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  • 荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药基因的结果分析

    作者:刘艳;古丽比克·木拉提;玛力亚木·阿布力提甫;易星;李君莲;师永欢;刘天剑

    目的 分析和探讨荧光PCR熔解曲线法对结核病的诊断和耐药检测的应用价值.方法 收集2015年9月至2016年12月新疆维吾尔自治区胸科医院的976例疑似结核病患者的痰标本,运用探针荧光PCR熔解曲线法来检测结核分枝杆菌及其对利福平、异烟肼的耐药突变情况.以BACTEC MGIT 960液体培养法及液体药敏试验检测结果为标准,评价探针荧光PCR熔解曲线法鉴定结核分枝杆菌及其耐药突变检测的敏感度、特异度、一致率、Kappa值等.结果 以MGIT 960液体培养结果为标准,荧光PCR熔解曲线法鉴定结核DNA的敏感度为85.44%(135/158),特异度为94.01%(769/818),Kappxa值为0.75,诊断符合率为92.62%(904/976).以MGIT960液体药敏试验结果为标准,荧光PCR熔解曲线法对异烟肼耐药突变检测的敏感度为83.33%(20/24),特异度为94.59%(105/111),Kappa值为0.76,诊断符合率为92.59%(125/135);荧光PCR熔解曲线法对利福平耐药突变检测的敏感度为95.83%(23/24),特异度为95.50%(106/111),Kappa值为0.86,诊断符合率为95.56%(129/135).结论 荧光PCR熔解曲线法检测速度快,对利福平和异烟肼耐药突变检测结果具有良好的敏感度和特异度,可用于临床上对结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药情况的快速筛查.

  • 恒温扩增荧光检测技术在基层结核病实验室的应用价值

    作者:马晓光;郑丹薇;朱岩昆;石洁;王少华;李辉

    目的 探讨在基层结核病实验室采用恒温扩增荧光检测技术检测可疑肺结核患者痰标本诊断结核病的价值.方法 搜集河南省4个项目点县级结核病实验室2014-2015年期间可疑肺结核患者的痰标本4242例,分别进行痰涂片、痰培养和恒温扩增荧光检测技术检测,比较恒温扩增荧光检测技术和传统痰涂片、痰培养方法的敏感度、特异度等.计数资料采用x2检验,以P<0.05为差异有统计学意义.结果 纳入的4242例患者中,痰涂片检出阳性者35t例,阳性检出率为8.21%(351/4276);痰培养检出阳性者576例,阳性检出率为13.47%(576/4276);恒温扩增荧光检测技术检出阳性者733例,阳性检出率为17.14%(733/4276).3种检测技术的阳性检出率比较,差异有统计学意义(x2=153.412,P<0.001).以痰培养试验结果为标准,恒温扩增荧光检测技术的敏感度和特异度分别为86.81%(500/576)、93.64%(3433/3666);阳性预测值为68.21%(500/733),阴性预测值为97.83%(3433/3509),与痰培养有较高的一致性(Kappa值为0.722).痰涂片检测的敏感度为57.29%(330/576),特异度为99.43%(3645/3666),阳性预测值为94.02%(330/351),阴性预测值为93.68%(3645/3891);Kappa值为0.679.痰涂片与恒温扩增荧光检测技术检测痰标本的敏感度比较,差异有统计学意义(x2=153.336,P<0.001).结论 恒温扩增荧光检测技术检测的敏感度和特异度均明显高于传统的痰涂片,且其具有检测快速、操作简便等优势,便于在我国基层结核病实验室中推广应用.

  • 结晶型硫化镍诱发细胞恶性转化过程中基因组总体DNA甲基化的改变

    作者:杨淋清;纪卫东;陶功华;张文娟;龚春梅;周丽;刘建军;柯跃斌;庄志雄

    目的 探讨结晶型硫化镍(NiS)对体外培养细胞基因组总体DNA甲基化水平的影响.方法 分别以0.25、0.50、1.00、2.00 μg/cm2结晶型NiS处理人支气管上皮细胞系(16HBE)24 h,隔天再次进行相同处理,共处理3次;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理72 h的正常细胞为阳性对照.应用免疫荧光法和SssI甲基转移酶法定性、定量分析结晶型NiS处理细胞和恶性转化细胞(NSTC)基因组DNA总体甲基化的变化.结果 结晶型NiS处理细胞DNA甲基化免疫荧光的强度均有不同程度降低,转化细胞DNA甲基化免疫荧光的强度明显降低.定量分析结果显示,对照组基因组总体甲基化率(mCpG%)为(81.9±7.3)%,0.25、0.50、1.00、2.00 μg/cm2的结晶型NiS处理3次的细胞(NiS0.25、NiS0.50、NiS1.00、NiS2.00)基因组总体mCpG%则分别为(77.9±6.2)%、(75.3±6.8)%、(59.5±4.9)%、(67.4±5.1)%.经单因素方差分析显示,不同组间总体mCpG%差异有统计学意义(F=124.95,P<0.01),两两比较发现NiS1.00和NiS2.00组与对照组相比,差异均有统计学意义(t值分别为7.64、4.89,P值均<0.01);恶性转化细胞(NSTC1、NSTC2)基因组总体mCpG%分别为(46.2 ±4.1)%、(43.6±4.3)%,低于对照组,差异有统计学意义(t值分别为12.79、13.56,P值均<0.01).结论 结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中,整体基因组DNA甲基化水平降低.

  • 人乳头状瘤病毒在河南省农村妇女中的感染情况

    作者:李晓莉;王鹤;李长卿;武燕萍;刘金红;宋丹;刘新伏;乔友林

    目的 在我国河南省农村地区调查妇女高危型人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染情况,并探讨与人乳头状瘤病毒感染有关的危险因素.方法 对河南省新密市的农村妇女(881名)开展以人群为基础的子宫颈癌横断面调查,分析其中20~54岁有性生活史的女性.使用自我取样和医生取样2种方法收集妇女阴道分泌物,使用杂交捕获二代试验(hybrid capture 2,HC2)检测标本13种高危型HPV感染情况.对结果异常的妇女进行阴道镜及活组织病理检查,终以病理诊断结果作为金标准.结果 共调查妇女881名,收集HPV自我取样标本881份和医生取样标本880份.自我取样和医生取样HPVs感染率分别是13.05%和12.27%.各个年龄组(20岁~、25岁~、30岁~、35岁~、40岁~、45岁~、50~54岁)HPVs感染率分别是10.57%、9.60%、12.00%、9.52%、17.60%、13.74%、12.80%.随着宫颈病变程度增加HPV感染率呈上升趋势(X2=200.69,P=0.00);随着教育水平的提高HPV感染率逐渐增加(x2=11.05,P=0.01);丈夫性伴侣数>1的妇女HPV感染率是18.02%,丈夫性伴侣数为1的妇女HPV感染率是10.88%,差异有统计学意义(x2=6.37,P=0.01).结论 该地区的高危型HPV感染率较高,HPV感染与年龄无关,性行为是其主要危险因素.

  • 呼吸道合胞病毒的分型研究

    作者:孔晓慧;刘春艳;江载芳;寿好长

    目的 了解北京地区1990~1991年和1997~1998年两个非连续的流行年中呼吸道合胞病毒(RSV)A、B亚型和基因型的流行情况。方法 用间接免疫荧光法(ⅡF)检测RSV阳性鼻咽分泌物(NPS)标本或RSV分离株,划分A、B亚型。根据N基因片段的限制性酶切图型将RSV分离株分成至少6个基因型NP1-6NP1,3和6属于B亚型,NP24和5属于A亚型。根据SH基因片段的核苷酸序列将A亚型分离株进一步划分为SH基因型SHL1-6。SHL之间关系密切,并与NP有关。SHL1,3和4紧密相关,属于NP2;SHL2和6属于NP4;SHL5属于NP5。结果 1997冬季~1998年春季145份RSV NPS标本中,83份(57.2%)为B亚型,62份(42.8%)为A亚型,A:B为1:1.3。1997~1998流行年所获的10株RSV分离株中,2株为A亚型,8株为B亚型,A:B为1:4。1990~1991流行年所获的10株毒株中,8株为A亚型,2株为B亚型,A:B为4:1。1997~1998流行年分离到的10株RSV分离株中,2株A亚型均属NP4,SHL2;而2株B亚型均为NP3。根据NP推导出的A、B亚型划分与单克隆抗体定义的亚型一致。结论 北京地区RSV A、B亚型或多个基因型可同时流行,但每个流行年的优势基因型可不同。相距5年仍可分离到相同的毒株,表明尽管A亚型毒株之间存在明显的差异性,一些基因型仍然相当稳定。

  • 复发性中耳炎中耳渗液细菌生物膜的观察及方法学研究

    作者:杨名保;武勇进;郑加创;赵海亮;蓝建平;邱书奇

    目的 观察细菌生物膜(bacterial biofilms,BBF)在复发性或顽固性中耳炎患者中耳积液的形成,探讨鲎试验及免疫荧光二重染色结合激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)方法研究细菌生物膜感染的可行性.方法 抽取12例(18耳)复发性或顽固性中耳炎患者中耳积液分别行细菌培养鉴定、鲎试验检测细菌内毒素、免疫荧光双重染色标记后CLSM观察.结果 所有患者细菌培养鉴定阳性率为22.2% (4/18);快速凝胶法鲎试验检测细菌内毒素反应阳性率为72.2% (13/18);中耳积液标本行异硫氰酸荧光素标记的刀豆球蛋白(FITC-ConA)及碘化丙啶(PI)双重染色后,CLSM下见大量绿色荧光,代表该处较多多糖基质,其间有橙红色荧光,代表细菌和宿主细胞.其中稀薄、清亮积液标本的橙红色荧光明显较黏稠积液标本的弱.结论 复发性或顽固性中耳炎患者中耳积液存在细菌生物膜形成,中耳炎反复发作或迁延不愈可能与此有关;本研究建立的鲎试验及免疫荧光二重染色结合CLSM方法是检测细菌内毒素和观察BBF形成有效可行的方法.

  • TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-2γmRNA表达水平

    作者:杨佳荟;沈茜

    目的建立TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-2γ(MIP-2γ)mRNA表达水平,并对方法进行评估.方法 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测MIP-2γ mRNA的表达.结果线性检测范围达6个数量级,低检测下限为6×102拷贝,高检测上限为6×107拷贝,批间及批内变异<122%. 正常Balb/c小鼠心脏、肝脏、肾脏组织均可检测到MIP-2γ mRNA表达,以心脏表达水平高.结论采用TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测MIP-2γ mRNA表达水平准确、特异、灵敏、快速、操作简便,具有临床推广价值.

  • 良恶性胸腔积液鉴别中SP70检测的临床意义

    作者:杨瑞霞;潘世扬;王芳;徐建;黄珮珺;张燕;徐娟;韩月;朱善军;曹艳;王鹏;许雨乔;娄鉴芳;史新惠

    目的 探讨SP70抗原的检测对鉴别癌性胸腔积液和非癌性胸腔积液的诊断价值.方法 采用病例对照研究.收集2011年7月至2012年2月经临床确诊的肺癌患者胸腔积液108例和非癌性胸腔积液122例,采用双抗体夹心ELISA法对胸腔积液中SP70抗原进行检测;同时与电化学发光法检测CEA、CYFRA21-1和NSE的结果进行比较;采用直接免疫荧光法对胸腔积液脱落细胞上的SP70抗原进行检测,并与HE染色法的脱落细胞学检测结果进行比较,各组间阳性率比较采用x2检验或Fisher确切概率法.结果 癌性胸腔积液患者中SP70、CEA、CYFRA21-1、NSE的阳性率分别为72.2%、58.3%、52.8%和30.6%,显著高于非癌性胸腔积液组(9.8%、13.1%、23.0%和19.7%),SP70、CEA、CYFRA21-1、NSE的特异度分别为90.2%、86.9%、77.0%和80.3%;非小细胞肺癌组的总阳性率显著高于小细胞肺癌组的阳性率(74.3%>0.0%),差异有统计学意义(P=0.02<0.05),癌性胸腔积液患者中SP70的阳性符合率高于传统脱落细胞学HE染色的阳性符合率(72.2%>47.2%),差异有统计学意义(x2=14.03,P<0.05).结论 测定胸腔积液中及脱落细胞上的SP70抗原,能提高癌性胸腔积液诊断的敏感度和特异度.

  • 降钙素原荧光免疫层析定量检测方法的建立及性能评估

    作者:方琦;黄锡荣;李凯;唐时幸;王继华

    目的 利用荧光免疫层析技术,建立一种适用于床旁检验(POCT)的人血清降钙素原(PCT)快速定量检测方法.方法 采用免疫荧光双抗体夹心法(1株抗体包被于硝酸纤维素膜,另1株抗体标记荧光胶乳)研制PCT荧光免疫层析定量检测试剂盒.选取2012年1至5月广州市红十字会医院疑似细菌感染患者472例,其中,男性240例,女性232例,采集其血清标本,用本试剂盒检测PCT含量,同时通过线性、精密度、准确度、特异性、稳定性试验和与国外试剂对比分析进行方法学评价与诊断性能分析.结果 PCT定量试剂报告范围为0.1~125.0 μg/L;选取两批试剂对低、中、高3个浓度质控品重复测定20次的变异系数(CV)均小于15%,偏倚可接受(P>0.05);标本中常见干扰物胆红素(2.0g/L)、三酰甘油(30.0 g/L)、胆固醇(15.0 g/L)在所测定的浓度下对PCT定量检测无明显影响.14个月内检测浓度为0.5、1.0、22.0、65.0 μg/L的PCT质控品,各浓度相对偏差可以控制在±20%以内,认为试剂盒有效期>12个月.用本试剂盒与对照产品VIDAS BRAHMS PCT定量试剂盒平行检测472份临床血清标本,两种方法有很好的相关性(YVIDAS=0.180+1.006X万孚,R2=0.988,P<0.01),并且对临床血清标本定量结果的偏差无统计学意义(Z=-1.6,P>0.05);以对照产品的诊断结果为标准,万孚-PCT检测结果在3个cut-off值(0.5、2.0、10.0 μg/L)下的受试者操作特征(ROC)曲线下面积分别为0.997、0.994、0.998,P<0.01;Kappa值分别为0.899、0.905、0.973,认为两种方法的诊断结果具有较好的一致性.结论 本研究建立了PCT荧光免疫层析快速定量检测方法,各项指标均达到临床检测的要求,可用于临床血清PCT浓度的快速检测.

  • 时间分辨免疫荧光定量检测乙型肝炎病毒前S1抗原的研究

    作者:胡志刚;刘洁;陈国千;谢国强;黄飚;徐根宝;陈永伟;童明庆

    目的建立时间分辨免疫荧光定量分析乙型肝炎病毒PreS1抗原的方法.方法以基因重组的带有PreS1抗原的乙型肝炎表面抗原作标准品,应用双抗体夹心免疫荧光分析方法,用抗PreS1单克隆抗体和抗-HBs分别作为固相抗体和铕标记抗体,若样本中含有PreS1抗原,则形成抗体-抗原-铕标记抗体复合物,加增强液解离铕离子,采用时间分辨荧光测量技术,对乙型肝炎病毒PreS1抗原进行检测.结果自制TRFIA试剂检测PreS1抗原,单侧95%参考范围为0~0.26 ng/ml;自制TRFIA试剂与ELISA试剂对乙型肝炎患者血清标本中PreS1抗原的检测,TRFIA方法灵敏度高于ELISA方法,250份乙型肝炎患者血清标本中有3例标本ELISA方法结果为阴性,而用TRFIA方法可检测到PreS1抗原;对于弱阳性标本用ELISA方法检测不到时,TRFIA方法仍可检出.ELISA方法在一阳性标本1:4 096倍稀释时结果为阴性,而TRFIA方法在1:16 384倍稀释时仍为阳性;高、中、低三个浓度,批内和批间精密度测试变异系数(CV,%)均小于10%,平均回收率为103.3%;TRFIA方法检测PreS1抗原与HBsAg及HBeAg无交叉反应;50份我院正常体检者血清标本进行PreS1抗原的检测,结果均正常,特异性100%.结论 TRFIA方法定量检测PreS1抗原,灵敏度高,特异性强,能够准确及时敏感地反映患者体内乙型肝炎病毒的复制情况.

  • Dickkopf-1时间分辨免疫荧光分析方法的建立及其在肺癌诊断中的应用

    作者:盛世乐;王青;覃文新;于彬;黄钢

    目的 建立Dickkopf-1(DKK-1)时间分辨免疫荧光分析(TR-IFMA)方法,并评价其在肺癌诊断和病理分期中的价值.方法 用双抗夹心原理建立DKK-1 TR-IFMA,并对其灵敏度、批内、批间差异和准确性等各项指标进行考核.同时用以测定212例肺癌、72例肺良性疾病患者和120名健康人血清DKK-1含量,以分析血清DKK-1水平与肺癌不同临床病理特性的相关性.结果 DKK-1TR-IFMA的稳定性好,线性宽,其检测灵敏度为0.08μg/L,批内和批间变异系数均<6.5%,与商业ELISA试剂盒相关性好(r=0.972,P=0.01).肺癌组血清DKK-1水平[31.93(79.47~18.03)μg/L]显著高于肺良性疾病组[15.25(18.41~11.49)μg/L]和正常对照组[13.90(16.91~11.02)μg/L],但DKK-1水平与年龄、性别、肺癌病理组织类型无关,与TNM分期(r=0.37,P<0.001)、有无淋巴结转移(r=0.52,P<0.001)和远处转移(r=0.62,P=0.001)显著相关;血清DKK-1诊断肺癌的总敏感度为68.4%,特异度为92.2%,准确性为82.1%,阳性预测值为90.6%,阴性预测值为72.5%;血清DKK-1诊断小细胞性肺癌的敏感度和准确性稍高于非小细胞性肺癌(70.7%vs 69.5%,85.6%vs 80.7%).结论 DKK-1可作为一项肺癌血清学标志,适用于肺癌的辅助诊断和病理分期.TR-IFMA检测血清DKK-1方法准确可靠,且为肺癌的DKK-1定量检测提供了技术平台.

  • Alport综合征的实验室检查

    作者:王芳

    Alport综合征是一种遗传性肾小球疾病,以血尿、肾衰竭、感音神经性耳聋和眼部异常为主要临床表现,因COL4A5基因(X连锁性Alport综合征)或COL4A3和COL4A4基因(常染色体隐性遗传性Alport综合征)突变所致.肾活检组织电镜检查可以观察到该病特征性的病理改变为肾小球基底膜致密层薄厚不均,并有分层、断裂.皮肤和肾活检组织基底膜中Ⅳ型胶原α链免疫荧光学检查可用于诊断X连锁显性遗传性Alport综合征患者、筛查基因携带者以及判断遗传型.检测、分析Alport综合征致病基因基因,不但有助于遗传咨询,而且能够确定基因携带者和进行产前基因诊断,也有助于临床和病理检查结果均不确定病例的诊断.

  • 定量免疫分析技术的应用现状与展望

    作者:王会中;徐蓉

    定量免疫分析技术是临床实验室常用的定量检测方法.依据示踪物以及分离方式的改变,定量免疫分析技术主要形成了放射免疫、荧光免疫、酶免疫、化学发光、胶体金、免疫比浊和均相免疫分析等几个重要分支.不同的免疫分析技术有着各自的特点,适用于不同的临床检测应用.本文分析了常规的几种定量免疫分析技术,并对各种方法的优缺点和应用价值进行了评价,以期能为临床检验技术的应用及发展提供参考.

  • 多色探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用

    作者:蔚鸣;许鑫鑫;闫朋;张宝庆;刘春涛;吴景秋;刘玉琴;王开利;侯艳杰

    目的 评价多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA)在MTB耐药性检测中的临床应用价值.方法 收集235例浓集抗酸杆菌检测阳性和(或)MTB分子检测阳性患者的晨痰,同时用MMCA和分枝杆菌液体培养及比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)进行耐药性检测,采用Kappa检验比较两方法的一致性.两方法有差别的标本用基因测序的方法进行比较.结果 MMCA和比例法药敏试验检测利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)及耐多药结核(MDR-TB)的符合率分别为94.04(221/235)、90.64% (213/235)、80.00% (188/235)、94.89% (223/235)、77.87% (183/235)、89.36%(210/235);RFP、INH、Lfx及MDR-TB两方法比较Kappa值分别为0.88、0.81、0.88、0.77,具有极好的一致性;以上不一致的标本经基因测序技术验证,痰液及培养分离株两种标本类型的MMCA与测序结果总符合率分别为89.80%(132/147)、98.64%(145/147).结论 采用MMCA法直接、快速检测临床患者痰液MTB耐药情况,与金标准比例法药敏试验及参考方法基因测序技术一致性好,且操作简便、快速、准确,在结核病诊断及耐药结核病快速筛查中将发挥重要作用.

  • 乳鼠脑血管平滑肌细胞的分离培养与鉴定

    作者:李世;侯雪芹;陈云波;程淑意;王奇

    目的 建立一种快速、简单、高效的脑血管平滑肌细胞分离和培养方法,对脑血管疾病机制的研究提供实验材料基础.方法 用不合EDTA胰蛋白酶消化组织获取细胞,继而于倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况,对第3代细胞采用a-肌动蛋白荧光免疫染色法,同时MTT检测细胞的生长趋势.结果 运用胰酶消化法获得并培养出大量的脑血管平滑肌细胞,荧光免疫染色法鉴定结果显示阳性表达,纯度98%.结论 此方法简单、操作性强,目标细胞获得率高,为老年性脑血管疾病机制研究提供材料支持.

  • 缬沙坦抑制血管紧张素Ⅱ刺激下心肌细胞缝隙连接蛋白43表达的上调

    作者:杨军;王苏燕;丁赛良;王光辉;邓彪;张勇;褚春;伍卫

    目的 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激心肌细胞肥大后,缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的变化及缬沙坦的干预作用.方法 分离培养大鼠心肌细胞,分为对照组,AngⅡ组(AngⅡ1.0×10 6 mol/L)和缬沙坦组(AngⅡ1.0×10 6 mol/L+缬沙坦1.0×10 6 mol/L).另外将缬沙坦以1.0×10(5)、1.0×10 6和1.0×10 7 mol/L刺激分为A组、B组和C组.先用AngⅡ诱导心肌肥大24 h后,采用免疫荧光法和免疫印迹蛋白法观察心肌细胞Cx43蛋白表达以及缬沙坦的干预作用.结果 与对照组比较,AngⅡ组心肌细胞明显肥大,蛋白质含量明显增加,Cx43蛋白表达明显上调;与Ang Ⅱ组比较,缬沙坦组拮抗AngⅡ刺激下Cx43蛋白的上调,并呈明显浓度依赖性下降.与A组比较,B、C组Cx43蛋白表达下降(P<0.05).结论 AngⅡ刺激心肌细胞24 h后,通过AngⅡ1型受体信号通路.导致Cx43蛋白表达浓度依赖性上调,缬沙坦明显抑制其上调,Cx43上调可能与心肌肥大过程有关.

  • SD 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞组织贴块法培养及鉴定

    作者:申红远;白静;汤喆;刘秀华;王禹

    目的:建立SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells ,VSMC)组织贴块培养法并进行鉴定。方法无菌条件下取大鼠胸主动脉,4~6 h后加入含20%胎牛血清的DM EM培养液,原代培养2周并用免疫荧光染色对培养的VSMC进行鉴定。结果组织贴块法成功培养了大鼠胸主动脉VSMC ,5~7 d细胞迁出,10~14 d细胞融合至80%进行传代。体外培养的VSMC可传至20代,培养的细胞呈典型的“峰谷”样生长,免疫荧光染色鉴定细胞纯度达95%。结论组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMC培养体系稳定,操作简单、方便,纯度较高,免疫荧光是鉴定VSMC的较佳方法。

  • 新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法改良研究

    作者:郭慧;俞丹;周晖;童煜;王峥

    目的:探讨改良的新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法,为新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病研究奠定基础。方法采用本研究自行设计的改良新生大鼠海马神经元细胞的体外培养方法,进行新生大鼠海马神经元细胞的体外培养。判断新生大鼠原代海马神经元细胞体外培养成功的标准为:荧光显微镜下,可见微管相关蛋白(MAP)2在海马神经元细胞体和树突中表达。该改良方法具体为:①以 L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为神经元细胞体外培养的生长基质,分离出生24 h 内新生 SD 大鼠海马结构。将其运用单一胰蛋白酶水浴振荡消化后,吹打成细胞悬液,将海马神经元细胞以适当的密度种植于含10%胎牛血清 DMEM 培养基中,贴壁培养4 h 后,更换为Neurobasal 维持培养基继续培养,以后每3 d 更换1/2培养液。②采用抗 MAP2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)免疫荧光法,对所获得的海马神经元细胞进行鉴定。结果①新生大鼠海马神经元细胞的体外培养结果显示,新生大鼠海马神经元细胞于培养30 min 时,大部分细胞贴壁生长,培养2 h 后,细胞贴壁明显,少数细胞开始长出突起。于培养5 d 后,神经元突起进一步增多,并形成神经细胞网络,培养7 d 后,神经元细胞分化更加成熟,神经元细胞之间的突起联系更加紧密,可见密集的神经细胞网络。海马神经元细胞体外培养至第21天后,神经元细胞开始退化、变性,细胞体皱缩,残留细胞体痕迹,周围光晕消失,折光性减弱,突起融合而粗大杂乱,神经细胞网络粗大老化。②anti-MAP2-FITC免疫荧光法对所获得的海马神经元细胞进行鉴定的结果显示,在所有细胞中,免疫荧光染色 MAP2阳性新生大鼠海马神经元细胞纯度达96.3%。结论通过上述改良方法培养获得的新生大鼠海马神经元细胞生长状态良好,并具有较高的纯度,可为进一步进行新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病的研究提供实验条件。

  • 呼吸道合胞病毒感染导致大鼠肾病病理模型持续感染证据研究

    作者:赖青;王峥

    目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染 SD 大鼠的肾病病理模型中,RSV 持续感染证据。方法选取2个月龄、体重为180~200 g 的清洁级雄性 SD 大鼠62只为研究对象。采用随机数字表法将其随机分为 RSV 组(n=35)与对照组(n=27)。①对 RSV 组 SD 大鼠,采用毒力疱斑形成单位(PFU)为6×106 RSV 液(0.4 mL/d 腹腔注射+0.2 mL/d 鼻腔滴注)×3 d 处理,建立 RSV 感染SD 大鼠肾病病理模型。对照组采用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.4 mL/d 腹腔注射+0.2 mL/d 鼻腔滴注)×3 d 处理,建立对照组 PBS 模型。两组均以造模前1 d 计算为第0天,造模结束时计算为造模成功第1天。通过电子显微镜观察 RSV 感染 SD 大鼠肾病病理模型造模结束后第7与60天的肾小球超微结构改变,判断 SD 大鼠肾病病理模型造模是否成功。②RSV 组 SD 大鼠肾病病理模型造模成功后,将35只 SD 大鼠平均分为7个亚组(RSV 0、7、15、30、60、90及120 d 亚组),每个亚组均为5只SD 大鼠;将对照组27只 PBS 模型 SD 大鼠,按照上述时间点分为7个亚组(PBS 0、7、15、30、60、90及120 d 亚组),每个亚组分别为5、5、5、3、3、3、3只 SD 大鼠。分别测定各个 RSV 亚组与 PBS 亚组 SD大鼠的24 h 尿蛋白定量、血清白蛋白及血清肌酐水平等指标,并进行统计学分析。③于上述指标测定完毕后,分别于上述时间点处死 RSV 亚组与 PBS 亚组 SD 大鼠。同时,切除 SD 大鼠左肾下2/3、左肺下2/3和脾下2/3,以4%多聚甲醛固定24 h 后,石蜡包埋后切片,采用苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察各个亚组 SD 大鼠肾、肺、脾组织是否发生病理学形态结构改变。④以 RSV G 蛋白单克隆抗体为一抗,制作 RSV 组 SD 大鼠肾、肺、脾组织免疫组化检测标本,于光镜下寻找各个 RSV 亚组RSV G 蛋白存在证据。⑤以 RSV G 蛋白单克隆抗体为一抗,采用与绿色荧光试剂结合,同时采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料蓝染细胞核,制作各个 RSV 亚组 SD 大鼠肾组织荧光免疫检测标本,于荧光显微镜下寻找 RSV G 蛋白存在证据及其与细胞核关系。⑥切除剩余 RSV 亚组左肾上1/3,以3%戊二醛固定后,送至四川大学华西医院病理科制作电子显微镜标本,于电子显微镜下观察各个 RSV 亚组 SD 大鼠肾小球超微结构是否发生病理改变,同时寻找 RSV 颗粒。结果①RSV 组SD 大鼠肾病病理模型造模成功,对照组 PBS 模型亦造模成功。②各个 RSV 亚组与 PBS 亚组 SD 大鼠的24 h 尿蛋白定量水平检测结果显示,RSV 0与90 d 亚组分别与相同时间点 PBS 亚组比较,差异均无统计学意义(P >0.05);而 RSV 7、15、30、60及120 d 亚组,却分别较相同时间点 PBS 亚组均显著升高,并且差异均有统计学意义(t=6.9、3.1、3.9、2.2、5.6,P <0.05)。血清白蛋白及血清肌酐水平检测结果显示,7个 RSV 亚组分别与相同时间点的7个 PBS 亚组比较,差异均无统计学意义(P >0.05)。③于光镜下观察各个 RSV 亚组 SD 大鼠的肾、肺、脾组织形态结构(HE 染色)结果显示,除RSV 0 d 亚组外,其余各个亚组肾、肺、脾组织形态结构均出现不同程度病理改变。④于光镜下观察各个 RSV 亚组 SD 大鼠的肾、肺、脾组织免疫组化技术检测结果显示,除 RSV 0 d 亚组外,其余各个RSV 亚组肾、肺、脾组织中,均有特异性 RSV G 蛋白呈持续阳性表达。各个 RSV 亚组肾小球 RSV G蛋白定量分析结果显示,RSV 0、7、15及30 d 亚组 RSV G 蛋白表达水平呈逐渐增强趋势,并维持在高水平,但在 RSV 60、90及120 d 亚组又呈逐渐减弱趋势。⑤于荧光显微镜下观察各个 RSV 亚组SD 大鼠肾组织 RSV G 蛋白荧光免疫检测结果显示,RSV G 蛋白与 DAPI 蓝染的细胞核重叠。⑥透射电子显微镜下观察发现,RSV 组肾组织中 RSV 颗粒持续存在,RSV 120 d 亚组肾小球超微结构仍存在病理改变。结论 RSVG蛋白在 RSV 感染 SD大鼠肾病病理模型造模成功后,大鼠肾、肺、脾组织中 RSV G 蛋白呈持续阳性表达,证明 RSV 呈持续感染状态。这一结果或提示,包括 RSV 在内的呼吸道病毒持续感染,是导致微小病变型肾病综合征(MCNS)患儿免疫功能紊乱的主要原因。

  • 儿童肺炎衣原体肺炎病原学检测及其临床应用

    作者:鲁继荣;张一宁;王;刘桂英;傅文永;王敏

    目的了解儿童肺炎衣原体(C.pn)肺炎的发病情况,探讨套式聚合酶链反应(nPCR)及微量免疫荧光(MIF)检测肺炎衣原体肺炎的临床意义.方法联合应用nPCR及MIF检测300例肺炎患儿及130例健康儿童,结果进行统计学分析,并随机选取2例nPCR阳性标本,进行DNA测序.结果检测300例肺炎中,nPCR阳性且MIF符合急性感染标准者30例,即确诊为肺炎衣原体肺炎,占肺炎总数的10.0%.nPCR阳性者42例占14.0%,MIF符合急性感染标准者31例,占10.3%,在年龄分布上,120例≤3岁者有16例nPCR阳性,阳性率13.3%,8例MIF符合急性感染标准,阳性率6.7%;180例>3岁患儿中26例nPCR阳性,阳性率14.4%,23例MIF符合急性感染标准,阳性率12.8%.130例健康对照组儿童中,nPCR均呈阴性,虽有24例MIF IgG≥1∶16(IgG滴度分别为1∶16~1∶128),但无一例符合急性感染标准.2例nPCR阳性标本nPCR产物之DNA序列与C.pn标准株(CWL-29)完全一致.结论肺炎衣原体是儿童肺炎重要的病原,nPCR诊断肺炎衣原体感染快速、简便、敏感、特异性高,联合应用nPCR及MIF可以提高诊断的敏感性和特异性.

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