18SrRNA在系统进化研究中的应用

本文简要介绍了18srRNA的结构特点、功能及在系统进化研究中的应用,并就目前应用18srRNA所做的一些工作做了简要总结.

克洛诺菌属分离株16S rDNA序列分析

目的 对2株克洛诺茵属(原阪崎肠杆茵)模式株和29株食品分离株的16S rDNA进行序列分析.方法 对茵株的16S rDNA进行PCR扩增、测序,获得目的 茵的16S rDNA序列并通过BioNumenics软件对其进行多重对比分析和系统发育学分析.结果 除ATCC51329和ES 014外,其他克洛诺茵属与ATCC29544的16S rDNA序列均属于同一基因群,而ATCC51329和ES 014分别属于另外一个分支.从16S rDNA序列分析可知,除ES014不能确定外,其它克洛诺菌属分离株均可从基因水平上得到准确鉴定.结论 从基因水平上对国内克洛诺茵属食品分离株进行鉴定,并研究了相关茵株之间的系统发育学关系.

39株对克拉霉素耐药的结核分枝杆菌临床分离株23S rRNA检测结果分析

目的 分析对克拉霉素耐药的结核分枝杆菌临床分离株23S rRNA的A2058位点的变化.方法 选择我院菌株库的结核分枝杆菌临床分离株64株,其中10株为对全部抗结核药物敏感的结核分枝杆菌临床分离株；14株为单耐克拉霉素的结核分枝杆菌临床分离株；15株为耐多药,同时耐克拉霉素的结核分枝杆菌临床分离株；15株为耐多药,同时对克拉霉素敏感的结核分枝杆菌临床分离株；10株为广泛耐药菌株,同时对克拉霉素耐药的结核分枝杆菌临床分离株；此外,还有结核分枝杆菌标准株H37Rv 1株.对结核分枝杆菌23S rRNA行PCR检测和测序.结果 经检测,H37Rv标准株没有A2058突变,只有1株广泛耐药临床分离株检测有A2058A-G的突变,其他临床分离株均没有突变,在耐克拉霉素的结核分枝杆菌临床分离株中占2.56％(1/39),在广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株中占1/10.结论 结核分枝杆菌临床分离株对克拉霉素耐药的机制中,A2058突变可能不是产生对克拉霉素耐药的主要机制.结核分枝杆菌产生对克拉霉素耐药的机制有待进一步研究.

广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究

[目的]建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)分子鉴定方法及其系统进化关系.[方法]针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性,设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物,对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定,并与CenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析.[结果]不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同,M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp～520bp、432bp～438bp、527bp～586bp、439bp～448bp和644bp.序列分析和系统进化关系显示,尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属,再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科,库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类,分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致.[结论]建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系.这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点,对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据.

浙江省369份淡、海水鱼香港海鸥型菌污染状况研究

目的 掌握浙江省淡、海水鱼中香港海鸥型茵污染状况,为防止食源性香港海鸥型茵病的发生和流行提供科学依据.方法 用改良头孢哌酮麦康凯琼脂分离,API 20NE鉴定香港海鸥型菌.K-B纸片扩散法作耐药性测定.1通用引物扩增16S rDNA并与香港海鸥型茵HKU1株开展同源性比较.结果 369份样品检出香港海鸥型茵18株,阳性率为4.88%,其中,鲤鱼检出率为25.00%,草鱼的阳性率为10.26%,海水鱼以及鲫鱼、鲢鱼、扁鱼等淡水鱼中未分离出.分离的香港海鸥型菌16S rDNA序列与HKUI株仅相差1.2个碱基,同源性在99.6%.100.0%之间:18株茵对头孢拉定、万古霉素、甲硝唑、克林霉素、头孢哌酮完全耐药,对红霉素、亚胺培南、克拉霉素、氨曲南、庆大霉素、丁胺卡那霉素、三甲氧苄氨嘧啶、四环素、氯霉素、多粘菌素B、环丙沙星完全敏感,对头孢噻吩、胺苄西林、头孢曲松的耐药性分别为83.33%、61.11%和5.56%.结论 浙江省存在香港海鸥型茵污染源,建议相关监督部门应加大这类产品的管理力度,防止香港海鸥型茼病在我省的发生和传播.

纳米生物工程:纳米技术的重要领域

纳米生物工程包括纳米医学、纳米生物技术和纳米生物材料等.1纳米医学由于人体是由分子构成的,所有的疾病包括衰老本身也可归因于人体内分子的变化.当人体的分子机器,如合成蛋白质的核糖体,DNA复制所需的酶等,出现故障或工作失常时,就会导致细胞死亡或异常.

广西1994～2001年伤寒流行病学及病原学遗传多态性研究

本研究对1994～2001年近8年来广西壮族自治区(广西)伤寒流行进行分析,对这期间的分离株进行16S核糖体(rRNA)基因多态性、噬菌体裂解分型试验,现将结果报道如下.

辽宁省1997-2002年霍乱弧菌分离株核糖体分型和脉冲场凝胶电泳分型分析

为探讨辽宁省不同地区、不同来源霍乱病原体之间的遗传相关性,并对从鸭绿江水中分离出来的霍乱弧菌进行基因水平的分析,我们采用16S RNA核糖体基因分型(RT)及脉冲场凝胶电泳(PFGE)等分子生物学方法,对23株分离自1997-2002年辽宁省患者、外环境霍乱菌株进行研究.所用菌株经鉴定均为El tor生物型.染色体DNA提取、Southern杂交、PFGE参照文献[1]进行.20株霍乱弧菌共分3个RT型,其中18株菌为RT1型,RT2型、RT3型各1株菌(表1).14株霍乱弧菌共出现3种电泳条带(PFGE分型),结果见图1和表1.

环境军团菌的分离培养及鉴定方法探讨

目的 建立地表环境水军团菌的分离培养及种属鉴定方法.方法 在广州市内8个公园中采取了44份地表湖泊水样,进行军团菌的分离培养.同一湖泊来源的分离株以扩增片段长度多态性(amplifled fragment length polymorphism,AFLP)进行同源性分析;进一步的种属鉴定采用生化血清学鉴定、细胞脂肪酸成分分析、16 S rRNA基因测序、巨噬细胞感染增强蛋白(mip)基因测序等多种手段相结合的方法进行分析和比较.结果 8个公园内的27份水样分离出军团菌,阳性率为61.36%.初步分离的108个菌株,经AFLP同源性鉴定,得到不同菌株31株,包括嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)20株,橡树岭军团菌(Legionella oakridgensis)1株,圣海伦军团菌(Legionella sainthelensi)1株,长滩军团菌(Legionella longbeachae)4株,菲氏军团菌(Legionella feeleii)5株.其中,嗜肺军团菌可直接通过常规的生化实验、血清学鉴定得到种属鉴定结果.但包括细胞脂肪酸成分分析在内的表型鉴定方法,均存在不同程度的不稳定性因素.结论 生化实验、血清学鉴定、细胞脂肪酸成分分析等能够为军团菌的分类学鉴定提供有价值的资料,但终的种属鉴定仍必需依赖于16 SrRNA基因或mip基因的序列分析.

参三七中核糖体RNA基因和matK基因的异质性

双顺反子载体pWISG的构建和共表达

肿瘤放、化疗对骨髓的抑制作用限制了其使用剂量,如何保护骨髓中的造血干细胞免受放化疗引起的杀伤和凋亡是研究热点之一.已知WEE1Hu可使细胞生长停滞于G2期检测点,以确保细胞在进入有丝分裂前完成DNA的复制和损伤修复[1],并且WEE1Hu可以抑制HIV、γ射线等诱导的细胞凋亡.人干细胞因子(hSCF)是一种重要的造血细胞生长因子,主要调控造血祖细胞的增殖、分化[2],并有一定的抗损伤作用.本实验采用核糖体插入位点(IRES)构建WEE1Hu、SCF/GFP双顺反子重组表达质粒pWISG,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来研究两者的共表达,为进一步功能研究奠定基础.

核糖体相关基因在大鼠再生肝及肝肿瘤中表达异同的比较

目的 在基因转录水平了解核糖体相关基因在大鼠再生肝(RL)和肝脏肿瘤(LT)中的表达异同.方法 用搜索网站资料和查阅相关论文等方法获得核糖体发生、组装和功能相关基因及它们在肝脏肿瘤中的表达变化,用大鼠基因组230 2.0芯片检测它们在大鼠再生肝中的表达情况,用统计学方法比较上述基因在再生肝和肝脏肿瘤中的表达异同.结果 初步证实上述基因中75个基因与肝再生相关.其中,18个基因在再生肝和肝脏肿瘤中表达上调,6个基因在两者中表达下调,51个基因在肝脏肿瘤中未发生有意义的表达变化.结论 再生肝的核糖体相关基因表达谱与肝脏肿瘤有相同之处,也有不同之处,前者的基因表达更具阶段性和复杂性.

英美以三国科学家分享2009年诺贝尔化学奖

瑞典皇家科学院2009年10月7日宣布,英国科学家Venkatraman Ramakrishnan、美国科学家Thomas A. Steitz和以色列女科学家Ada E. Yonath 三人共同分享2009年诺贝尔化学奖,以表彰他们在"核糖体的结构和功能研究"方面的突出成就.

体外抑菌试验评价核糖体表达筛选的抗菌肽活性

目的 观察体外无细胞核糖体表达系统筛选得到的、能与细菌膜结合的多肽的体外抑菌活性变化,初步评价该筛选系统的可行性.方法 采用核糖体展示系统和细胞膜模型筛选可结合于细胞膜的多肽,对筛选的多肽进行结构预测分析.选择形成α-螺旋结构可能性大、溶解性尚可的多肽(C13)进行合成.利用改良的微量肉汤稀释法测定C13和硫酸庆大霉素对G+(金黄色葡萄球菌)和G-(大肠杆菌、伤寒杆菌)细菌的抗菌活性--小抑菌浓度(MIC)和小杀菌浓度(MBC).结果 C13对试验细菌的MIC均为400 mg/L,但在现有浓度范围对试验菌的MBC则未测得.结论 体外无细胞核糖体表达系统筛选的抗菌肽C13具有一定的抑菌活性,表明利用人工膜模型和核糖体表达进行抗菌肽筛选的方法是可行的,但有效抗菌肽的筛选需进一步的抑菌试验证实.

基于16S核糖体DNA研究中国南方人群结直肠腺瘤患者肠道菌群特征

目的 探讨中国南方人群结直肠腺瘤患者肠道菌群结构和多样性特征.方法 提取标本宏基因组DNA,扩增V4可变区后采用细菌16S核糖体DNA(rDNA)高通量测序技术及生物信息学方法,分析36例健康志愿者及49例结直肠腺瘤患者的腺瘤、腺瘤旁黏膜相关性肠道菌群的多样性;门、科、属、种水平的分布特征和生物学标记.结果 健康对照组与结直肠腺瘤旁组的黏膜相关性肠道菌群多样性和菌群分布相似(P>0.05);结直肠腺瘤组黏膜相关性肠道菌群多样性明显下降(P<0.05),菌群分布主要表现为厚壁菌门、拟杆菌门、毛螺旋菌属、Blautia属、粪球菌属、卵形拟杆菌种丰度显著下降(P<0.05),而变形菌门、盐单胞菌科和海藻希万氏菌属丰度明显增加(P<0.05).结论 高通量测序证实结直肠腺瘤患者有独特的菌群多样性和特征,提示特征性变化的肠道菌群可能参与结直肠腺瘤的发生过程.

应用16S rRNA基因序列分析技术鉴定临床非典型细菌的研究

目的 将16S rRNA基因序列分析技术应用于传统方法鉴定可靠率低或无法鉴定细菌的分类鉴定,以提高临床诊断的准确性. 方法 以本院微生物实验室保存的5株标准菌株验证实验方法的准确性后,收集实验室常规方法不能鉴定或鉴定可靠性低的临床分离菌15株(包括革兰阳性球菌,革兰阳性杆菌及革兰阴性杆菌),提取DNA模板,以通用引物PCR扩增16S rRNA目的片段后测序,将测序结果在GenBank数据库中比对分析以确定菌种. 结果 15株实验细菌中有14株(占93.3％)鉴定到种,包括鼻疽诺卡菌,大肠埃希菌,阿尔莱特葡萄球菌,脆弱拟杆菌,弗氏柠檬酸杆菌,短小芽孢杆菌,河流漫游球菌,极小短小杆菌,伴放线凝聚杆菌,毗邻颗粒球菌;1株菌鉴定到属(占6.7％),归属于短状杆菌属. 结论 16S rRNA基因序列分析技术具有准确、快速和方法简便的特点,适用于对临床非典型菌、少见菌以及新型细菌的鉴定,可作为细菌常规鉴定手段的必要补充.

微小按蚊rDNA内转录间隔2区序列差异

目的：比较不同 地株微小按蚊核糖体DNA(rDNA)内转录间隔2区(ITS2)序列差异。方法:通过对PCR扩增rDNA ITS2片段测序，比较其不同地株差异。结果: 对6株微小按蚊测序比较，存在有微小按蚊A和C型。结论:rDNA ITS2 序列差异可用于建立A、C型的分子鉴别方法。

基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用

目的 构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体.方法 通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列；通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体.为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌.提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上.发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC-MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯.结果 构建了1个酵母整合载体,具有如下特点:①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序.酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上.以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC-MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到(91.33±7.57) mg/L朱栾倍半萜当量.结论 初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体.

核糖体蛋白L12-L10相互作用抑制剂的筛选及其抗结核活性的研究

目的以 L12-L10相互作用为靶点筛选具有抗结核活性的先导化合物。
　　方法应用酵母双杂交模型 AH109（pAD-L12+pBD-L10）通过生长抑制方法筛选阳性化合物，以 AH109（pAD-T +pBD-53）作为对照；通过96孔板法检测阳性化合物对耻垢分枝杆菌的抑制活性；应用定量微孔板快速显色法（MABA）检测抗结核杆菌活性；通过β-半乳糖苷酶活性定量检测判断阳性化合物在模型上对 L12-L10相互作用的阻断活性；应用体外蛋白表达系统检测阳性化合物对蛋白表达的抑制作用；应用平皿二倍稀释法检测阳性化合物的药敏作用。
　　结果筛选到4个在模型上具有活性的阳性化合物，其对耻垢分枝杆菌具有比较好的抑制活性，其小抑制浓度（MIC）在3.125~12.5μg/ml 之间；其中 IBM-T275对结核分枝杆菌标准株和临床分离株均具有比较好的抑制活性， MIC 在5~10μg/ml 之间，而对细菌抑制活性较低，其MIC 均在64μg/ml 以上；IBM-T275能够抑制酵母模型内β-半乳糖苷酶的表达，并且能够体外抑制蛋白表达，其 IC50为12.57μg/ml。
　　结论筛选到1个具有抗结核杆菌活性的阳性化合物，其抗结核活性可能与阻断 L12-L10蛋白相互作用相关。

自噬及其在肿瘤中的作用研究

自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有"自己吃自己"的现象后提出的,是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[1].自噬在机体的生理和病理过程中都能见到,其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明,对肿瘤的研究尤其如此,值得关注.