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人鳞状细胞癌细胞株(A431)中NET-1基因对癌细胞增殖和浸润的影响
目的 探讨小分子干扰核酸(siRNA)对皮肤鳞状细胞癌(简称皮肤鳞癌)细胞株(A431)中NET-1基因的抑制作用,及其基因对癌细胞增殖、浸润的影响.方法 构建针对人NET-1基因的siRNA NET-1真核表达载体(pU6H1-GFP-siRNA NET-1),转染A431细胞后通过半定量RT-PCR检测细胞中NET-1 mRNA水平以筛选较有效的siRNA NET-1.同时设置针对NET-1的正、反义真核表达载体和随机序列对照组siRNA表达载体,体外瞬时转染A431细胞,RT-PCR、Western blot分别检测癌细胞内NET-1 mRNA和蛋白的表达,经免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察NET-1蛋白在细胞内的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪分别榆测A431细胞增殖与占不同细胞周期中细胞增殖指数(PI);划痕试验和Transwell迁移试验分别检测A431细胞的迁移和侵袭能力.结果 测序证实编码NET-1序列的siRNA已经插入载体pU6H1-GFP中U6和H1两个启动子之间,其他载体测序结果 符合设计要求.pU6H1-GFP载体转染A431细胞后其转染率达到80%.转染siRNA NET-1和反义NET-1后分别与未转染组比较,A431细胞中NET-1 mRNA分别减少72%和62%(t值分别为-36.01,-17.65;均P<0.05)和蛋白表达水平分别减少61%和69%(t值分别为-21.13,-33.14;均P<0.05);在转染48 h后能显著抑制A431细胞的增殖、迁移和浸润(均P<0.05).在转染对照组siRNA后并未见到明显的抑制效果.转染正义NET-1后,能分别增加细胞内52%NET-1 mRNA和49%蛋白表达水平(t值分别为12.49,13.98,均P<0.01).结论 靶向NET-1的siRNA真核表达载体能特异、有效的下调NET-1基因蛋白的表达,并抑制A431细胞增殖、迁移和浸润.进而证明内源性NET-1基因的功能与A431细胞增殖、迁移、浸润有关.靶向NET-1的siRNA显示基因抑制效率比反义核酸技术更好.
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下调Smoothened基因抑制乳腺癌干细胞生长的相关机制
目的 利用短发夹RNA(shRNA)下调Smoothened(SMO)基因的表达,研究SMO对乳腺癌干细胞增殖的影响.方法 设计针对人SMO基因的shRNA,转染人乳腺癌MCF-7细胞系,G418筛选出稳定下调SMO基因的细胞株.体外:活细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞增殖的变化,流式细胞仪检测CD44+/CD24-乳腺癌干细胞比例,悬浮球培养检测乳腺球形成的能力,Western blot检测SMO、GLI1及Oct4的表达.体内:每3天检测各组裸鼠成瘤情况,免疫组织化学SP法检测SMO的表达,Western blot检测SMO、GLI1及Oct4蛋白的表达.结果 21 d后筛选出稳定下调SMO基因的MCF-7细胞.CCK8结果显示下调SMO基因可以抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖.流式细胞仪显示下调SMO基因后,CD44 +/CD24-细胞和乳腺癌干细胞球形成的比例明显降低.下调后裸鼠的肿瘤生长速度下降.免疫组织化学检测显示阴性对照组中SMO阳性表达比例为5/5,SMO-shRNA组阳性比例为2/5.两组肿瘤组织中SMO的蛋白表达水平分别为0.72 ±0.17和0.21±0.09,GLI1的蛋白表达水平分别为1.21±0.21和0.47 ±0.12,Oct4的蛋白表达水平分别为0.83 ±0.13和0.25±0.07.SMO、GLI-1和Oct4在SMO-shRNA组中的表达明显低于阴性对照组(P＜0.05).结论 下调SMO基因可以抑制乳腺癌干细胞的增殖.
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RNA干扰抑制α3神经型尼古丁受体的表达对SH-SY5Y神经细胞抗氧化能力的影响
目的 探讨通过RNA干扰技术抑制α3神经型尼古丁受体(nAChR)基因表达后该受体对神经细胞抗氧化能力的影响,来了解α3 nAChR的神经保护作用.方法 设计并体外合成α3 nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸,退火后克隆至pSilencer 3.1-H1 nco质粒中,构建重组质粒α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo.将α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo转染SH-SYSY细胞,用含G418的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用即时荧光定量PCR和Western blot方法检测转染细胞中α3 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化.用1 μmo1/Lβ淀粉样肽1-42(Aβ1-42)处理转染细胞后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定细胞活力;用比色法测定其脂质过氧化产物含量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性.结果 成功构建α3 nAChR siRNA表达质粒,转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α3 nAChR mRNA及蛋白表达量均降低(抑制率分别为98%和66%);经转染处理的细胞活力明显低于对照组,细胞中脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性不同程度的降低;抑制α3 nAChR基因表达后能增强Aβ的神经细胞毒性作用.结论 成功构建的α3 nAChR siRNA表达质粒能特异性抑制α3 nAChR基因表达,α3 nAChR基因表达抑制后可引起氧化应激水平升高,并增加Aβ的神经毒性,表明α3 nAChR具有一定的抗氧化能力和神经保护作用.
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反义Bmi-1 RNA转染对人肺癌细胞株A549体外增殖的影响
目的 研究转染反义Bmi-1 RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响.方法 将表达反义Bmi-1 RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株,GA18筛选挑取阳性克隆.应用即时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达;应用MTT比色法及平板克隆形成实验检测A549细胞体外生长能力;用PI单染及Annexin-V-PI双染技术在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况.结果 Western blot结果显示转染反义Bmi-1RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达量减少了95%;MTT检测细胞生长曲线表明反义Bmi-1 RNA使A549细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成实验结果显示转染反义Bmi-1 RNA的A549细胞在平板中形成集落的数目(0.67±0.50)明显低于未转染组(73.0±4.1)及转染空质粒组(67.0±4.0,P<0.01);流式细胞仪结果显示反义Bmi-1使A549细胞阻滞在G_0/G_1期,但对细胞凋亡没有影响.结论 反义Bmi-1 RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制作用是通过使A549细胞阻滞在G0/G1期实现的.
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靶向着丝粒蛋白A的小RNA干扰对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响
目的 研究靶向着丝粒蛋白A(CENP-A)的siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 设计并合成三对CENP-A编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体pSilencerTM 2.1-U6 neo,构建siRNA真核表达质粒,经稳定转染HepG2细胞后检测肝癌细胞中CENP-A基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况;通过观察HepG2细胞生长、凋亡、细胞周期和平板克隆形成能力评价CENP-A基因干扰对细胞生物学行为的影响;通过检测bcl-2、Bax、p21waf1、mdm2、p53蛋白表达水平初步探讨CENP-A生物学作用的可能机制.结果 三对靶向CENP-A的siRNA干扰片段中有二对抑制效果明显.与未转染组及空载体组相比,转染CENP-A干扰片段的细胞生长减慢,平板克隆形成率下降.细胞周期检测显示,G1期阻滞(P＜0.01),S期细胞比例减少(P＜0.001).细胞凋亡比例增加(P=0.003),并伴随bcl-2蛋白表达明显下降(P=0.000),Bax蛋白表达明显增高(P=0.001).还可致p21waf1表达增高,mdm2表达下降,但对野生型p53表达未显示明显影响.结论 CENP-A通过参与细胞周期调控而密切相关于细胞恶性增殖和凋亡抑制,其机制可能涉及野生型p53非依赖性通路和凋亡相关基因bcl-2Bax的表达异常.
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同源无启动子DNA片段抑制人胰腺癌细胞株整合基因的表达
目的 观察仅转染无启动子绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA全长片段能否使整合有GFP基因的胰腺癌细胞内GFP表达降低.方法 用pEGFP-C1质粒转染人胰腺癌细胞株PANC-1,G418筛选及流式细胞术分选建立GFP蛋白高表达的稳定细胞株.用PCR方法从pEGFP-C1扩增出GFP基因全长cDNA并将其克隆至无启动子的复制型质粒PUC19,得到重组质粒即PUC-GFP.实验分为4组:空白对照组、空质粒组(PUC组)、GFP重组质粒干扰组(PUC-GFP组)、GFP小RNA干扰组(siGFP组).分别用稳定表达GFP和未经处理PANC-1细胞进行实验.用Western印迹、流式细胞术与倒置荧光显微镜检测重组质粒对细胞内稳定表达的GFP的影响及对GFP阴性细胞pEGFPC1质粒瞬时转染后绿色荧光表达强度的影响.结果 PUC-GFP可使稳定细胞株内的GFP表达下降,并且呈剂量依赖性.PUC-GFP组绿色荧光强度减弱程度和空白对照及空质粒组差异有统计学意义(P＜0.05)和siGFP组差异无统计学意义(P＞0.05).转染后第4天GFP表达降低并可持续至第6天,第4天后PUC-GFP组和siGFP组对GFP的抑制差异无统计学意义(P＞0.05).PUC-GFP与pEGFP-C1共转染GFP阴性PANC-1细胞株可使pEGPC1的瞬时转染效率降低.这两种情况下,荧光降低程度均和转染PUC-GFP的量呈正相关.结论 仅转染无启动子的某个特定基因的全长cDNA能使哺乳细胞内相应同源性基因的表达降低.DNA干扰可用于哺乳动物细胞.
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转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长和化疗敏感性的影响
目的研究转染survivin 反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长的影响以及转染后淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性.方法构建survivin 反义mRNA真核表达质粒pcDNA3.1-反义(As)survivin;利用脂质体转染法将其转入高表达survivin mRNA T淋巴母细胞淋巴瘤Jurkat细胞系,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学SP法、Western印迹法检测细胞中survivin表达;用细胞计数、流式细胞术(FCM)检测其细胞生长曲线、细胞凋亡指数,并进行光镜、电镜形态学观察;并对转染pcDNA3.1-Assurvivin前后Jurkat细胞分别加入4-羟基-环磷酰胺(CTX)、甲氨蝶呤(MTX)72 h后,常规MTT检测细胞存活率.结果 RT-PCR检测转染pcDNA3.1-Assurvivin后48 h、5和6周Jurkat细胞survivin mRNA表达,发现survivin mRNA表达皆低于对照组;转染后survivin蛋白表达也明显降低.转染pcDNA3.1-Assurvivin后Jurkat细胞生长倍增时间(52 h)明显延长;用FCM检测细胞凋亡发现,转染pcDNA3.1-Assurvivin后Jurkat细胞凋亡指数[20.2%(48 h)]明显高于对照组(转染空质粒和未转染组,2.1%和1.3%);5和6周为6.2%和6.8%,明显高于未转染细胞(1.3%和1.0%).光镜、电镜观察见转染细胞出现较多凋亡细胞及一些变性肿胀细胞;MTT检测结果显示Jurkat细胞转染前后,经化疗药物4-羟基-环磷酰胺和甲氨蝶呤作用,转染细胞的抑制率明显大于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 survivin基因对Jurkat细胞系的生长起着重要的作用,抑制survivin 基因表达在T淋巴母细胞淋巴瘤治疗中可能有重要的意义,该基因似可能作为治疗的靶点.
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血清HCV RNA检测在预防输血后丙型肝炎中的意义
目的探讨血清HCV RNA检测在预防输血后丙型肝炎中的意义.方法用ELISA法检测2000年1月至2003年12月末抗-HCV阴性的全血标本56 400份次,再进行RT-PCR(荧光适时技术)检测HCV RNA,并对输过HCV RNA筛查阴性血液的患者进行追查.结果HCV RNA阳性率为2.5‰(146/56 400).对输过HCV RNA筛查阴性血液的患者追查结果,无一例发生输血后丙型肝炎.结论对抗-HCV阴性的血液标本用敏感的试剂进行HCV RNA检测在预防输血后丙型肝炎中不但有效,而且可行.
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在翻译水平上提高人干扰素α1基因的原核表达
目的根据翻译起始调控的定量理论及利用翻译增强子序列,提高人干扰素α1型变种IFN-α1C基因的原核表达.方法采用"步移式"聚合酶链反应(PCR), 对IFN-α1C基因5′端核苷酸序列进行三种不同程度的碱基突变, 使IFN-α1C在 pBV220载体中形成的翻译起始区域(TIR)的二级结构自由能(△G)逐渐降低,同时,采用PCR技术,将翻译增强子cDNA序列引入pBV220中的SD序列上游,构建一种新型载体pBVE.结果三种IFN-α1C改造基因的表达量均有所提高,而且随△G从原有的-50 241.6 J/mol降至-22 190.0 J/mol (绝对值,下同),其表达量有逐渐升高趋势, 高可达2.43×108 U/L,约为IFN-α1C母体的13倍.选用IFN-α1C及其三种改造基因为报导基因,结果显示以pBVE为载体的抗病毒活性比在pBV220中增强了2～5倍.结论含有翻译增强子的pBVE为一种新型原核高效表达载体.翻译调控的定量关系理论,可有效地运用于提高IFN-α1C基因在大肠埃希菌中的表达.
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CD4+ CD25+调节性T细胞在HIV/AIDS患者中的作用及其与HIV病毒载量的相关性研究
目的 研究HIV感染者/AIDS患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞(CD4+ CD25+regulatory T cell,Treg)频率、功能及其临床意义.方法 选择31例HIV感染者/AIDS患者和30例健康对照者,采用流式细胞仪检测各组外周血Treg的表型和频率.采取MACS磁珠分选CD4+ CD25+ T细胞,利用[3H]胸腺嘧啶掺入法检测CD4+ CD25+ T细胞在特异性HIV抗原刺激下对CD4+ CD25- T细胞的增殖影响.结果 HIV/AIDS患者组与正常对照组相比较,外周血CD4+ CD25+ T细胞频率在统计学上差异无统计学意义.与正常对照组比较,HIV感染者外周血CD4+ CD25+ T细胞频率升高,差异有统计学意义(P＜0.01);与正常对照组比较,AIDS患者者外周血CD4+ CD25+ T细胞频率降低,差异有统计学意义(P＜0.0001).HIV RNA病毒载量与患者外周血CD4+ CD25+ T细胞数量呈正相关性(P＜0.01).CD4+ CD25+ T细胞具有抑制HIV特异性的CD4+ CD25- T细胞的增殖作用.结论 HIV感染者/AIDS患者的细胞免疫功能紊乱,CD4+ CD25+ T细胞能抑制HIV感染者/AIDS患者的HIV特异性细胞免疫反应,促进HIV病毒复制,与形成持续HIV感染有关.
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人类免疫缺陷病毒1型RNA定量参考品的研制
目的研制人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)RNA核酸国家参考品及制定相应标准.方法收集各地HIV感染者阳性血浆和HIV非感染者血浆,应用HIV、HCV抗体和HBsAg检测试剂进行筛选,对HIV抗体筛查阳性者用新加坡Genelabs公司的HIV BLOT 2.2确证试剂进行确证.以世界卫生组织(WHO)推荐的HIVRNA标准品对国家HIV核酸参考品中定量样品进行标定,并对其稳定性进行研究.结果经过筛选,选出8份样品为阴性参考品,8份样品为阳性参考品,3份为定量参考品,6份为灵敏度参考品,5份为线性参考品.几次独立标定,得到定量参考品HIV RNA的国际单位(IU),其中b1～b3的国际单位的对数值在-x±s以内,表明结果可靠.稳定性实验数据表明,该核酸参考品在4℃以下可存放4 d.结论初步建立了HIV核酸参考品,这将对HIV核酸诊断试剂的质量评价提供重要依据.
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树突状细胞MicroRNA表达谱在HBsAg刺激后的变化
目的 建立HBsAg刺激树突状细胞(DC)前后microRNA (miRNA)表达的差异谱,为研究miRNA在乙型肝炎病毒感染的免疫机制中的作用提供理论基础.方法 体外培养原代DC,分别用HBsAg、LPS、TNFα刺激24 h后提取细胞总RNA,利用基因芯片技术进行比较,筛选出HBsAg刺激后差异表达显著的miRNA,利用计算机软件技术进行靶基因初步预测.结果 HBsAg刺激前后miRNA差异表达2倍以上者共30个,其中16个上调,14个下调.三个不同刺激组间miRNA差异谱存在不同差异.筛选出的靶基因中包含DC信号通路的相关成分.结论 HBsAg刺激DC后的miRNA表达谱的变化存在特异性;靶基因的初步筛选结果进一步提示了miRNA在乙型肝炎病毒感染的免疫机制中可能起着重要作用.
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2009-2011年上海ARTI人群中小RNA病毒感染的分子流行病学研究
目的 探讨上海地区急性呼吸道感染(A RTI)人群中小RNA病毒感染的流行规律及临床特征.方法 采用套式多重RT-PCR方法,同时检测鼻咽拭子标本小RNA病毒和其他8种常见呼吸道病毒.对其中小RNA病毒阳性标本进行基因分型,并进一步分析其流行病学和临床特征.结果 2282份鼻咽拭子标本中检出小RNA病毒阳性185例(8.1％),其中鼻病毒(HRV)为151(81.6％)例,肠道病毒(EV)为34(18.4％)例.HRV-A(61.6％)是HRV的主要亚型.HRV在0～4岁组及65岁以上组中检出率高于FluA、RSV等常见呼吸道病毒.HRV和EV在不同季节均有检出,其中HRV在秋冬季达到高峰.HRV引起的URTI和LRTI的比例分别为62.3％ (94/151)、37.8％ (57/151),而EV感染病例均为URTI.HRV感染阳性的LRTI病例中亚型与LRTI的发生无显著相关性(P＞0.05).结论 本研究表明,2009-2011年小RNA病毒成为上海地区急性呼吸道感染谱的重要组成部分,其中HRV(HRV-A)为主要病原.HRV是0～4岁组及65岁以上组中常见的呼吸道病毒,并以秋冬两季为高发季节.HRV亚型与临床重症并无相关性.
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肝癌组织RUNX3mRNA和蛋白表达及其与临床病理的相关性研究
目的 探讨肝癌组织及其癌旁组织中RUNX3mRNA和蛋白表达情况,并分析其与临床病理因素的相关性.方法 采用RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)和IHC(免疫组织化学)分别检测肝癌组织及其癌旁组织中RUNX3mRNA和蛋白表达水平,并分析与临床病理因素的相关性.结果在51例肝癌组织中RUNX3mRNA表达量相对值为:0.4509±0.0963；在51例相对应的癌旁组织中RUNX3mRNA表达量相对值为:0.9147 ±0.0222；两者间差异有统计学意义(t=33.6087,P＜0.001).在51例肝癌组织中RUNX3蛋白表达阳性率为49.02％( 25/51)；而在51例相对应的癌旁组织中RUNX3蛋白表达阳性率为82.35％ (42/51)；两者间差异有统计学意义(x2=12.5706,P＜0.005).RUNX3mRNA和蛋白表达水平均在分化程度、门静脉癌栓、肝内转移等病理因素差异有统计学意义(P＜0.05),而在性别、肿瘤直径、肿瘤部位、癌肿出血坏死、组织分型的差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 RUNX3基因在肝癌组织中mRNA和蛋白表达水平均显著低于在癌旁组织中的表达水平,RUNX3mRNA和蛋白表达下调可能在肝癌的发生、发展过程中起着重要作用；RUNX3基因可能是肝癌的一种抑癌基因.
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TRIzol(或TriPure)试剂结合QIAamp Viral RNA Mini试剂盒用于血标本中病毒RNA提取的研究
目的 建立一种安全、简便、可靠的适用于血标本中有包膜RNA病毒核酸提取的方法,保证埃博拉病毒核酸筛查的实验室安全,提高标本的核酸检测效率.方法 根据已发表可完全灭活埃博拉病毒的方法,通过实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)方法,比较分析QIAamp Viral RNA Mini试剂盒、TRIzol(或TriPure)试剂裂解样本并用或不用氯仿萃取后结合QIAamp Viral RNA Mini试剂盒等3种方法提取核酸的效率,优化反应步骤,建立一种安全、简便的血标本中病毒RNA提取方法.结果 血标本经TRIzol(或TriPure)试剂处理后,不经氯仿萃取,与QIAamp Viral RNA Mini试剂盒结合,提取病毒RNA,RNA提取效率优于QIAamp Viral RNA Mini试剂盒和美国CDC推荐的方法.结论 采用TRIzol(或TriPure)试剂裂解病毒,结合QIAamp Viral RNAMini试剂盒提取病毒RNA的方法简便、可靠,可用于埃博拉出血热相关标本的核酸检测.
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HBV X siRNA与5-氮-2'-脱氧胞苷对裸鼠肝癌皮下移植瘤作用的研究
目的 目的 探讨靶向HBV X的siRNA(X-siRNA)和5-氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-dC)对HBV相关肝细胞癌生长的影响及可能机制.方法 设计合成X-siRNA及对照siRNA,用siRNA处理HepG2/GFP-HBx细胞,RT-PCR法测定处理细胞的HBV X基因表达;将HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞接种于裸鼠皮下建立裸鼠肝癌皮下移植瘤,分别用X-siRNA、5-aza-dC单独或联合处理裸鼠并观察移植瘤生长;甲基化PCR测定移植瘤组织p16基因甲基化.结果 RT-PCR检测示X-siRNA处理的细胞HBV X mRNA水平明显降低;裸鼠体内实验显示HepG2/GFP-HBx组的皮下移植瘤体积明显大于HepG2/GFP组(P＜0.05);X-siRNA与5-aza-dC处理组移植瘤体积明显小于未处理组(P＜0.05);甲基化PCR检测示HepG2/GFP-HBx组移植瘤组织存在p16甲基化而HepG2/GFP组未检出p16甲基化;X-siRNA、5-aza-dC处理的移植瘤组织中p16基因甲基化减低.结论 X-siRNA及甲基化抑制剂可能通过逆转p16甲基化而能有效抑制肝细胞癌生长,具有潜在应用价值.
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白纹伊蚊感染登革病毒后病毒特异性piRNAs分析
目的 筛选并分析白纹伊蚊感染登革病毒后病毒特异性vsRNAs与vpiRNAs.方法 白纹伊蚊羽化后2～4d雌性成蚊显微注射DENV-2病毒NGC株,对照组注射生理盐水.8d后提取样品总RNA,分离小RNA,通过illumina Hiseq 2000测序仪进行测序分析.以SOAP2软件与DENV-2基因组和互补序列进行比对.对病毒特异性的vsRNAs与vpiRNAs的长度、碱基与链偏好性、基因组分布进行分析.结果 对于感染蚊虫,我们共计获得3835个特异的DENV-2来源的vsRNAs,其中395个特异性的vpiRNAs.94.99％ vpiRNAs主要来源于病毒的正链基因组.vpiRNAs在DENV-2基因组上的分布也具有偏向性,高峰位于病毒非结构蛋白NS5编码区域的3'末端.第10位碱基具有较强的腺嘌呤偏好性,但第1位碱基不具有尿嘧啶偏好性;也无典型“乒乓”扩增循环的特征.结论 白纹伊蚊感染登革病毒后,体内出现病毒特异性vsRNAs与vpiRNAs,对其鉴定与分析将为在白纹伊蚊抗病毒免疫研究提供理论基础.
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子宫内膜癌microRNA表达谱的初步研究
目的 筛选子宫内膜癌与正常子宫内膜组织中的差异mieroRNA.方法 收集3例患者的新鲜子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织,利用miRNA芯片对其进行实验分析,并采用茎环逆转录荧光定量PCR方法验证芯片结果的准确性.结果 相对正常子宫内膜组织,子宫内膜癌组织中表达上调的miRNA基因68个,下调的miRNA基因81个.采用茎环逆转录荧光定量PCR对显著上调的hsa-miR-205,hsa-miR-200b和hsa-miR200c以及显著下调的hsa-miR-495,hsa-miR-216b的验证结果与芯片检测结果一致.结论 筛选获得了子宫内膜癌的miRNA的差异表达谱,可能在子宫内膜癌的发病机制中发挥潜在作用
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巨细胞病毒感染后晚期mRNA表达与细胞病变相关性的研究
目的研究巨细胞病毒(HCMV)感染后晚期mRNA的表达与致细胞病变作用(CPE)及感染细胞的超微结构变化.方法用HCMV AD169株感染人胚肺成纤维细胞,通过半定量RT-PCR检测HCMV晚期mRNA的表达水平,同时动态观察CPE的改变,电镜观察细胞的超微结构变化.结果HCMV晚期mRNA在感染后12 h开始表达,随时间的延长水平逐渐升高;而CPE在48 h后才出现,并逐渐加重.电镜下可见内质网早期囊腔扩张,晚期呈空泡变,线粒体肿胀,线粒体嵴数目减少,甚至缺失,感染晚期细胞核中有大量成熟待出壳的病毒核衣壳.结论细胞超微结构变化与HCMV晚期mRNA表达密切相关,在病毒循环中起重要作用.晚期mRNA可作为观察治疗HCMV活动性感染的临床疗效指标.
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在兰州地区儿童粪便中检测 Aichi virus
目的 从兰州腹泻和正常儿童粪便标本中检测 Aichi virus,同时探讨 Aichi virus 与婴幼儿腹泻之间的联系.方法 根据文献发表资料,采用RT-PCR方法扩增 Aichi virus 3CD 片段,阳性产物经测序确定,并与已发表的该病毒序列进行比对分析.结果 在46份腹泻住院患儿粪便标本和299份腹泻门诊就诊患儿标本中各检出1例 Aichi virus,总检出率为0.06%,正常对照儿童中未检测到 Aichi virus.2株病毒3CD区基因与已知参考株核苷酸序列同源性均为97%,系统进化分析显示这2株病毒属于B基因型.结论 我国存在B基因型的 Aichi virus,但要明确我国 Aichi virus 的病原学及流行病学特点需要更多研究.
