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孕妇外周血中胎儿细胞和DNA的分离及分析
近年来无创伤性产前遗传学诊断技术的研究进入到胎儿染色体和基因的诊断,利用母血中胎儿细胞及其遗传物质进行产前诊断.胎儿细胞中有核红细胞(NRBC)在母体外周血中的数量较多,此类细胞含有胎儿的全部遗传信息,且生命周期较短,是理想的产前诊断的胎儿细胞,在此介绍几种从母血中分离胎儿有核红细胞的方法.业已证实,母体外周血中存在胎儿DNA,且DNA的浓度随孕周而增高,这使得从母血中直接获取胎儿DNA来进行基因诊断成为可能.目前聚合酶链反应(PCR)及荧光原位杂交(FISH)技术是较为成熟的分析胎儿DNA的方法.
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孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离和富集
产前诊断是遗传性疾病早期诊断的重要手段,可以有效减少出生缺陷的发生风险.以孕妇外周血中胎儿遗传物质为检测和分析目标的无创产前诊断技术发展迅速,其中孕妇外周血中胎儿有核红细胞与其他胎儿细胞或游离胎儿DNA比较,前者有明显优势.本文就胎儿有核红细胞的分离和富集技术的研究现状进行综述.
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干预离子通道联合密度梯度离心富集胎儿有核红细胞
目的 探讨干预膜表面K-CI同向转运体(KCC)离子通道联合密度梯度离心对富集脐血中胎儿有核红细胞(NRBC)的效果.方法 用KCC特异激活剂尿素(Urea)干预细胞膜,建立大限度缩小细胞体积的干预条件;用佳干预条件干预脐血后进行不同密度介质下离心富集NRBC,用流式细胞仪计数NRBC的富集效果.结果 比较传统1.077淋巴细胞分离液离心后的单个核细胞层流式细胞仪计数NRBC为8.6%,干预脐血后用1.065密度介质离心后下层NRBC达69.9%,未干预组中用1.099密度介质离心的单个核细胞层NRBC达55.9%,提高了富集量.结论 尿素干预联合密度梯度离心能有效提高NRBC的富集率.
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重度子痫前期孕妇外周血FNRBC与其红细胞免疫状况的关系及意义
子痫前期是妊娠期特有的严重并发症,可能与患者自身免疫系统病理损伤和紊乱有关,本研究通过检测重度子痫前期患者母血胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBC)数量及其红细胞免疫黏附功能变化及相关性分析,从而为重度子痫前期发病的町能机制提供理论依据.
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三种特异性抗体结合流式细胞术分选母血中胎儿细胞方法的评价
研究证实母血中的游离胎儿细胞可用于无创性单基因病产前诊断[1,2].胎儿细胞仍是检测胎儿染色体异常的惟一来源[3],虽然母血中胎儿有核红细胞(FNRBC)数量很少,但其特异性形态在正常人外周血中极罕见,并可携带完整的胎儿基因.因此,建立富集母血中胎儿细胞的方法则是无创性产前诊断的关键.本研究用3种FNRBC特异性抗体和流式细胞术分选胎儿细胞,并通过计算FNRBC准确率和特异性,以评价分选母血中胎儿细胞的适宜方法.
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基于胎儿细胞的无创产前检测技术研究进展
经过近半世纪的探索研究,基于母体内胎儿细胞的产前检测技术随着新技术的开发和利用,尤其在单细胞测序技术长足发展这一背景下,正在逐步走向临床.在此我们回顾这类研究的新进展,讨论此类技术的突破对将来的产前诊断技术策略的影响.
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应用转铁蛋白受体和胎儿血红蛋白标记染色方法分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞的研究
由于孕妇外周血中胎儿细胞的含量极少,Hahn, Holzgreve[1]和Bianchi等[2]报道,孕妇每毫升外周血中仅有1~2个完整胎儿细胞.所以采用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记,并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术,是分离、纯化孕妇外周血中胎儿细胞的佳手段[3].但因目前尚未发现识别胎儿细胞的特异性抗体,故不同学者选用的标记性抗体也有所不同.本研究采用荧光激活细胞分离技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS ),通过对孕妇外周血及未孕妇女外周血中转铁蛋白受体(transferrin receptor, CD71)单标记染色和胎儿血红蛋白(fetal haemoglobin,HbF)单标记染色与双标记染色情况的比较,探讨CD71 与HbF染色法分选胎儿有核红细胞的价值.
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β地中海贫血的无创性产前诊断研究进展
β地中海贫血(β地贫)是常见的常染色体隐性遗传性疾病之一,呈地域性分布,其人群携带率为2%~25%,在我国长江以南地区发病率很高。重型β地贫患儿,在出生后4~6个月出现贫血症状,需接受输血治疗,多在童年期夭折。目前,产前诊断β地贫基因是预防重型β地贫患儿出生的有效方法。产前诊断包括侵入性方法(invasive prenatal diagnosis)和无创性(non-invasive prenatal diagnosis)方法。前者主要通过穿刺技术获取充足的胎儿物质进行胎儿基因检测,但其存在流产、胎膜早破、感染等并发症风险[1-2]。无创性产前诊断指从母体外周血中分离、收集游离胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBC)或游离胎儿核酸(cell-free fetal nuleic acid,cffNA)进行产前诊断,避免了因穿刺手术所导致的流产等并发症,因此,无创性产前诊断是产前诊断领域的重要研究方向。
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母体外周血中胎儿有核红细胞在产前诊断中的应用
目前,对胎儿染色体非整倍体及单基因疾病的产前诊断,主要通过羊膜腔穿刺或绒毛膜取样的侵入性方法获取胎儿遗传物质,运用各种细胞遗传学和分子遗传学方法进行检测.这些侵入性临床操作,对孕妊娠妇女和胎儿具有一定的风险[1].
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从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞方法学初探
从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断成为新的研究热点,胎儿有核红细胞被认为是理想的研究对象[1].本研究采用简单的不连续密度梯度离心法分离富集孕妇外周血中有核红细胞,进行Y染色体特异性DYZ1 基因的聚合酶链反应(PCR)扩增以预测胎儿性别,探讨胎儿有核红细胞用于无创性产前诊断的一些问题.
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21-三体综合征无创性产前诊断新进展
21-三体综合征是胎儿常见的染色体病,发生率约为1/800,占小儿染色体病的70%~80%,发生率随着母亲年龄的增高而增高.当前在进行产前诊断时采用的是有创方法来获取胎儿细胞以明确产前诊断.有创检查对母儿存在一定的风险,因此临床上仅用于有遗传学高风险的孕妇.过去几十年中,一直广泛应用的方法之一是从母血中分离胎儿有核红细胞,但是胎儿有核红细胞在母血中含量稀少、需进行细胞富集等操作,限制了其发展和应用[1],因而临床医学工作者迫切期望建立一套更安全有效的方法进行无创产前诊断.
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重度子痫前期母血胎儿有核红细胞水平与红细胞免疫黏附功能的关系
子痫前期(preeclampsia)是妊娠期特有的严重并发症,是影响孕产妇和围产儿发病率和死亡率的主要原因之一.研究发现,子痫前期的发生与胎儿细胞、滋养层细胞、炎性合体滋养层细胞穿透胎盘,向母体输送与释放增加有关[1-3],尤其是目前用于无创性产前诊断的胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBC)的穿透渗漏成为研究热点,报道认为子痫前期孕妇血循环中FNRBC数量增加[4-6].人体内部起免疫功能的细胞主要有红细胞和白细胞,而红细胞清除免疫复合物的作用比普遍认为具有免疫和防御功能的白细胞高.研究认为子痫前期的发生与孕妇自身免疫系统病理损伤和紊乱有关[7-9],目前国内尚未检索到有关该类孕妇母血FNRBC数量变化及其与红细胞免疫黏附功能相关性分析的报道.本研究对此进行了探讨,期望为阐明重度子痫前期发病的可能机制提供依据,现将结果报告如下.
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联合检测母血HbF、AFP值在预测胎母输血综合征中的应用价值
目的:探讨联合检测母血胎儿有核红细胞(HbF)、甲胎蛋白(AFP)值在预测胎母输血综合征中的应用价值.方法:选取2015年5月-2016年11月间本院门诊产检的孕产妇178例,采用KB法检测母血HbF水平,ELISA法检测母血AFP水平,依据分娩后检查结果为标准将所有孕产妇分为综合征组和非综合征组,统计分析所有孕产妇母血HbF、AFP水平及不同方法预测胎母输血综合征发生的情况.结果:本研究分娩结果显示,23例(12.92%)发生胎母输血综合征,综合征组母血HbF、AFP水平明显高于非综合征组,两组比较差异有统计学(P<0.05).ROC曲线分析结果显示,单独检测母血HbF并以>3%为界限预测胎母输血综合征的敏感度、特异度、准确度分别为73.91%、89.68%、87.64%,单独检测母血AFP并以>1000 ng/mL为界限,敏感度、特异度、准确度分别为73.91%、90.97%、88.76%,两者联合检测时,敏感度、特异度、准确度分别为100%、96.77%、97.19%,两者联合检测高于两者单独检测,差异有统计学差异(P<0.05).结论:胎母输血综合征的发生与孕产妇产前母血HbF、AFP水平有关,检测上述因子水平在预测胎母输血综合征中具有良好的敏感性、特异性和准确性,且两者联合检测具有更好的预测效能,有利于指导防治该病.
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胎儿有核红细胞在产前诊断中的应用
根据国外近5年对妊娠妇女外周血中胎儿有核红细胞应用于产前诊断的研究进展.总结胎儿有核红细胞的特点;简述胎儿有核红细胞在妊娠妇女外周血中出现规律及其富集分离方法;重点介绍采用聚合酶链反应和荧光原位杂交技术分析胎儿有核红细胞,以此对胎儿性别、血型及其可能存在的各种疾病,如21三体、13三体、18三体、地中海贫血、杜氏肌营养不良及巨细胞感染等进行诊断,同时可以对病理性妊娠提前筛查:为优生优育和妊娠期健康提供保障.
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胎儿有核红细胞与无创性产前诊断
自妊娠妇女外周血中发现并分离到XY核型的胎儿细胞以来,发现运用母体外周血中胎儿细胞可以进行无创性产前诊断,目前发现妊娠妇女外周血中的胎儿细胞有:胎儿有核红细胞(nucleated red blood cells,NRBCs)、滋养细胞、胎儿淋巴细胞和粒细胞.越来越多的研究发现,胎儿有核细胞,尤其是NRBCs以其独特的细胞学特点倍受关注,就近十年来无创性产前诊断的佳候选细胞--胎儿NRBCs的细胞学特点、富集、分离和鉴定方法、在临床产前诊断中的应用等综述.
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干预AE和NKCC离子通道对有核红细胞富集效果的观察
目的:探讨联合干预阴离子通道(AE)和Na+/K+/2Cl-离子共转运体(NKCC)细胞膜离子通道对富集脐血中有核红细胞(NRBC)的效果.方法:采用AE钙离子抑制剂维拉帕米(verapamil)和NKCC通道活性特异性抑制刺呋噻米(ferosemide)联合干预细胞膜,用流式细胞技术观察脐血中胎儿NRBC的富集效果.结果:流式细胞仪检测NRBC的平均检出率干预前为2.4%,干预后为9.7%(u=3.19,P<0.05),联合干预能提高NRBC的富集率4倍.结论:维拉帕米和呋噻米的干预能有效提升NRBC的富集率.
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显微操作分离ε-血红蛋白阳性的胎儿细胞用于产前诊断
近年来高龄妊娠妇女呈增长趋势.高龄妊娠妇女胎儿染色体畸变的可能性较大,需要做产前遗传学诊断.羊膜腔穿刺、绒毛活检和脐静脉穿刺是传统的创伤性产前诊断方法,许多妇女不愿意接受.现在的非创伤性检查方法包括超声检查和血清学筛查,对发现胎儿非整倍体特异性低,因此从母体外周血中分离胎儿细胞作为非创伤性产前诊断方法就引起了关注.母体外周血中存在各种胎儿细胞,包括胎儿有核红细胞(NRBC)、胎儿滋养细胞和胎儿白细胞等,NRBC被认为是用于研究的佳靶细胞.
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用孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行产前诊断的研究进展
目前对遗传性疾病的产前诊断根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响,可分为侵人性产前诊断和非侵人性产前诊断.前者包括羊膜腔穿刺术、绒毛细胞吸取术及胎儿脐血穿刺等.这些方法因可能伤及胎儿,影响胎儿发育,甚至引起流产.只能在高危妊娠孕妇中实施;后者包括超声、MRI、母血清生化指标检测及孕妇周围血中胎儿细胞的检测,但超声的敏感性太低,而且血清的生化指标检测只能作为一种初筛手段,限制了它们的使用价值.因而利用孕妇外周血中胎儿细胞进行产前基因诊断即成为具潜力的非侵人性产前诊断方法之一.近年来随着分子生物技术的飞速发展,其研究取得了显著进展,亦显示出良好的应用前景.
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孕中期血清筛查联合无创性产前基因在唐氏综合征患儿诊断中的应用
目的:探讨孕中期血清筛查联合无创性产前基因在唐氏综合征患儿诊断中的应用.方法:选择2011年1月至2014年1月来我院产科门诊进行常规产前检查的孕中期孕妇2236例,清晨抽取静脉血进行血清筛查甲胎蛋白(AFP)和游离β-绒毛膜促性腺激素(β-HCC),并用产科筛查软件Multicalc计算唐氏综合症(DS)、18-3体综合症(ES)和神经管缺陷(NTD)患病风险切割值;分选胎儿有核红细胞(FNRBC),并进行基因分型分析,追踪随访孕妇妊娠结局,收集胎儿患病情况.结果:2236例孕妇中筛查出高风险孕妇63例,其中DS高风险36例,ES高风险16例,NTD高风险11例;2173例低风险孕妇的基因均为正常二倍体1:1基因型,36例DS高风险孕妇检出11例三体型基因型,16例ES高风险孕妇检出异常基因型7例,其中3体型4例,嵌合体型2例,易位型1例,11例NTD高风险孕妇均为正常二倍体型;妊娠随访结果11例基因型异常DS高风险孕妇,2例流产,对流产胎儿和活产胎儿进行细胞核分型均确诊为DS;7例基因型异常的ES高风险孕妇,三体型和嵌合体型各出现1例流产,对流产胎儿和活产胎儿进行细胞核分型均确诊为DS,11例NTD高风险孕妇,均正常娩出胎儿,对活产胎儿进行细胞核分型确诊1例NTD,低风险孕妇活产或流产胎儿未检出基因型异常.结论:血清筛查联合无创产前基因诊断操作简便、经济,筛查结果准确可靠,可以用于临床推广.
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胎儿血红蛋白用于分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞的研究
目的研究胎儿血红蛋白(HbF)对单个核细胞的标记情况,并用于孕妇外周血中胎儿有核红细胞(NRBCs)的分选,同时探讨NRBCs的比例与孕周的关系.方法2003-10-2004-04深圳市人民医院选用胎儿特异性抗体HbF对90例正常孕妇外周血、15例未孕妇女和15例胎儿脐血单个核细胞进行标记,并结合流式细胞技术(FACS)对胎儿有核红细胞进行分选.结果孕8~41周的孕妇外周血中HbF阳性标记率为(4.62±3.42)%,与未孕组及胎儿脐血组比较,差异均有极显著性意义(P<0.01).经流式细胞仪分选出的孕妇外周血中的胎儿NRBCs数在孕12~18周、19~23周高,分别为412.4±135.5和454.2±153.4.结论早、中、晚期孕妇外周血中均存在胎儿有核红细胞,单抗HbF可以有效地进行识别,利用该细胞进行无创伤性产前诊断的佳时间宜在妊娠12~23周左右.