋白表达在相应的癌细胞中明显下降；与阴性对照组比较，细胞增殖明显抑制（ P ＜0.05）；G0～G1期细胞[（54.68±1.54）％]明显多于阴性对照组[（48.48±1.96）％]和空白对照组[（43.92±1.68）％]；RNA干扰明显抑制Lovo细胞迁移力和侵袭力（21±2.731 vs．43±2.064）。结论 RIP1 siRNA可有效抑制大肠癌Lovo细胞RIP1基因的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞迁移和侵袭，RIP1 siRNA能有效调控Lovo细胞恶性生物学行为。
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化学合成小干扰RNA对PC12细胞N gR表达的影响
目的： Nogo及Nogo-66受体（NgR）对抑制中枢神经系统再生有重要的作用。本文主要观察化学合成NgR特异性小干扰RNA（siRNA）对具有神经元分化潜能的克隆细胞系PC12细胞 NgR mRNA 和蛋白表达的影响。方法培养大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞 PC12细胞，神经生长因子（NGF）诱导使其分化为类神经细胞，化学合成一段针对大鼠NgR基因编码区的siRNA，用阳离子脂质体使之转染类神经细胞，转染后48 h，采用实时荧光定量PCR检测mRNA水平；并采用蛋白免疫印迹检测NgR蛋白表达的变化，检测干扰的效果。结果荧光定量PCR结果显示：转染后48 h NgR mRNA水平明显下降，差异具有显著性（P＜0.05）；同时蛋白免疫印迹结果显示，NgR蛋白表达水平与对照组比较也降低，差异同样具有显著性（P＜0.05）。结论化学合成NgR特异性siRNA可以实现大鼠神经细胞内源性NgR基因沉默。
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JAG2基因沉默影响大肠癌细胞株侵袭能力的研究
目的： Notc h 信号在肠上皮细胞种系分化和引发肠腺瘤和肠癌中起着关键的作用。本文试图探讨Notch信号的配体JAG2在大肠癌中的作用。方法Real-Time PCR和Western blot分别检测JAG2特异性siRNA对JAG2 mRNA及蛋白表达的抑制率，细胞增殖实验和细胞侵袭实验观察siRNA对细胞增殖及侵袭能力的影响，人类肿瘤转移RT2 Profiler? PCR Array用于筛选JAG2下游靶基因，并应用特异性抑制化合物抑制靶蛋白活性。结果特异性siRNA对JAG2 mRNA及蛋白的表达具有抑制作用（P＜0.05），对细胞增殖无明显影响（P＞0.05），对细胞侵袭能力明显抑制（P＜0.05），而组织蛋白K（CTSK）活性降低可能参与了这一过程。结论 JAG2基因可能对大肠癌细胞的侵袭转移能力起促进作用。
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survivin基因沉默对“三阴”乳腺癌细胞株中caspase3和caspase7基因的影响
目的 探讨“三阴”乳腺癌细胞中沉默survivin基因对抑癌基因caspase3和caspase7的影响.方法 针对survivin基因设计干扰片段并与真核表达载体pGCsilencerTMU6/Neo/GFP进行连接,之后转染“三阴”乳腺癌细胞MDA-MB-231；通过RT-PCR鉴定survivin基因mRNA水平沉默效果；用RT-PCR检测沉默survivin基因对caspase3和caspase7表达及细胞凋亡的影响.结果 survivin基因沉默可引起MDA-MB-231细胞凋亡；caspase3和caspase7表达升高,灰度分析结果显示差异具有统计学意义(P =0.008).结论 (1)RNAi技术沉默MDA-MB-231细胞中survivin基因,达到了对其表达的抑制效果；(2)survivin基因沉默可上调caspase3和caspase7的表达；(3) survivin基因沉默可引起细胞凋亡；(4) survivin基因可作为“三阴”乳腺癌基因治疗的新靶点.
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NSBP1调节非激素依赖性前列腺癌DU145细胞的凋亡和增殖
目的探讨重组慢病毒介导的人核小体结合蛋白1（NSBP1）基因沉默对非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145凋亡和增殖的调控机制。方法慢病毒lentivirus-shRNA-NSBP1转染非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145，MTT法检测细胞生长活性，流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期。 Western blot 方法检测敲减NSBP1蛋白后细胞中cyclinB1与BCL-2蛋白的表达。结果体外实验证实NSBP1表达水平的降低，对肿瘤细胞的生长有明显抑制作用，96 h细胞生长抑制率为22.6％。同时随着NSBP1表达水平的降低， cyclinB1和BCL-2的蛋白的表达也降低。结论 NSBP1-RNAi-lentivirus 重组慢病毒能有效抑制DU145细胞的生长，NSBP1可能通过调控cyclinB1、BCL-2基因的变化影响肿瘤细胞的生长。
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CLRs过表达/siRNA慢病毒载体的构建及其瞬时转染树突状细胞的研究
目的：构建C型凝集素受体（C-type lectin receptor，CLRs）过表达/siRNA慢病毒载体，并将其瞬时转染树突状细胞（dendritic cell，DC）。方法免疫磁珠分离、培养及鉴定胎盘和蜕膜来源的DC；构建CLRs过表达/siRNA慢病毒载体并转染DC；抽提转染CLRs过表达/siRNA慢病毒后的DC的总RNA；RT-PCR检测DC转染慢病毒前后CLRs基因mRNA表达量。结果从胎盘分别纯化得到的DC经流式细胞术检测DC纯度为（82.6±2.4）%；根据Genebank数据库成功构建了过表达CLRs基因慢病毒及CLRs基因siRNA慢病毒，病毒量为1×1010 Unit；将构建的两种慢病毒转染DC后，在荧光倒置显微镜下可观察到被转染的阳性细胞有绿色荧光蛋白（GTP）表达，通过流式细胞仪检测，转染效率分别为85%及82%左右；RT-PCR检测发现过表达CLRs基因慢病毒转染DC后mRNA相对含量为（14.26±0.47）%，较空白未转染的DC表达量[（1.67±0.19）%]明显上升（P＜0.01）；CLRs基因siRNA慢病毒转染DC后CLRs mRNA相对含量为（0.03±0.01）%，较空白未转染的 DC 表达量明显下降（P＜0.01）。结论成功构建了表达人CLRs-siRNA的慢病毒载体，它能有效沉默CLRs基因在胎盘DC中的表达并获得了其瞬时转染的DC；成功构建了过表达CLRs的慢病毒载体，它能有效地在体内发挥基因过表达效应并获得了其瞬时转染的DC。
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siRNA靶向沉默hTERT基因对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡和周期的影响
目的 研究hTERT-siRNA对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响.方法 利用RNAi技术靶向沉默Capan-2的hTERT基因表达,应用细胞直接计数法和流式细胞术(FCM)检测Capan-2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的变化.结果 在hTERT-siRNA的使用浓度为50 nm、Lipo转染浓度为3 μl/2 ml转染体积和hTERT沉默效率为100%的条件下,转染hTERT-siRNA 24 h后,细胞生长已明显减慢,抑制细胞增殖率为26.39%(P＜0.05),第2、3、5、7天抑制细胞增殖率分别为46.77%、70.61%、84.71%和85.99%(P＜0.001).随着转染细胞按常规培养时间的延长,早期凋亡细胞明显增多(P＜0.001),以24 h后更明显;活性细胞明显减少(P＜0.001),而损伤细胞明显增多(P＜0.001),以6 h后明显;死亡细胞明显增多(P＜0.001),以24 h后更明显.siRNA组与阴性对照组和Lipo对照组均有明显差异(P＜0.001).G0～G1期细胞明显增多(P＜0.01),S期细胞明显减少(P＜0.01),以24 h后明显;G2～M期细胞明显减少(P＜0.01),以48 h后明显;晚期凋亡细胞增多(P＜0.05),以48 h后明显.结论 hTERT-siRNA可抑制人胰腺癌Capan-2细胞生长,使较多的细胞停留在G0～G1期,而进入G2～M期和S期的细胞减少,可促进细胞凋亡.
关键词： 胰腺肿瘤 Capan-2细胞株 RNA指导的DNA聚合酶 RNA 小分子干扰 细胞增殖 细胞凋亡 细胞周期 -
小分子干扰RNA沉默T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3表达对暴发性肝衰竭小鼠Kupffer细胞分泌细胞因子的影响
目的探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族3（Tim-3）的小分子干扰RNA（siRNA）质粒对暴发性肝衰竭小鼠肝Kupffer细胞活化的调节作用并探讨其相关机制。方法采用D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）和脂多糖（LPS）建立暴发性肝衰竭小鼠模型。将30只大鼠分成对照组及模型组，每组15只。分离所有小鼠Kupffer细胞，用特异性靶向Tim-3的siRNA片段沉默小鼠肝Kupffer细胞中的Tim-3，同时将模型组小鼠进一步分成空转染组、特异siRNA组及阴性siRNA组。采用Real time PCR和Western blot检测Tim-3的表达，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Tim-3沉默后Kupffer细胞中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）及IL-6的表达，并采用ELISA及Western blot检测核因子-κB（NF-κB）通路对炎性细胞因子表达的影响。结果模型组Tim-3 mRNA的表达显著高于对照组（48.3±6.8 vs.10.3±1.8，t=0.007，P<0.05），且特异siRNA组Tim-3 mRNA的表达（18.3±3.5）显著低于空转染组（58.3±7.5）及阴性siRNA组（57.3±7.1）的表达（F=118.5，P<0.05）。在转染后3、6、24 h，特异siRNA组中TNF-α（F=68.76、73.55、92.36，P均<0.05），IL-1β（F=32.1、86.5、112.3，P均<0.05）及IL-6（F=178.9、98.7、89.9，P均<0.05）的表达均显著高于空转染组及阴性siRNA组。同时，特异siRNA组的NF-κB蛋白的表达在转染3 h （F=48.9，P=0.020）、6 h （F=107.4，P=0.002）、24 h （F=148.9，P=0.001）均显着高于空转染组及阴性siRNA组。结论 Tim-3通过NF-κB蛋白表达参与了暴发性肝衰竭小鼠肝Kupffer细胞活化的调节。
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潜伏性结核菌感染者血浆长链非编码RNA表达谱差异分析
目的：探讨长链非编码RNA （ lncRNA ）在潜伏性结核菌感染中差异性表达。方法选择2015年1至6月在珠海市慢性病防治中心诊断的潜伏性结核菌感染患者血浆33例（病例组），纳入标准为年龄范围18～40岁，确诊的涂阳肺结核病例密切接触者；胸部影像学检查正常；皮肤结核菌素试验强阳性；6个月后随访未患活动性肺结核。对照组选自同一机构体检科健康人群血浆33名，纳入标准为年龄范围18～40岁，排除肺结核或其他肺部疾病，皮肤结核菌素试验阴性。病例组和对照组各3例用于lncRNA芯片实验，30例用于RT－PCR验证实验。 Trizol法抽提总RNA后，利用lncRNA芯片技术进行高通量检测，建立潜伏性结核菌感染者的lncRNA基因表达谱。筛选6个差异表达明显的lncRNA，利用实时定量PCR技术，在30例扩大化样本中进行验证，获得高灵敏度、高特异性的生物标志物。利用基因功能分析、基因通路分析初步分析差异基因的表达功能。数据的正态性检验采用Kolmogorov－Smirov（K－S），正态分布资料两个样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两样本率的比较用χ2检验。结果潜伏性结核感染的特异性差异表达lncRNA共1485个，占所检测lncRNA 总数的4．9％，其中上调819个，下调666个。 ENST00000566054（ t＝10．92，P＜0．001）、TCONS＿00016510（t＝2．98，P＝0．004）在潜伏性结核菌感染者血浆中表达水平显著上调，NR＿034120表达水平显著下调（ t＝－16．63， P＜0．001）。基因功能分析中，上调表达的mRNA中，有382个基因富集于生物学进程、60个基因富集于细胞组件、43个基因富集于分子功能；下调表达的mRNA中，有276个基因富集于生物学进程、55个基因富集于细胞组件、55个基因富集于分子功能；基因通路分析上调的mRNA主要富集于7条生物学途径，下调的mRNA主要富集于7条生物学途径。结论 lncRNA在潜伏性结核菌感染血浆中异常表达，提示lncRNAs参与潜伏性结核菌感染的分子调节过程。（中华检验医学杂志，2016，39：857－863）
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结直肠癌患者血清PCAT-1的表达及其意义
目的 分析血清前列腺癌相关非编码RNA转录物1(PCAT-1)在结直肠癌(CRC)中的辅助诊断价值.方法 收集2015年10月至2017年1月在南通大学附属医院手术治疗并经病理确诊的CRC患者73例,结直肠息肉患者54例,健康对照者62名.运用实时荧光定量PCR的方法分别检测CRC患者、结直肠息肉患者、健康对照者血清PCAT-1的表达水平.分析CRC患者血清PCAT-1的相对表达水平与临床病理特征的关系.受试者工作特征曲线(ROC曲线)评估PCAT-1、癌胚抗原(CEA)及糖类抗原199(CA199)单独和联合检测对CRC的诊断价值.结果 CRC患者、结直肠息肉患者和健康对照者血清PCAT-1的相对表达量分别为2.1900(0.8525,6.7150)、0.5865(0.3318,1.6970)、0.5300(0.1275,0.9575).CRC患者血清PCAT-1的表达水平与患者年龄(U=593,P=0.7533)、性别(U=536,P=0.3908)、肿瘤大小(U=549,P=0.5572)、肿瘤部位(U=584,P=0.4267)无关,而与肿瘤分化程度(U=30,P=0.0384)和肿瘤分期(U=399,P=0.0050)相关.ROC曲线分析血清PCAT-1、CEA及CA199对CRC的诊断效能.CRC患者区别于健康对照者,PCAT-1、CEA和CA199的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.836、0.756、0.493.三项指标联合检测敏感度为93.2％(68/73),高于单一指标.CRC患者区别于结直肠息肉患者,ROC曲线下面积分别为0.739、0.673、0.515.三项指标联合检测敏感度为95.9％(70/73),高于单一指标.结论 PCAT-1对CRC具有辅助诊断价值.PCAT-1、CEA和CA199联合检测显著提升CRC的诊断效能.
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肺外结核感染的快速分子检测和菌株分型方法的应用
目的 应用结核分枝杆菌rRNA直接检测(MTD)和多位点PCR菌株分型方法,检测肺外结核标本中的结核分枝杆菌,评价其在肺外结核感染的快速检测和菌株分型中的应用价值.方法 回顾性分析2010年6月至2011年12月上海市公共卫生临床中心47例儿童肺外结核、75例成人肺外结核以及48例非结核病患者的脑脊髓液、穿刺液等标本.用涂片法、L-J固体培养法、MGIT960液体培养法和MTD法进行平行检测,对培养阳性菌株应用MPT64胶体金初筛.MPT64阴性菌株采用多位点PCR菌株分型方法进行快速分型,并用化学法确认.采用SPSS16.0进行统计分析.结果 涂片法、L-J固体培养法、MGIT960液体培养法和MTD法检测肺外结核的敏感度依次为:10.7％(13/122),11.5％ (14/122),16.4％ (20/122)和37.7％(46/122),特异度均为100.0％.20株培养阳性的菌株,其中6例儿童患者临床分离菌株为MPT64胶体金检测阴性,经多位点PCR菌株分型方法、化学法分型鉴定为卡介苗菌株.多位点PCR菌株分型方法与传统化学法结果一致,但可在4h内完成检测.结论 与传统病原学检测方法比较,MTD法检测结核分枝杆菌快速简便,结果灵敏可靠；同时应用多位点PCR菌株分型方法,可对儿童肺外结核患者进行快速的早期鉴别诊断.
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TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-2γmRNA表达水平
目的建立TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-2γ(MIP-2γ)mRNA表达水平,并对方法进行评估.方法 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测MIP-2γ mRNA的表达.结果线性检测范围达6个数量级,低检测下限为6×102拷贝,高检测上限为6×107拷贝,批间及批内变异<122%. 正常Balb/c小鼠心脏、肝脏、肾脏组织均可检测到MIP-2γ mRNA表达,以心脏表达水平高.结论采用TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测MIP-2γ mRNA表达水平准确、特异、灵敏、快速、操作简便,具有临床推广价值.
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酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物
目的建立一灵敏、快速的检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA逆转录-套式聚合酶链反应(PCR)产物的酶免疫法.方法对第2次PCR所用的引物进行双标记,使扩增产物同时被修饰有生物素和荧光素(fluorescein)成分,再经过固相的链亲合素进行捕获、辣根过氧化物酶标记的抗-fluorescein反应后显色测定.结果所建立的方法与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳法相比灵敏、快速、准确,结果判断客观,重复性也较好;所测结果可反映PCR产物量的多少,但不能准确表示模板量的大小.结论建立的方法可取代电泳法而成为HCV RNA常规PCR反应产物的检测技术.
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酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物
目的建立一灵敏、快速的检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA逆转录-套式聚合酶链反应(PCR)产物的酶免疫法.方法对第2次PCR所用的引物进行双标记,使扩增产物同时被修饰有生物素和荧光素(fluorescein)成分,再经过固相的链亲合素进行捕获、辣根过氧化物酶标记的抗-fluorescein反应后显色测定.结果所建立的方法与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳法相比灵敏、快速、准确,结果判断客观,重复性也较好;所测结果可反映PCR产物量的多少,但不能准确表示模板量的大小.结论建立的方法可取代电泳法而成为HCV RNA常规PCR反应产物的检测技术.
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下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离与鉴定
目的 对痰涂片镜检可疑为马拉色菌的标本进行马拉色菌的分离培养,并对分离菌株进行系统鉴定.方法 收集2010年3月至201 1年9月卫生部北京医院经派克墨水染色镜检可疑为马拉色菌的下呼吸道分泌物标本133份,接种于含1％吐温60的科玛嘉琼脂培养基(即改良念珠菌显色培养基),于35℃大气环境中培养.挑取疑似菌落在含0.5％吐温40和0.5％吐温60的沙保弱平板上进行纯培养.采用传统的表型鉴定方法对分离菌株进行鉴定,包括染色镜检观察菌体形态及染色性、沙保弱培养基生长试验、吐温试验、七叶苷分解试验、过氧化氢试验、吐温沉淀试验和蓖麻油试验,可疑菌株采用18s rRNA基因序列分析方法对分离菌株进行菌种鉴定.结果 镜检可疑的下呼吸道分泌物中马拉色菌分离率为47.4％ (63/133),63株分离菌经传统的表型鉴定方法结合l8srRNA基因序列分析方法均鉴定为糠秕马拉色菌.标本直接涂片,用派克墨水染色镜下可明显区分马拉色菌和念珠菌.结论 糠秕马拉色菌在改良念珠菌显色培养基上的菌落呈粉红色,可明显区别于其他念珠菌菌落,用改良念珠菌显色培养基可提高下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离率.传统的表型鉴定结合基因序列分析可提高马拉色菌鉴定的准确性.
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MALDI Biotyper和VITEK MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对链球菌鉴定的比较研究
目的 以16S rRNA基因测序鉴定结果为金标准,研究比较两种基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定系统(MALDI Biotyper和VITEK MS)在临床分离链球菌鉴定中的表现.方法 2014年4至6月收集浙江大学医学院附属第二医院临床分离的链球菌162株,经16S rRNA基因测序确认菌种,分别使用MALDI Biotyper和VITEK MS质谱鉴定系统进行鉴定,并评价其鉴定能力.结果 MALDI Biotyper鉴定系统将155株(155/162,95.68％)链球菌准确鉴定到种,将3株缓症链球菌群鉴定为肺炎链球菌,1株副血液链球菌鉴定为澳大利亚链球菌,另有3株肺炎链球菌不能准确鉴定(分值＜1.7);VITEK MS鉴定系统将156株(156/162,96.30％)链球菌准确鉴定至种(包括亚种),其将2株肺炎链球菌鉴定为缓症链球菌/口腔链球菌,1株马肠链球菌鉴定为婴儿链球菌婴儿亚种.两系统对化脓性链球菌和无乳链球菌的鉴定准确率均为100％ (51/51),对肺炎链球菌的准确率均＞85％.结论 两系统对临床分离的链球菌均有较强的鉴定能力,VITEK MS系统对某些亚种的准确鉴定更有临床意义.质谱可作为临床链球菌快速鉴定的手段.
