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鲍曼不动杆菌临床分离株分子生物学鉴定分析
目的 了解目前鲍曼不动杆菌临床鉴定分析的准确性及可能存在的问题.方法 本研究随机抽取100株临床鉴定为鲍曼不动杆菌的临床分离鉴定株开展了扩增核糖体DNA限制酶切分析,16S rRNA编码基闪及16S～23S rRNA间区测序鉴定分析.结果 鉴定出5个不动杆菌种,分别为鲍曼不动杆菌(77%),菌种3(9%),菌种10(6%),菌种13TU(3%),琼氏不动杆菌(2%),还有3%为非不动杆菌.结论 目前临床实验室对鲍曼不动杆菌的鉴定准确性较低,可能影响对不动杆菌不同种的流行病学特征和临床状况的认知,临床不动杆菌的鉴定能力有待加强.
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一株从酸奶中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种的鉴定和系统发育分析
目的 对一株分离自酸奶经表型特征鉴定为德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株(Wch9901)进行16SrDNA鉴定和系统发育分析.方法 提取wch9901基因组DNA作为模板,以16S rDNA两端的保守序列作为PCR引物,扩增菌株的16S rDNA序列.在T4连接酶的作用下,将扩增得到的16S rDNA序列插入克隆载体pGEM-T,构建重组质粒pGEM-wch9901 16S rDNA.重组质粒酶切鉴定合格后,交由测序公司对插入的16SrDNA序列进行测序.测序结果于GenBank中Blastn,并用软件Mega3.1构建系统发育树.结果 wch9901 16SrDNA序列与Lactobacillus delbrueckii subsp.btlgaricus中所有菌株的16S rDNA序列同源性均达96%以上;在系统发育树上wch9901单独形成一个分枝,位于Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus LGM2遗传分枝和Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus DL2所在的独立小遗传簇及Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus JSQ所在的独立小遗传簇构成的分枝之间,并与Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus LGM2遗传分枝距离近.结论 wch9901属于Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus;wch9901与Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus LGM2具有近的亲缘关系.
关键词： 德氏乳杆菌保加利亚亚种 16S rDNA 系统发育树 -
阴沟肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因及氨基糖苷类修饰酶基因研究
目的 了解临床分离的40株阴沟肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因及氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因存在状况.方法 在2003年9月至2004年11月从解放军第98医院住院患者中分离40株阴沟肠杆菌,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析5种16S rRNA甲基化酶基因(armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD)和9种AMEs基因[aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(3)-Ⅲ、aac(3)-Ⅳ、aac(6')-Ⅰ b、aac(6')-Ⅱ、ant(3'')-Ⅰ、ant(2'')-Ⅰ和aph(3')-Ⅵ].结果 40株阴沟肠杆菌中,6种基因rmtB、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ b、ant(3'')-Ⅰ、ant(2'')-Ⅰ和aph(3')-Ⅵ的阳性株数分别为5株(12.5%)、11株(27.5%)、29株(72.5%)、13株(32.5%)、2株(5.0%)和2株(5.0%);其余8种基因均阴性;AMEs基因总阳性率为85.0%(34/40).对29株aac(6')-Ⅰ b基因PCR阳性产物进行测序,证实有7株(24.1%)单独携带aac(6')-Ⅰ b-cr双功能酶基因(GenBank:EF375620、EU159121),18株(62.1%)单独携带aac(6')-Ⅰ b-Snzhou(苏州型,EU085533),3株(10.3%)同时携带aac(6')-Ⅰ b-Suzhou及aac(6')-Ⅰ b-cr 2种亚型,仅1株(3.4%)为aac(6')-Ⅰ b经典型.结论 临床分离的40株阴沟肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因阳性率较低而AMEs基因阳性率很高,至少存在5种AMEs基因.
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环境军团菌的分离培养及鉴定方法探讨
目的 建立地表环境水军团菌的分离培养及种属鉴定方法.方法 在广州市内8个公园中采取了44份地表湖泊水样,进行军团菌的分离培养.同一湖泊来源的分离株以扩增片段长度多态性(amplifled fragment length polymorphism,AFLP)进行同源性分析;进一步的种属鉴定采用生化血清学鉴定、细胞脂肪酸成分分析、16 S rRNA基因测序、巨噬细胞感染增强蛋白(mip)基因测序等多种手段相结合的方法进行分析和比较.结果 8个公园内的27份水样分离出军团菌,阳性率为61.36%.初步分离的108个菌株,经AFLP同源性鉴定,得到不同菌株31株,包括嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)20株,橡树岭军团菌(Legionella oakridgensis)1株,圣海伦军团菌(Legionella sainthelensi)1株,长滩军团菌(Legionella longbeachae)4株,菲氏军团菌(Legionella feeleii)5株.其中,嗜肺军团菌可直接通过常规的生化实验、血清学鉴定得到种属鉴定结果.但包括细胞脂肪酸成分分析在内的表型鉴定方法,均存在不同程度的不稳定性因素.结论 生化实验、血清学鉴定、细胞脂肪酸成分分析等能够为军团菌的分类学鉴定提供有价值的资料,但终的种属鉴定仍必需依赖于16 SrRNA基因或mip基因的序列分析.
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特异性PCR方法鉴别蛇胆汁及其伪品
建立一种简便准确的蛇胆汁药材DNA分子鉴别方法.测试并优化胆汁药材基因组DNA提取方法,并针对蛇类的COⅠ,Cyt b,16S基因序列设计4对蛇类鉴别引物,根据特异性和扩增效率筛选佳引物.使用其中1对引物Cytb1,20种蛇胆汁DNA均能扩增得到约400 bp的条带,同样条件下7种其他动物胆汁DNA均无扩增条带.该方法特异性强,准确度高,重复性好,为加强控制蛇胆汁药材质量提供了有效方法.
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我国北方蜱中人粒细胞埃立克体16S rRNA基因的检测
本文应用人粒细胞埃立克体病(HGE)的病原体的16S rRNA基因序列的特异引物对采自我国北方地区的一些蜱标本进行扩增,首次从内蒙古大兴安岭采集的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱,以及从新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱中扩增出该病原体的16S rRNA基因片段.所测出的967 bp序列与美国HGE株(GenBank U02521)的同源性为100%.
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2型糖尿病患者维医分型及其口腔菌群多样性研究
目的 了解维吾尔医学热性糖尿病和寒性糖尿病人口腔菌群结构的多样性及其与健康个体的差别. 方法 对26例2型糖尿病患者进行维吾尔医学分型,其中15例为热性糖尿病患者,11例为寒性糖尿病患者.采集26例糖尿病患者和14例健康对照者的口腔细菌样品,提取细菌总DNA,PCR扩增16S rDNA V3可变区,产物经DGGE后借助Quantity One-4.6.8软件计数指纹图谱中每个样本的条带数,进行多样性分析. 结果 3组个体的DGGE指纹图谱DNA条带数分别为21.0±3.7、21.7±3.3和20.4±2.7,差异无统计学意义(P=0.36). 结论 热性糖尿病组和寒性糖尿病组患者口腔菌群与健康对照组具有同样程度的多样性.
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从耐药肺炎克雷伯菌中检出aac(6′)-Ib基因新亚型
为深入了解一组分离自浙江省杭州地区和湖州地区耐药肺炎克雷伯菌之氨基糖苷类药物耐药的遗传学背景,我们同时检测了47株耐药肺炎克雷伯菌的15种氨基糖苷类修饰酶和6种16S rRNA甲基化酶基因.现报道如下.
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MALDI Biotyper和VITEK MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对链球菌鉴定的比较研究
目的 以16S rRNA基因测序鉴定结果为金标准,研究比较两种基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定系统(MALDI Biotyper和VITEK MS)在临床分离链球菌鉴定中的表现.方法 2014年4至6月收集浙江大学医学院附属第二医院临床分离的链球菌162株,经16S rRNA基因测序确认菌种,分别使用MALDI Biotyper和VITEK MS质谱鉴定系统进行鉴定,并评价其鉴定能力.结果 MALDI Biotyper鉴定系统将155株(155/162,95.68％)链球菌准确鉴定到种,将3株缓症链球菌群鉴定为肺炎链球菌,1株副血液链球菌鉴定为澳大利亚链球菌,另有3株肺炎链球菌不能准确鉴定(分值＜1.7);VITEK MS鉴定系统将156株(156/162,96.30％)链球菌准确鉴定至种(包括亚种),其将2株肺炎链球菌鉴定为缓症链球菌/口腔链球菌,1株马肠链球菌鉴定为婴儿链球菌婴儿亚种.两系统对化脓性链球菌和无乳链球菌的鉴定准确率均为100％ (51/51),对肺炎链球菌的准确率均＞85％.结论 两系统对临床分离的链球菌均有较强的鉴定能力,VITEK MS系统对某些亚种的准确鉴定更有临床意义.质谱可作为临床链球菌快速鉴定的手段.
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基于细菌16S rRNA基因的PCR扩增与测序分析在临床不常见菌鉴定中的应用
目的 探讨细菌16S rRNA基因的广谱PCR扩增与测序分析在临床分离的少见病原菌的鉴定及分类中的价值.方法 收集2010年12月至2011年9月来自7家不同医院和机构,常规方法难以鉴定或具有特殊表型的少见菌48株,以及仪器法连续监测报警阳性、但二次传代无细菌生长的液体增菌培养瓶7个,采用细菌16S核糖体核糖核酸(rRNA)基因MicroSeq 500试剂盒、通用引物27f-1492r、27f-1525r进行广谱PCR扩增及目的片段的基因测序.运用美国国立生物信息中心“基于局部比对算法的搜索工具( Blast)”,结合“具有法定分类学地位的原核生物名称目录(http://www.bacterio.cict.fr/)”提供的分类学信息,比较待鉴定细菌与近缘种模式菌株基因序列的相似程度；参考美国临床与实验室标准化协会(CLSI) MM18-A的解释标准,以确定待鉴定细菌的种属及分类学位置.结果 采用广谱PCR测定,7份假阳性血培养瓶中,2份扩增到细菌的16S rRNA基因,经序列分析鉴定均为肺炎链球菌.48株不同来源、不同种属的少见菌,均扩增到16S rRNA基因目的片段并成功测序,参考CLSI MM18-A的解释标准,35株(72.9％)直接鉴定到“种”,11株(22.9％)鉴定到“属”,另2株鉴定为可能的新属新种.进一步结合细菌的生化反应特征及其他管家基因序列分析结果,则可鉴定到“种”的细菌可增加到42株(87.5％),其中包括链杆菌、嗜二氧化碳噬纤维菌、玫瑰单胞菌、奴卡菌、弯曲菌、分枝杆菌等具有明确临床意义的少见菌,以及多株近十年内命名的新细菌,如小不动杆菌、富西哑分枝杆菌、黏液玫瑰单胞菌、Halomonas johnsoniae等.此外,还发现了1个新亚型的胎儿弯曲菌.结论 16S rRNA基因测序鉴定能明确提供细菌的遗传学信息,且无种属选择性,对临床少见菌、苛养菌、以及固体培养基不生长的纯培养物等具有独特的优势,是病原微生物鉴定的发展方向.
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从尿液中分离出aac(6')-Ib基因新亚型的大肠埃希菌
迄今为止,已发现的细菌对氨基糖苷类抗菌药物产生的耐药机制主要有5种,其中由获得性耐药基因介导的耐药机制有2种,即产生氨基糖苷类修饰酶(AMEs)和产16S rRNA甲基化酶.
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卫生部微生物室间质评1012菌的鉴定与放线菌属的系统发生分析
目的 对卫生部临床检验中心2010年微生物室间质评1012菌进行鉴定，研究1012菌的分类学位置及放线菌属的系统分类现状。方法采用传统的细菌学形态检查、商品化的API、以及16S rRNA基因测序等多种手段对1012菌进行系统的鉴定。结合远程计算机系统提供的原核生物信息，构建放线菌属及相关细菌的16S rRNA基因的系统发生树，研究放线菌属的系统进化及1012菌与相关菌种之间的亲缘关系。结果1012菌为兼性厌氧、不形成芽胞的革兰氏阳性棒状菌，60多项生化实验，除L-阿拉伯糖发酵实验阴性，其余与图列茨放线菌一致。16S rRNA基因序列分析结果显示：1012菌与图列茨放线菌的同源性高达99.8％，但与放线菌属的模式菌种——牛放线菌的同源性仅为90.6％。进一步的系统发生树亦表明，放线菌科的五个菌属清晰地聚类成9个“基因属”，小弯杆菌、动弯杆菌、放线杆菌、隐秘杆菌4个菌属分别包含单一的基因群，而放线菌属则包含了5个独立的基因群。结论1012菌可鉴定为图列放线菌，但从基因的角度上分析，当前的放线菌属的组成结构过于松散，可能会重新分类。
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不同分子生物学方法快速鉴别非结核分枝杆菌的应用评价
目的 评价3种分子生物学方法快速鉴定非结核分枝杆菌的优缺点.方法 收集41株临床分离的非结核分枝杆菌,以16S rRNA基因测序方法为标准,同时以hsp65基因测序方法及PCR-RFLP方法鉴定菌株,与16S rRNA基因测序结果进行比较.结果 41株非结核分枝杆菌16SrRNA基因测序结果:9株龟分枝杆菌复合群,7株偶发分枝杆菌,7株胞内分枝杆菌,3株鸟分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群,3株耻垢分枝杆菌,3株土分枝杆菌,2株草分枝杆菌,2株无色分枝杆菌,1株瘰疬分枝杆菌,1株M.arupense.与16S rRNA基因测序相比较,hs65 PCR-RFLP能鉴定9株龟分枝杆菌复合群至亚种脓肿分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群鉴定至亚种堪萨斯分枝杆菌;1株偶发分枝杆菌及1株无色分枝杆菌与其不符;其余菌株鉴定结果一致,符合率为95.1%(39/41).hsp65基因测序结果显示,1株爱尔兰分枝杆菌与16S rRNA测序结果不符,其余菌株鉴定结果与其一致,符合率为97.6%(40/41),并且能进一步将9株龟分枝杆菌复合群鉴定至亚种脓肿分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群鉴定至亚种堪萨斯分枝杆菌.结论 3种方法均能快速鉴定非结核分枝杆菌.与16S rRNA基因测序相比,hsp65基因测序及hsp65 PCR-RFLP更容易鉴定临床常见非结核分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌),可在临床推广使用.
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应用基因芯片快速检测临床常见细菌
目的 应用基因芯片对临床常见的8种致病细菌进行检测.方法 选取8种临床常见的致病细菌,包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、宋内志贺菌.以16S rRNA基因为目的基因,白行设计通用引物系列扩增目的片段,针对高变区域设计探针,建立基因芯片检测体系,并对所选细菌进行检测.收集来自武汉大学中南医院的待检标本50份,包括血液6份、痰液32份、粪便9份、纤维支气管镜检测物3份,提取DNA后利用建立的基因芯片进行检测.结果 自行设计的通用引物能很好地扩增目的片段,针对8种细菌进行多批次重复检测,结果显示所选用的探针具有很好的检测效果.对临床50份标本进行检测,其中47份得到准确的检测结果,3份未得到结果的原因为芯片未包含菌种.通过优化检测过程,可在8h内报告检测结果.探针信号随时间的衰减程度观察表明,60d后探针信号虽有衰减,但其衰减程度对检测结果判断无影响.结论 本研究设计的基因芯片检测体系能准确而快速地对临床常见细菌做出检测,为基因芯片技术应用于临床奠定基础.
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质粒介导16S rRNA甲基化酶肺炎克雷伯菌临床分离株的检测及分子流行病学研究
目的 调查165 rRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行情况.方法 收集我院2006年1月至2007年9月从临床标本中分离的肺炎克雷伯菌337株,所有菌株均为非重复株.菌种鉴定采用全自动微生物分析仪,庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素的药敏试验采用琼脂稀释法.超广谱B内酰胺酶(ESBLs)检测采用美国临床和实验窒标准协会(CLSI)规定的纸片确证法.使用PCR检测16S rRNA甲基化酶基因、整合酶基因和ESBL基因.接合试验检测质粒的可转移性;脉冲场电泳分析菌株的同源性.结果 337株肺炎克雷伯菌对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率分别为19.0%(64/337)、8.3%(28/337)和16.3%(55/337).21株16S rRNA甲基化酶基因阳性,阳性率为6.2%(21/337),其中13株rmtB阳性、3株armA阳性、5株rmtB和atmA同时阳性.所有16S rRNA甲基化酶基因阳性株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星同时耐药且都为高度耐药(MICs≥256μL),21株甲基化酶基因阳性株有19株产ESBLs,ESBL基因主要为CTX-M-14-like、CTX-M-15-like和SHV-12-like.21株均为Ⅰ类整合酶基因阳性.13株通过接合试验把质粒传递给受体菌E. coliJ53.所有接合子Ⅰ类整合酶基因阳性、blaTEM-1基因阳性、产ESBLs及对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和复方磺胺甲噁唑耐药,对其他抗菌药物敏感.接合子ESBL基因型与供菌一致.21株16S rRNA甲基化酶基因阳性株经脉冲场凝胶电泳(PFGE)分成14个基因型,主要为A型和Ⅰ型.结论 armA和rmtB型16S rRNA甲基化酶基因已经在肺炎克雷伯菌中播散,既可通过克隆株播散也可通过接合性质粒在不同菌株间播散.
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细菌16 S核糖体RNA基因检测杰氏棒状杆菌一株
目的：探讨通过16S核糖体RNA（16S rRNA ）基因测序的方法用于临床菌株鉴定。方法以细菌16S rRNA基因为靶序列，采用细菌的通用引物P1、P2进行PCR扩增，同时送到测序公司测序从而达到鉴定。结果待测菌株及ATCC25923阳性对照通过PCR得到的扩增片段为1465bp左右，待测菌株经测序比对鉴定为一株杰氏棒状杆菌，阳性质控ATCC25923鉴定为一株金黄的葡萄球菌，阴性对照未出现任何结果。结论通过PCR检测细菌16srRNA基因可以应用于临床菌株的鉴定，并且适用一些难以鉴定的细菌。
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产ESBLs肠杆菌科细菌中16S rRNA甲基化酶基因的研究
目的 研究产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肠杆菌科细菌中16S rRNA甲基化酶基因的分布及传播机制.方法 采用PCR扩增、序列分析确定16S rRNA甲基化酶基因和ESBLs基因,Etest 法检测17种抗菌药物的小抑菌浓度(MIC),并通过接合试验、质粒抽提等方法对耐药基因的传播机制进行研究.结果 447株产ESBLs菌株中筛选到1株产armA型16S rRNA甲基化酶的产酸克雷伯菌(ZJ157),并在该菌株中同时检出CTX-M-15型ESBLs和TEM-1型β-内酰胺酶基因;该菌株对氨基糖苷类、环丙沙星及大部分β-内酰胺类抗菌药物耐药,但对碳青霉烯类、多黏菌素E和替加环素敏感;对阿米卡星及β-内酰胺类抗菌药物的耐药性可以通过接合试验传递给受体菌,且PCR扩增证实接合子的armA、CTX-M-15及TEM-1基因均为阳性.质粒抽提发现原始菌和接合子均有1个约55 kb的质粒.结论 在产酸克雷伯菌中检出armA型16S rRNA甲基化酶基因.介导氨基糖苷类抗菌药物高水平耐药的armA基因可以与CTX-M-15及TEM-1基因同时经质粒传递,协同介导菌株的多药耐药.
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多药耐药鲍氏不动杆菌氨基糖苷类耐药相关基因研究
目的 调查多药耐药鲍氏不动杆菌氨基糖苷类修饰酶基因(AMEs)、16S rRNA甲基化酶基因和抗菌药物外排泵基因adeB的存在情况.方法收集2008年1-12月医院住院患者痰标本中分离的多药耐药鲍氏不动杆菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析9种AMEs基因、2种16S rRNA甲基化酶基因和抗菌药物外排泵基因adeB.结果 20株鲍氏不动杆菌共检出4种AMEs基因:aac(3)-Ⅰ 11株为55.0%、aac(6′)-Ⅰb 12株为60.0%、ant(3″)-Ⅰ15株为75.0%、aph(3′)-Ⅰ15株为75.0%,抗菌药物外排泵基因adeB 17株为85.0%,其余7种基因未检出.结论 20株多药耐药鲍氏不动杆菌菌株检出的4种氨基糖苷类修饰酶基因阳性率较高,2种16S rRNA甲基化酶基因未检出,抗菌药物外排泵基因adeB阳性率高;在氨基糖苷类耐药株中抗菌药物外排泵基因adeB检出率高.
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大肠埃希菌ICU分离株发现aadA4/5、aph(3')-Ⅰ型氨基糖苷类修饰酶基因
目的 了解分离于ICU的大肠埃希菌(ECO)氨基糖苷类药物各种耐药相关基因存在状况,探讨ECO多药耐药机制.方法 收集2007年12月-2008年6月20株分离自医院ICU患者临床标本的ECO,采用纸片扩散法测定30种抗菌药物的敏感性;采用PCR法检测armA、rmtB、npmA、aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ b、aac(6')-Ⅱ、ant(3")-Ⅰ、ant(2")-Ⅰ、ant(4')-Ⅰ a/b、aadA4/5,aadA6/16、aph(3')-Ⅰ、aph(3')-Ⅱb、aph(3')-Ⅵa、3种16S rRNA甲基化酶与12种氨基糖苷类修饰酶基因.结果 20株ECO中检出aac(3)-Ⅱ8株(40%)、aac(6')-Ⅰ b 3株(15%)、ant(3")-Ⅰ 3株(15%)、aph(3')-Ⅰ 1株(10%)、aadA4/5 13株(65%)5种氨基糖苷类修饰酶基因,未检出16S rRNA甲基化酶基因;在ECO中发现aadA4/5和aph(3')-Ⅰ型氨基糖苷类修饰酶基因均为国内首次.结论 ECO对氨基糖苷类药物耐药情况严重、机制复杂,产氨基糖苷类修饰酶为主要原因之一.
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实时荧光定量PCR检测细菌方法的建立及其临床应用
目的探索快速可靠的新生儿败血症和化脓性脑膜炎诊断的新方法及其临床运用.方法用自行设计的细菌16S rRNA基因高度保守区的引物和探针,对19种标准菌株、3种病毒株、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA,以及疑似败血症的临床血标本、脑脊液共195份进行荧光定量检测,并同时进行血或脑脊液培养的对照.结果细菌荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因,即相当于1～2个细菌,与人基因组DNA、真菌及病毒等无交叉阳性反应;荧光定量PCR的细菌DNA检出率为12.8%(25/195),明显高于血培养的阳性率7.1%(15/195,P＜0.01).结论应用通用引物和探针的荧光定量PCR扩增诊断败血症的方法检测快速、敏感性和特异性高,具有较大的推广及应用价值.
