首页 > 文献资料
-
珍珠明目滴眼液改善高渗诱导角膜上皮细胞损伤的作用机制研究
目的 探讨珍珠明目滴眼液(ZMED)对高渗诱导人角膜上皮细胞(HCEC)损伤的保护作用及相关机制.方法 采用110 mmol/L氯化钠高渗溶液刺激离体培养的HCEC建立干眼损伤模型,药物组分别给予不同稀释倍数的ZMED;分别采用MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)实验检测ZMED对高渗诱导损伤HCEC的保护作用;采用流式细胞术分析各组细胞凋亡率;采用AO/EB双染法和Hochest荧光染色法观察各组细胞凋亡形态的差异;通过Western blotting法检测Caspase凋亡通路上关键蛋白表达水平的变化.结果 ZMED可以明显增加高渗诱导损伤的HCEC存活率并降低其LDH释放量;ZMED稀释25倍以下作用于高渗诱导HCEC后,细胞凋亡率较模型组明显降低,且凋亡的HCEC数量呈浓度依赖性减少;ZMED给药后剪切态的Caspase-9、Caspase-3、PARP呈浓度依赖性下调.结论 ZMED对110 mmol/L氯化钠高渗溶液诱导损伤的HCEC有明显的保护作用,该作用可能与其抑制线粒体介导的Caspase-9/Casepase-3细胞调亡通路相关.
-
重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子促进人角膜上皮细胞的增殖
背景：重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的制剂临床上已经用于眼表创伤的修复，但是对于使用何种浓度的生长因子就能够大程度的促进愈合以及两种生长因子促进创面愈合的效果比较一直存在争议。
目的：初步观察重组人表皮生长因子、碱性成纤维生长因子对培养的人角膜上皮细胞克隆的影响。
方法：用不同浓度的重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子作用于体外培养的人角膜上皮细胞，应用四甲基偶氮唑盐比色法分别在不同浓度的生长因子作用人角膜上皮细胞3，5，7 d后检测人角膜上皮细胞的增殖能力；平板克隆形成实验法观察细胞克隆形态及计算细胞克隆形成率。
结果与结论：不同质量浓度的重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子分别对人角膜上皮细胞干预5d后，重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在10μg/L质量浓度时MTT值大；质量浓度10μg/L重组人表皮生长因子促进人角膜上皮细胞克隆形成率高于质量浓度10μg/L碱性成纤维生长因子(P=0.02)。结果证实，重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子均能促进人角膜上皮细胞增殖并增加其克隆形成能力。质量浓度10μg/L 重组人表皮生长因子干预5 d促进人角膜上皮细胞克隆形成效果好。 -
重组人表皮生长因子促人角膜缘上皮细胞生长的研究
目的:探讨重组表皮生长因子(rhEGF)对人角膜缘上皮细胞生长的影响.方法:采用rhEGF作用于体外培养的人角膜缘上皮细胞,记录细胞生长曲线,并用四唑氮盐(MTT)法测定细胞增殖状况.结果:rhEGF浓度为10ng/ml时对人角膜缘上皮细胞的促增殖作用强(P<0.05）。MTT法48h的吸光度值实验组均高于对照组（P<0.01）。结论：rhEGF对体外培养人角膜上皮细胞有明显促增生作用.
-
聚乙二醇400对体外培养人角膜上皮细胞生长的影响
目的 研究聚乙二醇400对体外培养人角膜上皮细胞( CECs)生物学特性的影响及其分子机制.方法 制备含0.1％聚乙二醇400的DMEM/F12培养基.采用含0.1％聚乙二醇400培养基培养人CECs,倒置显微镜下观察并照相记录细胞培养24、48、72 h时的形态；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测角膜上皮细胞生长曲线；流式细胞术检测角膜上皮细胞细胞周期；RT-PCR检测角膜上皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)基因表达水平.结果 0.1％聚乙二醇400对角膜上皮细胞的细胞形态无影响,实验组及对照组细胞形态均呈典型的多角形.MTT及流式细胞术检测结果显示,0.1％聚乙二醇400对体外培养人CECs的生长有促进作用(均P＜0.01).0.1％聚乙二醇400培养人CECs后bFGF和EGF的基因表达水平比对照组高(P＜0.05或＜0.01).结论 0.1％聚乙二醇400可能通过缩短人CECs的细胞周期和上调人CECs bFGF、EGF基因的表达,从而加速CECs增殖.
关键词： 聚乙二醇400 人角膜上皮细胞 碱性成纤维细胞生长因子 表皮生长因子 -
A546D突变型TGFBI基因真核表达载体的构建及体外表达
目的 构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体和体外转染体系,为研究野生型及A546D突变型TGFBI基因的功能提供实验基础.方法 应用重叠延伸PCR法定点诱变,构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人角膜上皮(human corneal epithelium,HCE)细胞,Western Blot法检测转染后培养基中HCE细胞分泌的TGFBI蛋白的表达.结果 重组质粒总长约7.5 kb,由HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切鉴定产生5.4 kb和2.1 kb两条片段者为克隆正确质粒.测序鉴定证实了TGFBI基因编码区完整插入到载体pcDNA3.1的多克隆位点中,突变载体的第1685位碱基由C替换为A,使其编码的第546个氨基酸由Ala突变为Asp即A546D突变.野生型及A546D突变型载体转粢入HCE细胞后,TGFBI蛋白有效表达.结论 成功构建了A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,为TGFBI基因相关性角膜营养不良致病机制的研究奠定了基础.
-
一种新的角膜缘干细胞分选方法
目的 用平板离心法建立一种新的角膜缘干细胞分选方法.方法 用人角膜缘组织块培养法培养出角膜上皮细胞,收获细胞后用转速1400 r·min-1和1800 r·min-1分别将细胞用平板离心法于未包被的六孔板上进行分选.ATC1为1400 r·min-1贴壁的细胞,ATC2为1800 r·min-1贴壁的细胞,NAC为1800 r·min-1离心力作用下漂浮而不能贴壁的细胞.分选出的三群细胞采用免疫组织化学、克隆形成实验、Ki67流式细胞仪进行分析.结果 细胞计数显示用转速1400 r·min-1筛选出的ATC1占总体细胞量的(11.32±2.46)％.在离心速度为1800 r·min-1时,筛选出ATC2为(18.55±2.79)％,而NAC则为(68.29±4.07)％.ATC1表达角膜缘干细胞标志ABCG2、p63,而不表达角膜上皮细胞分化标志K3.ATC2较少表达ABCG2和p63,大部分表达K3.NAC则不表达ABCG2、p63,而几乎完全表达K3.在这三群细胞中ATC1细胞群具有强的细胞增殖活性,其克隆形成率和Ki67阳性细胞检测率分别为(3.90±0.17)％和(56.78±2.39)％.ATC2克隆形成率和Ki67阳性细胞检测率分别为(2.48±0.19)％和(9.67±1.88)％.NAC克隆形成率和Ki67阳性细胞检测率分别为(0.84±0.89)％和(4.76±0.57)％.结论 平板离心法是一种新的角膜缘干细胞的分选方法.ATC1、ATC2和NAC可能分别为角膜缘干细胞、短暂扩充细胞和终末分化细胞.
-
人角膜上皮细胞体外培养的研究进展
角膜上皮细胞位于角膜外表面,人角膜上皮细胞体外培养有助于充分了解角膜细胞的生物学特性、构建体外疾病模型以及更好地发挥其临床作用.我们就近年来关于人角膜上皮细胞体外培养提取部位,提取方法,培养基、细胞因子与底物以及鉴别方法研究进展进行综述.
-
强力霉素对人角膜上皮细胞FasL表达的影响
目的 观察正常人角膜FasL蛋白的表达情况,评价人角膜上皮细胞FasL蛋白对强力霉素反应的表达特性.方法 使用免疫组织化学染色观察正常人角膜上皮FasL的表达;用组织块培养法培养人角膜上皮细胞,将得到的细胞随机分为两组,一组使用含200 μg/ml强力霉素的培养液,另一组不含强力霉素,分别再培养24 h.运用流式细胞技术测定24 h后FasL的表达情况.结果 FasL在正常人角膜上皮细胞中呈阳性表达;经强力霉素干预的角膜上皮细胞FasL的表达高于未经强力霉素干预的角膜上皮细胞(P＜0.01).结论 正常人角膜上皮细胞有FasL的表达;强力霉素可使体外培养的人角膜上皮细胞FasL的表达增高,有望降低临床角膜上皮细胞移植后的免疫排斥反应.
-
高渗透压对人角膜上皮细胞MMP-9的上调作用
目的评价人上皮细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)对高渗透压反应的表达特性.方法在正常渗透压的培养液中培养人角膜上皮细胞,然后在4组细胞培养液中分别加入40、60、80和100 mmol/L的NaCl,使培养液渗透压达到400～500 mOsm,运用酶图法和ELISA法测定加入高渗剂24 h后的培养液中MMP-9的质量浓度.结果不同渗透压组MMP-9的质量浓度有显著差异,培养液渗透压越高,MMP-9的质量浓度也就越高.结论高渗透压反应性刺激人角膜上皮细胞MMP-9的表达和产物.证实了眼表高渗透压是干眼症导致眼表面炎症的发病机制.
-
Toll样受体在眼部各组织中的表达及其作用
Toll样受体是新近发现的一类广泛存在于植物、昆虫和哺乳动物体内的与跨膜信号转导有关的受体,在进化上具有高度保守性.研究揭示了其在机体免疫特别是抗感染免疫中有重要作用.越来越多的研究已经发现人眼角膜细胞、巩膜、结膜、葡萄膜、视网膜、虹膜内皮细胞、睫状体等都能表达Toll样受体,而且与眼部的免疫和炎症反应密切相关.Toll样受体的发现为深入研究眼部感染性疾病的发病机制及临床治疗开辟了更为广阔前景.
-
普拉洛芬滴眼液原研药与仿制药眼表细胞毒性差异的研究
目的 比较普拉洛芬滴眼液原研药与仿制药对人角膜上皮细胞(HCEC)的毒性差异.方法 常规培养HCEC,分别在培养液中添加按1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000稀释的滴眼液,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组药物处理后HCEC的存活率,采用线性回归分析滴眼液浓度与细胞存活率的相关性;分别在培养液中添加不同浓度的苯扎氯铵(BAK),采用MTT法检测BAK处理后HCEC的存活率,采用非线性回归分析BAK浓度与细胞存活率的相关性.结果 普拉洛芬滴眼液原研药与仿制药对HCEC存活率的影响均存在剂量依赖性(原研药r=0.893,P＜0.05;仿制药r=0.888,P＜0.05),两组药物相同浓度、相同时间下对HCEC存活率的影响差异无统计学意义(P＞0.05);BAK对HCEC存活率的影响具有剂量依赖性(r2=0.951,P＜0.05).结论 普拉洛芬滴眼液降低HCEC存活率,具有细胞毒性,原研药与仿制药对HCEC毒性的差异无统计学意义(P＞0.05).
-
Wnt1蛋白对人角膜上皮细胞Cyclin D1蛋白表达的影响及意义
目的:探讨Wnt1蛋白对人角膜上皮细胞Cyclin D1蛋白表达的影响及其相关分子机制.方法:人角膜上皮细胞经复苏、培养,连续传代2次后共培养12个T25细胞培养瓶,4个培养瓶一组,共3组,分别加入25 ng/mL的重组人Wnt1蛋白和50 ng/mL的重组人Wnt1蛋白,一组不加入重组人Wnt1蛋白作为对照,于不同时间点(6、24、48和72 h)各取一个T25培养瓶的细胞,计算各组角膜上皮细胞总数并采用Western blot方法检测角膜上皮细胞中Cyclin D1蛋白的表达情况.结果:对照组Cyclin D1蛋白的表达在0~48 h内随着时间的延长呈现逐步降低的趋势,在48 h达到低状态,在72 h有所提高.加入Wnt1后6 h,25 ng/mL组未检测到Cyclin D1蛋白表达,50 ng/mL组Cyclin D1蛋白表达有所提高.在24,48和72 h时间点,25 ng/mL组和50 ng/mL组Cyclin D1蛋白表达均提高,48 h达到高峰,72 h有所回落.添加Wnt1后与对照组比较,25 ng/mL组及50 ng/mL组角膜上皮细胞生长速度均加快,但在6、24及48 h时间点差异无显著性,在72 h差异有显著性.结论:Wnt1蛋白的刺激可在一定时间范围内增强人角膜上皮细胞Cy-clin D1的表达,且与Wnt1蛋白量呈正相关.Cyclin D1的表达强弱,在角膜上皮损伤修复及其细胞增殖分化过程中可能起重要作用.
-
龟分枝杆菌脂葡聚糖对人角膜上皮细胞IL-8和IL-6表达的影响及其信号转导通路
目的:研究龟分枝杆菌细菌壁内脂葡聚糖对人角膜上皮细胞IL-6和IL-8表达的影响及其可能信号转导通路.方法:提取龟分枝杆菌细菌壁内脂葡聚糖作用于原代培养人角膜上皮细胞(human corneal epithelia,HCE).实验分为实验组(脂葡聚糖样品处理组)、阳性对照组(LPS处理组)和空白组.脂葡聚糖处理后的0,6,12h各时间点采用RT-PCR法在mRNA水平检测实验组中IL-6和IL-8的表达水平;脂葡聚糖处理后的0,6,12,24h各时间点采用ELISA法在蛋白水平检测实验组、阳性对照组和空白组中IL-6和IL-8的表达.免疫细胞化学法检测空白组与实验组(时间点24h)HCE细胞内NF-κB的表达与定位.结果:实验组中,12h内IL-6和IL-8在mRNA水平明显增加,6h时即达到峰值(IL-6是空白组的32.7倍,IL-8是对照组的36.8倍);在蛋白质水平,培养上清内IL-6和IL-8含量在24h内呈现时间依赖性上升(6,12,24h各时间点与对照组之间均有统计学差异,P＜0.05),与阳性对照组变化一致.空白组NF-κB定位于细胞浆内,实验组NF-κB被激活,移位至细胞核内.结论:龟分枝杆菌来源的脂葡聚糖可以促使人角膜上皮细胞过表达IL-6和IL-8,其信号转导通路可能是通过核转录因子NF-κB进行的.
