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两种HCV RNA载量检测试剂相关性分析
目的:分析进口与国产试剂在HCV RNA定量检测中的相关性,评价国产HCV RNA荧光定量PCR试剂在不同病毒载量时的检测能力.方法:以美国Roche 公司COBAS Amplipreo/cobas TaqMan HCV test试剂(Roche试剂)对标本的HCV RNA 定量为标准,评价某国产HCV荧光定量PCR试剂(DA试剂)对不同病毒滴度标本的检测性能.分析两种试剂检测HCV RNA结果的相关性,对DA试剂在不同病毒载量时的检测能力进行评价.结果:两种试剂检测结果存在线性相关(R2=0.916,P＜0.01),Roche试剂检测结果[(5.68±1.22)IU/ml,lg]高于DA试剂检测结果[(4.16±1.24)IU/ml,lg],差别有统计学意义(P＜0.01);对检测HCV高病毒载量[(≥5～＜7)IU/ml,lg和≥7IU/ml,lg]组,两种试剂相关性较高(R2分别为0.781 、0.729,P＜0.01)对低HCV病毒载量(≥3～＜5)IU/ml,lg组,两种试剂相关性较低(R2=0.483,P＜0.01);病毒载量在(≥3～＜4)IU/ml,lg组,DA试剂假阴性为45.4%(5/11);病毒载量(≥1.18～＜3)IU/ml,lg组及＜1.18 IU/ml,lg组,DA试剂均未检出.结论:与Roche试剂相比,DA试剂在高病毒载量标本的相关性较好,低病毒载量标本的相关性低于高病毒载量标本.DA试剂检测HCV RNA的线性范围较窄,与Roche试剂相比存在一定差距.
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器官移植受者外周血中人巨细胞病毒pp67-mRNA的RT-PCR检测
目的 探讨使用权用RT-PCR的方法对人巨细胞病毒pp67-mRNA检测的可行性.方法 对38例肾移植受者的外周血样本共68份分别进行免疫荧光技术检测pp65抗原和RT-PCR技术检测人巨细胞病毒pp67-mRNA.结果 在7例受者个周血中的1份外周血样本中检出pp65抗原阳性，并有1例诊断为HCMV病;在3例受者外周血中的3份外周血样本中检出pp67-mRNA阳性,基中包括2例受者的2份样本pp65抗原同时检出为阳性并有1例诊断为CMV病.结论 pp65抗原细胞病毒pp67-mRNA结果不具有同一性，不能使用pp67-mRNA检测取代pp65抗原的检测.使用RT-PCR可以对人巨细胞病毒pp67-mRNA作出定性的判断.
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风心病心房颤动患者心房肌肌浆网IP3-I受体mRNA表达变化的研究
目的:研究房颤患者肌浆网钙释放通道-IP3-I受体(IP3R1)mRNA表达的改变,探讨房颤时心肌细胞浆Ca2+超负荷的原因.方法:风心病二尖瓣狭窄接受外科手术38例,手术时取右心房及右心耳心肌各约100 mg.通过RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)技术,以GAPDH为内参照,测量IP3R1 mRNA的变化.结果:房颤者肌浆网IP3R1 mRNA较窦性心律者上调,心房不同部位无差别.结论:房颤患者IP3R1 mRNA上调,说明心肌细胞Ca2+超负荷与肌浆网钙库的排空有关.
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原发性肝癌患者PBMC AFP mRNA表达与其微转移的相关性研究
目的探讨PHC患者PBMC AFP mRNA表达与微转移的相关性.方法应用巢式RT-PCR检测102例PHC、22例转移性肝癌及其他恶性肿瘤,16例慢性乙型肝炎、22例肝硬化和40例献血员中PBMC AFP mRNA表达水平.结果 AFP mRNA在献血员、转移性肝癌及其他恶性肿瘤、慢性乙型肝炎患者PBMC中均为阴性;在PHC组PBMC中AFP mRNA的检出率(56.86%,58/102)明显高于肝硬化组(9.09%,2/22,P＜0.05).PBMC AFP mRNA的表达与临床分期、门静脉癌栓、肝内转移、远处转移明显相关(＜0.05),而与肿瘤直径、数目及血清AFP浓度无明显相关(＞0.05).结论巢式RT-PCR检测PHC患者 PBMC AFP mRNA是一种早期发现PHC血道播散的可靠而又敏感的实验方法.
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OPN和uPA mRNA在肝细胞癌组织中的表达及临床意义
目的 探讨骨桥蛋白(OPN)mRNA及尿激酶犁纤溶酶原激活物(uPA)mRNA在肝细胞癌(HCC)组织巾的表达及与临床病理特征的关系.方法 应用RT-PCR方法检测60例HCC癌组织、20例正常对照肝组织中OPN和uPAmRNA的相对表达量.结果 HCC癌组织中OPN和uPA mRNA的阳性表达率均分别高于对照正常肝组织(P均<0.05):痛组织中OPN mRNA的表达量在有门静脉癌栓形成组及在有早期复发转移组均高于无门静脉癌栓形成组和无早期复发转移组(分别P<0.05和P<0.01),uPA mRNA的表达水平在有包膜浸润和有门静脉痛栓形成组中均高于无包膜浸润和无门静脉癌栓形成组(分别P<0.05和P<0.01):OPN mRNA的高表达和uPA mRNA的高表达呈正相关(P<0.05).结论 HCC癌组织中OPN的表达水平可以作为判断肝癌细胞转移能力和预示肝癌早期复发的重要指标.阻断OPN的表达可能可以降低uPA的分泌,从而减少肿瘤的浸润和转移.
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内毒素血症大鼠淋巴细胞中降钙素基因相关肽(CGRP)释放及mRNA表达的变化
目的测定大鼠内毒素血症期间淋巴细胞释放和合成降钙素基因相关肽(CGRP)的变化.方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定大鼠淋巴细胞CGRP mRNA水平.用放射性标记法测定血浆CGRP水平.结果注射内毒素大鼠血浆和淋巴细胞释放CGRP均增高,淋巴细胞中CGRP mRNA表达也明显增高.结论提示内毒素不仅刺激淋巴细胞释放CGRP,而且能通过某些机制激活淋巴细胞CGRP mRNA的转录,使CGRP合成增加,以作为CGRP大量释放的重要补充来源.
关键词： 内毒素血症/代谢 淋巴细胞/代谢 降钙素基因相关肽/代谢 RNA 信使 -
TRAIL mRNA实时荧光定量方法的建立及对慢性乙肝患者外周血单个核细胞检测的意义
目的:建立肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)mRNA的实时荧光定量PCR检测方法,探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中TRAIL mRNA与HBV载量的关系及TRAIL在HBV感染后肝损伤中的作用.方法:自行建立检测TRAIL mRNA的 TaqMan实时荧光定量RT-PCR法,对58例慢乙肝患者PBMCs中TRAIL mRNA进行测定,采用夹心酶联免疫吸附法(ELISA)分析其血清可溶性TRAIL(sTRAIL)水平,实时荧光定量法检测PBMCs中HBV DNA含量,与肝功能相关指标进行相关性分析.结果:各型慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞TRAIL mRNA表达水平高于健康者(t=28.311,P＜0.001),但各组间差异显著性,与PBMCs中HBV载量无相关性.CHB轻度、CHB中度、重度～慢性重型肝炎、LC 患者血清sTRAIL水平比健康者sTRAIL水平降低(t=0.801,P=0.430;t=2.315,P=0.027;t=2.672,P=0.013;t=5.085,P=0.000),各型慢性乙型肝炎之间差异无统计学意义,与白蛋白(Alb)呈正相关(r=0.426,P=0.002),与TBil、ALT及PBMCs中HBV载量无相关性.结论:慢性乙肝患者PBMCs中TRAIL mRNA表达水平增加,血清sTRAIL水平降低,血清sTRAIL与Alb呈正相关,提示外周血单个核细胞膜结合型TRAIL增加,经TRAIL参与的肝细胞损害增加.
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血液癌胚抗原mRNA在消化系统肿瘤转移与未转移患者中的检测比较
目的:分析检测血液中癌胚抗原信使核糖核酸(CEA mRNA)诊断消化系统肿瘤血行转移的应用价值.方法:以消化系统肿瘤转移35例(转移组)、未发现肿瘤转移32例(对照组)为对象,应用逆转录-套式-聚合酶链反应技术检测血液标本CEA mRNA.结果:肿瘤转移组的CEA mRNA阳性结果(29例)远高于未转移组(3例)(P<0.001),CEA mRNA指标诊断消化系统肿瘤血行转移的特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值分别为90.6%、82.5%、90.6%、82.6%.结论:CEA mRNA是一个实用价值较高的诊断消化系统肿瘤血行转移指标,检测血液CEA mRNA有助于了解肿瘤血行转移.
关键词： 癌胚抗原/血液 RNA 信使/血液 消化系统肿瘤/病理学 肿瘤转移/血液 -
异丙酚靶控输注系统研究不同麻醉深度下兔脑c-fos mRNA水平的改变
目的:研究异丙酚不同麻醉深度对兔脑c-fos mRNA水平的影响.方法:30只日本大耳兔,随机分为对照组、浅麻醉组、深麻醉组,每组各10只.应用异丙酚靶控输注系统,研究异丙酚不同麻醉深度下大脑额叶皮质,小脑皮质浦肯野细胞层、颗粒细胞层c-fos mRNA表达水平的改变.结果:与对照组比较,大脑额叶皮质,小脑皮质浦肯野细胞层c-fos mRNA表达水平随着麻醉深度的增加而显著升高(P<0.05);小脑皮质颗粒细胞层c-fos mRNA表达水平在麻醉状态下显著升高(P<0.05),但麻醉深度的增加并不能进一步降低其灰度值.结论:异丙酚通过增加c-fos mRNA的表达,影响随后反应基因的转录而发挥抑制中枢的作用.异丙酚抑制中枢的作用部位存在区域性差异.
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siRN A抑制Wnt-1基因对人肺腺癌细胞株A2的影响
目的:研究siRNA对人肺腺癌细胞株A2中Wnt-1基因表达对细胞生物学行为的影响.方法:将siRNA用脂质体转染A2细胞,RT-PCR测定Wnt-1 mRNA表达变化;Western blotting测定Wnt-1蛋白表达的变化;流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响.结果:与对照组相比,传染siRNA后,实验组靶基因mRNA表达和蛋白表达均有明显降低,细胞凋亡增加.结论:Wnt-1特异性siRNA能有效干扰A2细胞内其相应基因的表达,而靶基因表达受到抑制后细胞凋亡增加.
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Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体的构建及鉴定
目的:构建Survivin 反义RNA/HSP70双基因表达载体,为后期转染肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及激发机体有效的特异性抗肿瘤免疫应答提供重要的实验材料.方法:应用RT-PCR从Jurkat细胞中获得Survivin cDNA片段,反向插入pIRES2-DsRed2质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的Survivin 反义RNA表达载体是否成功;应用RT-PCR从HepG2细胞中获得的HSP70 cDNA片段,定向插入到pIRES2-DsRed2质粒载体中;经菌落PCR、酶切和测序鉴定所构建的HSP70表达载体是否正确.结果:经酶切和测序鉴定证明Survivin 反义RNA表达载体已成功构建;经菌落PCR、限制性酶切和测序鉴定证明HSP70表达载体已成功构建.结论:本实验已成功构建了Survivin 反义RNA/HSP70双基因表达载体,为进一步研究提供了实验基础.
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IL-1β反义RNA在肝癌细胞中对NK细胞固有免疫杀伤的影响
目的:探讨将所获IL-1β反义RNA真核表达载体导入HepG2细胞后,肝癌细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化.方法:转染后用RT-PCR法检测反义基因片段的表达,MTT比色法分析NK-92细胞杀伤活性的变化.结果:转染后反义RNA均得到高水平表达,并使NK细胞的杀伤活性提高约15%.结论:IL-1β反义RNA可在一定程度上恢复肝癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性.
关键词： 肝肿瘤/免疫学 白细胞介素1/生物合成 白细胞介素1/遗传学 RNA 反义 杀伤细胞 天然 -
丙型肝炎病毒分子生物学研究与治疗进展
本文仅就丙型肝炎病毒的分子生物学研究及当前和将来可能出现的治疗药物综述如下.1 丙型肝炎病毒的分子生物学研究1.1 丙型肝炎病毒的分子生物学丙肝病毒是一种带包膜的正链RNA病毒,其基因组含9600个核苷酸,编码一条长约3 000左右氨基酸的多肽链,这条多肽链经细胞内的蛋白酶及病毒本身的蛋白酶进一步切割加工成10个独立多肽,参与病毒的复制与繁殖[1].作为RNA病毒的家族成员,丙肝病毒表现为高度的遗传异质性,已发现6种主要的基因型及近百种亚型,在世界不同地区分布几率不同.其中以1型和2型为常见,不同基因型的药物敏感性及临床表现不同.丙肝病毒的复制主要发生在肝细胞中,在急性感染期,其复制率可以高达每天1012个病毒颗粒.近年来,人们对丙肝病毒的生长周期有了基本的认识:
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结肠癌患者实时荧光定量RT-PCR检测门静脉血CK19 mRNA水平及其临床意义
目的:探讨细胞角蛋白19(Cytokeratin 19,CKl9)mRNA在结肠癌术中患者门脉血中的表达及临床意义.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测CKl9mRNA在结肠癌手术中患者门脉血中的表达,随访并记录术后24个月时患者的生存情况.结果:90例结肠癌患者门脉血CKl9 mRNA阳性者62例,阳性率为66.7%;结肠癌组织CKl9 mRNA的表达与分化程度、Dukes分期有相关性(分别rs=O.280,P=O.008;rs=0.367,P
关键词： 结肠肿瘤/病理学/血液 聚合酶链反应/方法 角蛋白/血液/遗传学 RNA 信使 门静脉 人类 -
多功能靶向纳米载体的制备及其对神经母细胞瘤的靶向性和MRI示踪性观察
目的 制备集靶向siRNA传递及MRI显像功能于一体的多功能靶向纳米载体,并验证其对神经母细胞瘤的靶向性及MRI示踪性.方法 制备PEG-PEI-SPION,scAbGD2 -PEG-PEI-SPION并检测其基本特性.利用凝胶阻滞检测纳米载体与siRNA的复合能力；以CLSM及MRI验证纳米载体的靶向性.结果 PEG-PEI-SPION,scAbGD2-PEG-PEI-SPION平均粒径分别为(60.0±2.3)nm及(90.0±7.8)nm.氮磷比(N/P)≥2.2时siRNA与PEG-PEI-SPION,scAbGD2 -PEG-PEI-SPION完全复合.CLSM实验及MRI结果证实scAbGD2-PEG-PEI-SPION具有靶向性.结论 scAbGD2-PEG-PEI-SPION对神经母细胞瘤具有靶向传递siRNA及MRI显影的功能.
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小分子单链RNA与胃癌的研究进展
肿瘤的预防、早期诊断和治疗一直是人类难以攻克的难题.胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,据估计每年有超过90万的新确诊病例和大约70万的胃癌患者死亡,居肿瘤死亡病因的第二位[1],死亡的肿瘤患者中有90%已发生了转移[2].
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siRNA干扰血小板内皮细胞黏附因子-1表达对人鼻咽癌耐药细胞CNE1/R多药耐药性的影响
目的 探讨抑制血小板内皮细胞黏附因子-1(PECAM-1)表达对多药耐药基因1(MDR-1)及其编码产物P-糖蛋白(P-gp)的影响.方法 设计并化学合成针对PECAM-1的三条siRNA序列,命名为si-PECAM1,2,3,脂质体转染法将其转入CNE1/R,采用Semi-qRT-PCR、Western blot方法检测并筛选出抑制效果好的si-PECAM序列,将筛选出的si-PECAM转入CNE1/R,采用Semi-qRT-PCR、Western blot方法检测抑制PECAM-1表达前后MDR-1及其编码产物P-gp的变化情况.结果 Semi-qRT-PCR的结果显示,设计三条si-PECAM序列均有效,以si-PECAM3干扰效果明显(P<0.001),Western blot结果显示与Semi-qRT-PCR的结果一致;转染si-PECAM3 48 h后做Semi-qRT-PCR的结果显示抑制PECAM-1表达后MDR-1表达明显下调(P<0.001),Western blot结果与Semi-qRT-PCR的结果一致,抑制PECAM-1表达后MDR-1编码产物P-gp的表达也明显下调(P<0.001).结论 抑制CNE1/R中PECAM-1表达后MDR-1及其编码产物P-gp的表达均明显下调,提示PECAM-1可能参与X射线辐射诱导人鼻咽癌细胞发生多药耐药.
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TLR4基因小干扰RNA对缺氧复氧诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响
目的 研究Toll样受体4(TLR4)基因小干扰RNA(siRNA)对体外缺氧复氧条件下诱导肾小管上皮细胞分泌TNF-α的抑制作用.方法 Wistar大鼠原代肾小管上皮细胞(PTECs)置于六孔培养板培养,随机分为A组(正常培养组)、B组(缺氧复氧+TLR4-siRNA转染组)、C组(缺氧复氧组)、D组(缺氧复氧+对照siRNA转染组)共4组.其中B组、C组和D组细胞缺氧3 h,随后复氧24 h,RT-PCR方法和Western blot检测TLR4 mRNA和蛋白表达情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况,ELISA方法检测各组上清液中TNF-α含量.结果 经缺氧复氧处理后,B组、C组和D组的TLH4mRNA、蛋白水平较A组均显著上调(P<0.01),各组上清液TNF-α含量较A组也显著升高(P<0 01):而B组TLR4mRNA、TLR4蛋白表达量和上清液TNF-α含量较C组和D组均显著下调(P<0 01);D组与C组相比,各项检测指标表达无显著变化(P>0 05).结论 针对TLR4 mRNA的sir-NA可以有效地抑制缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞的凋亡和炎症反应.
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HCV核心抗原动态监测抗HCV疗效的临床研究
Objective To evaluate the performance of Hepatitis C virus (HCV) core antigen and HCV RNA PCR in the determining of the efficacy of HCV antiviral therapy in patients infected with HCV. Methods HCV core antigen and HCV RNA were measured in sera of 35 chronic HCV infected Chinese patients. Concentrations of HCV core antigen and HCV RNA were analyzed at 5 time points before, during and at the end of antiviral therapy. Results This study showed that the HCV core antigen and HCV RNA concentrations in 35 HCV patients were significantly correlated. Decrease of HCV core antigen and HCV RNA concentrations at the 4th, 12th,24th and 48th week were observed during the antiviral therapy. However,HCV core antigen levels at week 12 and 24 of therapy were significantly lower than those at week 4 (P < 0. 05 ). In contrast,no further decrease was observed in HCV RNA concentrations at weeks 12 and 24 (P >0. 05). HCV core antigen testing may be advantageous in some cases,in particular,the low levels of HCV core antigen at week 4 may be predictive of satisfactory outcome of treatment. Conclusions HCV core antigen represents a stable and sensitive marker of viral replication and could be used to monitor the clinical efficacy of HCV antiviral therapy.
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靶向封闭再生基因Ⅰα对胰腺癌细胞SW1990增殖行为的影响
目的 观察靶向封闭再生基因Ⅰα(REG Ⅰα)对胰腺癌细胞株SW1990增殖行为的影响.方法 设计并体外合成靶向REG Ⅰα的小干扰RNA(siRNA),将其转染到SW1990细胞中,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后REG Ⅰα基因表达的变化.采用MTT法检测转染前后细胞增殖能力的改变,流式细胞技术检测细胞周期的变化.结果 REG Ⅰα siRNA转染胰腺癌细胞SW1990后,明显抑制REG Ⅰα基因表达,以200 nmol/L REG Ⅰα siRNA对REG Ⅰα基因表达抑制效果佳.以该浓度的REG Ⅰα siRNA转染SW1990细胞后,SW1990细胞在siRNA转染后48 hREG Ⅰα mRNA表达抑制率高,达82%;干扰后SW1990中REG Ⅰα蛋白表达也明显下调.抑制SW1990细胞中REG Ⅰα的表达后,SW1990细胞的增殖能力明显下降,与阴性对照组(转染无关序列的siRNA)及空白对照组(无任何处理)相比,差异有统计学意义(P<0.05).转染细胞的周期分布有明显改变:G1期细胞增加,S期细胞减少.结论 靶向封闭REG Ⅰα基因能明显抑制胰腺癌细胞SW1990在体外的增殖能力,为探索胰腺癌基因治疗提供新的策略.
