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NADPH氧化酶NOX1、NOX2和DUOX2在溃疡性结肠炎中的表达分析
目的 探讨NADPH氧化酶家族(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases,NOXs)的主要成员NOX1、NOX2和双氧化物酶(dual oxidase,DUOX)2 (人:NOX1、NOX2和DUOX2;小鼠:Nox1、Nox2 和Duox2)在人炎症性肠病和小鼠肠炎模型结肠中的表达.方法 人结肠标本选自于通过结肠镜活检或手术切除的炎症性肠病组织及距离病变组织边缘5 cm以上正常组织;同时选用8~10周龄的C57BL/6雌性小鼠建立结肠炎模型,采用掷硬币法将其随机分为对照组和慢性肠炎组,慢性肠炎组先自由饮用1.0%(质量分数)葡聚糖硫酸钠7 d,然后自由饮水14 d,循环3次;通过体质量变化和HE染色方法评估肠道炎性反应程度.采用实时定量PCR技术和免疫组织化学方法分别检测结肠组织中NOX1、NOX2及DUOX2 mRNA和蛋白表达情况,并分析在人炎症性肠病中三者表达情况与临床特征之间的关系.结果 NOX1、NOX2和DUOX2 mRNA在人炎症性肠病结肠组织中的表达量均显著高于自身正常对照组织,分别增高2.8、2.0和3.3倍(P均<0.01);与人不同,Nox1和Duox2 mRNA在小鼠慢性肠炎结肠组织中的表达量差异无统计学意义,Nox2 mRNA增加2.4倍 (P<0.01).Nox1蛋白在正常结肠上皮细胞刷状缘和胞质中表达;Nox2蛋白主要表达于浸润的吞噬细胞和中性粒细胞;Duox2蛋白在正常结肠黏膜组织中低表达;三者在人炎症性肠病结肠组织中表达均上调(均P<0.01);在小鼠慢性肠炎模型中,Nox2和Duox2蛋白上调(均P<0.01),而Nox1无变化.除了NOX2 mRNA在男性病人表达高于女性病人外,未发现这些氧化酶与病人临床特征之间有关联.结论 NOX1、NOX2和DUOX2不但在维持机体正常生理功能过程中发挥重要作用,而且在炎症性肠病初期阶段的发病中也起一定的作用.
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重组Nox1在NIH3T3细胞中的表达及其对活性氧的影响
目的构建Nox1的真核表达载体,探讨其在NIH3T3细胞中表达后对活性氧水平和药物细胞毒易感性的影响.方法构建携带Nox1基因的真核表达载体pcDNA3 Nox1,并将其转染NIH3T3细胞,采用RT PCR方法检测Nox1在mRNA水平上的表达,检测细胞活性氧和细胞活力.结果RT PCR显示转染后的NIH3T3细胞可以有效地转录Nox1 mRNA,细胞中的活性氧水平明显升高,同时对As2O3细胞毒作用更加敏感.结论含有Nox1 cDNA的重组质粒pcDNA3 Nox1转染细胞后可有效表达Nox1,使活性氧水平升高,并因此增加细胞对药物细胞毒的敏感性.
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NOX1和NOX4在小鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用
目的 探讨NOX1和NOX4在小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发病中的作用.方法 给予C57BL小鼠高脂饮食及脂多糖建立非酒精性脂肪肝模型,同时设立正常饮食组作为对照.观察各组小鼠血清ALT、AST值,HE染色评定脂肪性肝炎程度,实时荧光定量反转录-聚合酶链反应检测NOX1、NOX4 mRNA的表达水平.结果 非酒精性脂肪性肝炎模型建立成功,NASH模型组小鼠ALT、AST及肝指数明显高于高脂(HF)组(P＜0.05),HF组NOX1、NOX4mRNA表达高于正常对照组(P＜0.05),NASH组的NOX1、NOX4mRNA表达明显高于正常对照组和HF组(P＜0.01).结论 本实验初步认为,NOX1和NOX4参与胰岛素抵抗的形成,可能是影响NASH发生和发展的重要因素.
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NOX1 siRNA 对 TNF-α诱导的 A549细胞凋亡的影响
目的：探讨NOX1对TNF-α诱导的A549细胞凋亡的影响。方法：将A549细胞分为3组，空白组、TNF-α组和TNF-α＋NOX1 siRNA组。 TNF-α＋NOX1 siRNA组细胞采用瞬时转染技术转染特异性NOX1 siRNA，转染12 h后用含TNF-α（10μg／L）的培养基继续培养；空白组和TNF-α组细胞分别用培养基和含TNF-α的培养基培养。48 h后，采用Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡率，DCFH荧光标记法检测细胞中ROS的表达量，Western blot法检测NOX1及p-JNK蛋白的表达水平。结果：与空白组相比， TNF-α组细胞凋亡率和ROS表达量升高（ P＜0．05），NOX1和p-JNK蛋白表达水平升高（ P＜0．05）；与TNF-α组比较，TNF-α＋NOX1 siRNA组细胞凋亡率和ROS表达量降低（P＜0．05），细胞中NOX1和p-JNK蛋白表达水平也降低（P＜0．05）。结论：NOX1可能通过增加ROS的表达，进而激活JNK／MAPK信号通路，引起A549细胞的凋亡。
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沉默NOX1表达对A549细胞增殖的影响
目的:探讨NOX1对肺癌A549细胞凋亡和增殖的影响.方法:通过瞬时转染技术转染特异性的NOX1小干扰RNA(siRNA),按转染情况分为Mock组、NC组、FAM-NC-NOX1 siRNA组,转染12 h后采用Western blot检测NOX1蛋白的表达,通过荧光探针DCFH-DA检测细胞ROS水平,流式细胞仪检测细胞增殖活性和凋亡率.结果:siRNA转染12h以上,转染率稳定在80％以上,NOX1蛋白的表达量与Mock组相比下降(P＜0.05);与Mock组相比,FAM-NC-NOX1 siRNA组细胞在24、36、48 h的增殖活性均下降,ROS水平也下降(P＜0.05).结论:NOX1siRNA转染A549细胞能有效抑制细胞的增殖.
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连理汤调控溃疡性结肠炎NADPH氧化酶Nox1和Duox2表达临床研究
[目的]观察治疗前、后溃疡性结肠炎患者NADPH氧化酶Nox1和Duox2表达变化,探讨连理汤干预溃疡性结肠炎的机制研究.[方法]60例符合诊断标准、纳入标准、排除标准的溃疡性结肠炎患者,按就诊顺序随机分为2组,对照组30例,予美沙拉嗪治疗12周,治疗组30例,予连理汤治疗12周,记录患者治疗前后主要症状变化,应用实时荧光定量PCR技术检测治疗前、后NADPH氧化酶Nox1和Duox2表达变化.[结果]全部病例完成临床观察,治疗组总有效率为83.33％.对照组总有效率为86.67％,2组治疗后患者主要症状较治疗前明显改善,2组患者治疗前NADPH氧化酶Nox1和Duox2 mRNA表达呈上升趋势;治疗后NADPH氧化酶Nox1和Duox2 mR-NA表达呈下降趋势,2组治疗前后比较差异有统计学意义(P＜0.05),2组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]连理汤可能通过阻断NADPH氧化酶Nox1和Duox2的表达,抑制炎症因子激活,发挥治疗溃疡性结肠炎的效用.
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Nox1基因启动子表达载体的构建
目的 克隆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nox)上游启动子序列,为研究Nox1基因的转录调控奠定基础.方法 以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得1 415 bp(-1415～0)、1 276 bp(-1415～-140)、997 bp(-1415～-419)、839 bp(-1415～-577)、470 bp(-1415～-946)大小的Nox1启动子片段,将其定向克隆人pGL3-Basic荧光素酶表达载体,构建荧光素酶报告基因载体,进行真核细胞转染后鉴定目的片段启动子活性.结果 在A549细胞中,各Nox1启动子片段均有活性；-140～-419 bp和-577～-946 bp区域可能存在Nox1启动子核心区域.结论 成功克隆了在肺泡上皮样细胞中具有活性的Nox1启动子序列,为进一步研究Nox1基因的转录调控机制奠定了基础.
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P38MAPK、Nox1及ROSmRNA在早发型重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义
目的 探讨Nox1、P38MAPK及ROS mRNA表达与早发型重度子痫前期发病的关系,揭示早发型重度子痫前期发病基础,为临床治疗提供理论依据.方法 选择早发型重度子痫前期患者32例、晚发型重度子痫前期患者30例为研究组,35例正常分娩者为对照组.胎盘娩出后立即于脐带附着处母体面,避开钙化出血梗塞区(肉眼观)剪取大小为1 cm×1 cm×1 cm的组织两块,一份用无菌生理盐水(含0.1％ DEPC水)漂洗,去除血液,置于经DEPC水处理并消毒的冻存管中,于-80℃冰箱保存待行RT-PCR检测;另一份取材后即以4％多聚甲醛固定,常规脱水,浸蜡,包埋,4um切片(每例5张),载玻片经清洁处理,APES包被,进行HE染色及脂肪特染观察胎盘组织的脂肪浸润情况和形态学改变;采用RT-PCR及免疫组化方法检测胎盘组织中Nox1、P38 MAPK、ROSmPNA表达水平.结果 各组胎盘组织的合体滋养细胞、血管内皮细胞、蜕膜细胞中均可以检测到Nox1、P38MAPKmRNA及ROS表达.早发型重度子痫前期组Nox1 mRNA表达显著高于晚发型重度子痫前期组及对照组(0.712±0.012,0.215±0.013,0.113±0.01,p＜0.01);早发型重度子痫前期组ROSmRNA水平显著高于晚发型重度前期组及对照组(142.43±11.81,96.12±8.93,102.21±9.75,p＜0.01);早发型重度子痫前期组P38MAPKmRNA表达水平显著高于晚发型重度前期组及对照组(0.109±0.057,0.074±0.074,0.042±0.013,p＜0.01).各组胎盘组织中Nox1表达与ROS水平呈正相关(r=0.81,p ＜0.05);各组胎盘组织中Nox1表达与P38MAPKmRNA呈正关(r=0.63,p＜0.01).结论 早发型重度子痫前期组胎盘中Nox1 mRNA高表达与其发病及发展密切相关.P38MAPK介导的P38MAPK-Nox1-ROS脂质代谢途径可能在早发型重度子痫前期发生发展中起重要作用.
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A549细胞炎症氧化应激模型Nox1启动子差异结合蛋白的筛选
目的 在炎症氧化应激细胞模型中筛选参与Nox1启动子活化的相关调控蛋白.方法 TNF-α激A549细胞建立炎症氧化应激细胞模型,运用DNA pull-down技术筛选出Nox1启动子区结合蛋白,再用二维凝胶电泳技术分离pull-down后的结合蛋白,然后在2D凝胶上选取与对照组表达差异大于1.5倍的蛋白质点进行切胶,后经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,筛选出Nox1启动子区差异结合蛋白.结果 2D凝胶上共筛选出1.5倍以上差异蛋白点7个,均为表达上调蛋白,鉴定出GLE1 、DDX19A,KRT1、KRT10四种蛋白质.结论 GLE1、DDX 19A,KRT1、KRT10参与了TNF-α诱导的A549细胞Nox1活化的基因调控,为研究炎症氧化应激细胞模型的Nox1启动子区调控蛋白的生物学功能奠定了实验基础.
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NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立
目的:对炎症细胞因子TNF-α及IFN-γ刺激下,人NOX1基因的表达调控进行初步分析.方法:将NOX1基因5'-端上游序列连接到无启动子的PGL3-BASIC质粒,构建了PGL3-BASIC/NOX1报告质粒.PGL3-BASIC/NOX1质粒转染A549细胞,用TNF-α刺激12h,双荧光素酶报告基因系统检测基因表达情况.结果:克隆的NOX1片段具有较强的启动子活性,在TNF-α和IFN-γ共同刺激下,转染报告基因的A549细胞萤光素酶活性与对照相比有明显的增高(约4.3倍).分析显示NOX1基因5'-端上游序列片段含有NF-κB结合位点,提示细胞因子刺激的荧光素酶表达增强可能与NF-κB位点激活相关.结论:NOX1基因表达水平明显受到炎症细胞因子的调控,提示该基因可能参与机体免疫防御(特别是上皮细胞免疫防御),值得进行深入研究.
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AngⅡ通过ATF-1通路诱导NOX1高表达
目的:探讨激活转录因子(ATF1)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)中NOX1基因表达增加的作用.方法:体外培养大鼠主动脉VSMCs,用荧光实时定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR)检测NOX1基因表达的量,Western Blot检测ATF-1蛋白在AngⅡ的刺激是否引起NOX1基因的高表达并用RNA干扰(RNAi)技术转染VSMCs使ATF-1基因沉默来观察NOX1的表达.结果:AngⅡ能够诱导NOX1基因的表达增加以及增强ATF-1的磷酸化及活性,ATF1基因沉默反过来可抑制AngⅡ诱导的NOX1基因表达的增加.结论:在大鼠的VSMCs中,ATF-1是介导NOX1基因表达的一个必须的转录因子.
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线粒体介导血管紧张素Ⅱ诱导NOX1基因表达的增加
目的:探讨在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)NOX1基因表达增加中线粒体所起的作用.方法:体外培养大鼠主动脉VSMCs,用线粒体呼吸链的抑制剂阻断线粒体的作用,用荧光实时定量PCR检测NOX1基因表达的量.结果:AngⅡ能够诱导NOX1基因的表达增加,线粒体呼吸链的抑制剂能够抑制上述这一作用.结论:在大鼠的VSMCs中,AngⅡ诱导NOX1的增加通过线粒体呼吸的作用.
