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疏利少阳法对HBV诱导HK-2细胞转分化pSmad3蛋白表达的影响
目的 观察疏利少阳法代表方肾疏宁对乙型肝炎病毒(HBV)诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)细胞转分化pSmad3蛋白表达的影响,以探讨该方治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)的相关机制.方法 应用MTT法确定肾疏宁的体外给药浓度,设9组浓度梯度,在酶标仪OD570 nm处测量各孔的吸光值,并计算细胞存活率,根据绘制的生长曲线,计算半数抑制率(IC50),IC50对应的浓度即为下一步实验给药的浓度.分别用C基因型重组乙型肝炎病毒质粒pHY106-HBV及重组人生长转化因子-β1(TGF-β1)刺激剂干预HK-2细胞,实验分为6组:空白对照组(HK-2细胞常规培养),空质粒组(转染空质粒pHY106的HK-2细胞),HBV组(转染pHY106-HBV的HK-2细胞),TGF-β1组(HK-2细胞中加入12 ng重组人TGF-β1),HBV+肾疏宁组(HK-2细胞在转染pHY106-HBV后6 h加入肾疏宁),TGF-β1+肾疏宁组(HK-2细胞在重组人TGF-β1刺激6 h后加入肾疏宁).药物干预48 h后,用Westernblot检测方法检测pSmad3的表达量.结果 根据细胞存活率绘制的细胞生长曲线,计算IC50值为生药浓度1.313 g/mL按1/200稀释的加药浓度.Westernblot法检测各组pSmad3蛋白的表达,HBV组与空质粒组比较pSmad3蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1组与空白对照组比较pSmad3蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);HBV+肾疏宁组与HBV组比较pSmad3蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1+肾疏宁组与TGF-β1组比较pSmad3蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在生药浓度1.313 g/mL按1/200稀释的加药浓度下,肾疏宁能降低pSmad3蛋白表达,进而推测其可通过抑制Smad介导的信号转导通路而干预HK-2细胞转分化.
关键词： 疏利少阳 肾疏宁 乙型肝炎病毒相关性肾炎 HK-2细胞 pSmad3 -
肾疏宁对肾小球硬化大鼠肾小球系膜细胞表型转化的作用
目的 观察中成药复方肾疏宁对肾小球硬化模型大鼠肾小球系膜细胞表型转化的作用,探讨肾疏宁防治肾小球硬化的作用机制.方法 采用单侧肾切除并阿霉素尾静脉注射的方法建立大鼠肾小球硬化模型.用数字表法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、模型组+肾疏宁治疗组和模型组+苯那普利治疗组,共观察8周.用免疫组织化学染色法观察大鼠肾小球内α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达,用病理图像分析软件检测肾小球内α-SMA 和TGF-β1染色阳性面积/肾小球毛细血管襻面积的改变.同时观察肾疏宁对肾小球硬化大鼠体质量、尿蛋白、血白蛋白、尿素氮、肌酐的影响.结果 假手术组大鼠肾小球内未见α-SMA表达,可见TGF-β1少量表达;模型组大鼠肾小球内α-SMA 和TGF-β1显著表达,与假手术组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);血白蛋白、总蛋白明显降低,与假手术组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);尿蛋白、血尿素氮、肌酐明显升高,与假手术组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).肾疏宁治疗组和苯那普利治疗组24 h尿蛋白排泄量、血尿素氮、肌酐明显降低,与模型组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).肾小球内α-SMA阳性面积/肾小球毛细血管襻面积和TGF-β1阳性面积/肾小球毛细血管襻面积显著减少,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01).相关性分析显示α-SMA和TGF-β1呈显著正相关(r=0.637,P＜0.01).结论 肾疏宁可抑制肾小球系膜细胞表型转化,减少肾小球内固有细胞α-SMA和TGF-β1的表达,降低24h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐,可能是防治肾小球硬化的部分作用机制.
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系膜增生性肾炎肾小管间质损害模型的建立及肾疏宁的保护作用
[目的]建立一种新的系膜增生性肾炎肾小管间质损害模型,并观察肾疏宁的保护作用.[方法]在系膜增生性肾炎(MsPGN)模型基础上,延长造模时间至12～16周,使其自然发展成肾小管间质损害模型,观察肾疏宁对进展性肾小管间质损害的保护作用,并设苯那普利为阳性对照组.[结果]随着造模时间的延长,模型组肾小管间质损害逐渐加重,肾疏宁及苯那普利组损伤程度明显减轻.[结论]系膜增生性肾炎中肾小管间质损害模型成功,中药肾疏宁对肾小管间质损害具有明显的保护作用.
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肾小管间质损害相关因素及肾疏宁作用机制的研究
系膜增生性肾炎(MsPGN)是原发性肾小球疾病中常见的病理类型,约占我国肾穿病理诊断的50%左右.课题组经过多年研究,发现本病属本虚标实之证,脾肾两虚是其发病的内在因素,湿热毒瘀是其迁延不愈的病理基础,而少阳三焦枢机不利是其发病的关键,因此,提出以疏利少阳为主,融益气养阴、清热利湿、活血解毒为一体的治疗大法,取得了良好的临床疗效.
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中药肾疏宁对肾小球硬化影响的实验研究
"疏利少阳标本兼治"法是课题组在对中医传统理论深刻理解的基础上,结合多年的肾病治疗经验,针对慢性肾炎"本虚标实"的基本病机提出的独特的治疗方法.
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肾疏宁对肾小管间质损害大鼠表型转化的影响
目的:观察肾疏宁对肾小管间质损害大鼠表型转化的影响.方法:在系膜增生性肾炎模型基础上,延长造模时间至12～16周,使其自然发展成肾小管间质损害模型,观察肾疏宁对肾小管间质α-SMA、PCNA、CD68蛋白表达的影响,并设苯那普利为阳性对照组.结果:12～16周末,造模各组肾小管间质α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、增殖细胞核抗原(PCNA)、CD68蛋白表达量均明显高于正常组(P＜0.05或P＜0.01).第12周末,治疗组均能降低肾小管间质α-SMA、CD68表达量(均P＜0.01),但对肾小管PCNA表达量影响不明显,而对间质PCNA表达量具有明显的降低作用(均P＜0.01).第16周末,肾疏宁组明显优于苯那普利组(均P＜0.01).结论:肾疏宁对肾小管间质损害具有明显的保护作用,其机制可能是通过抑制炎细胞浸润,抑制间质细胞的增殖,逆转肾小管间质的表型转化而实现的.
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肾疏宁的组方思路及防治肾小球硬化的机制分析
通过对中医药防治肾小球硬化的研究发现,肾小球硬化是本虚标实证.采用补虚固本、清热解毒、利湿活血泄浊方法,运用通腑降浊、清热利湿、补脾益肾等措施,保护肾功能,有利于受损肾的恢复.
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MTT检测肾疏宁含药血清对大鼠腹膜间皮细胞的作用
目的:以获取肾疏宁含药血清干预大鼠腹膜间皮细胞的佳药物剂量及时间.方法:采用胰酶消化的方式体外培养大鼠腹膜间皮细胞鉴定成功后分组(空白血清组、不含药大鼠血清组、肾疏宁低剂量组、肾疏宁中剂量组、肾疏宁高剂量组)后采用MTT检测方法检测肾疏宁含药血清对大鼠腹膜间皮细胞的作用.结果:含药血清低、中、高剂量组两两比较差异有统计学意义(P＜0.001);肾疏宁含药血清是细胞OD值的影响因素;空白血清组、不含药大鼠血清组与肾疏宁低剂量组两两比较差异无统计学意义(P＞0.05);不同作用时间的(P＜0.001),故认为不同作用时间也是OD值的影响因素.12 h与24 h时间段比较,差异有统计学意义(P＜0.01);12 h与36 h时间段比较,差异有统计学意义(P＜0.01);24 h与36 h时间段两两比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:肾疏宁含药血清作用于大鼠腹膜间皮细胞后,MTT检测其OD值,剂量组以肾疏宁中剂量组有意义,作用时间以24 h有意义.
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肾疏宁对肾小管间质损害大鼠FN、ColⅢ、PAI-1 mRNA的作用
目的:观察肾疏宁对肾小管间质损害大鼠FN、ColⅢ、PAI-1mRNA表达的影响.方法:在系膜增生性肾炎(MsPGN)模型基础上,延长造模时间至12～16周,使其自然发展成肾小管间质损害模型,观察肾疏宁对肾小管间质FN、ColⅢ、PAI-1mRNA表达的影响,并设苯那普利为阳性对照组.结果:第12～16周末,造模各组肾小管间质FN、ColⅢ、PAI-1 mRNA表达量均明显升高(P＜0.05或P＜0.01),肾疏宁组、苯那普利组均显著低于模型组(P＜0.05或P＜0.01),第12周末,肾疏宁组与苯那普利组比较无统计学差异(P＞0.05),而第16周末,肾疏宁组明显低于苯那普利组(P＜0.01).结论:肾疏宁能抑制细胞外基质的合成,促进其降解,从而保护肾小管间质损害.
关键词： 肾小管间质损害 肾疏宁 纤维连接蛋白 Ⅲ型胶原 纤溶酶原激活物抑制剂1 -
肾疏宁对体外培养大鼠腹膜间皮细胞AQP1表达的影响
目的:探讨肾疏宁对体外培养大鼠腹膜间皮细胞水通道蛋白1表达的影响.方法:原代培养大鼠腹膜间皮细胞、鉴定后传至第3代后分为5组:空白血清组、1.5%腹膜透析液组、4.25%腹膜透析液组、1.5%腹膜透析液+肾疏宁含药血清组、4.25%腹膜透析液+肾疏宁含药血清组.分别采用ELISA酶联免疫法、荧光定量PCR检测水通道蛋白1的表达.结果:1.5%PDS组、4.25%PDS组、1.5PDS%+肾疏宁含药血清组、4.25% PDS+肾疏宁含药血清组各组均与空白血清组比较AQP1表达指数均增高(P＜0.05).结论:证明肾疏宁含药血清有上调体外培养大鼠腹膜间皮细胞上水通道蛋白1的表达的作用.
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肾疏宁对大鼠系膜增生性肾炎的肾小管间质损害的形态学影响
目的:观察中药肾疏宁对系膜增生性肾炎(MsPGN)的肾小管间质损伤的影响.方法:制作大鼠MsPGN模型.予肾疏宁治疗并以肾炎康复片为对照组,观察肾脏形态学及 24 h尿蛋白定量.结果:肾疏宁能明显减轻MsPGN大鼠的蛋白尿,减轻肾组织病理病变尤其是肾小管间质损伤,且对损伤的肾组织有修复作用.与模型组相比,有显著性差异(P＜0.01),与肾炎康复片组相比,有显著性差异(P＜0.05);与正常组相比,无显著性差异(P＞0.05).结论:肾疏宁能降低尿蛋白、保护肾功能、减轻MsPGN的肾小球病变及肾小管间质损伤.
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肾小球硬化中肾小管间质细胞表型转化及肾疏宁的干预作用
目的:探讨肾小球硬化大鼠肾小管上皮细胞及间质成纤维细胞的表型转化情况及中药复方肾疏宁的作用.方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、模型组+肾疏宁治疗组、模型组+苯那普利治疗组.采用单侧肾切除并阿霉素尾静脉注射的方法建立大鼠肾小球硬化模型,8周末光镜及透射电镜观察肾组织病理,免疫组织化学染色法观察大鼠肾小管上皮细胞及间质成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和转化生长因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)表达情况,用计算机病理图像分析软件检测肾小管间质α-SMA和TGF-β1染色阳性相对面积,和肾间质纤维化相对面积.同时观察肾疏宁对肾小球硬化大鼠体重、尿蛋白、血总蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐的影响.结果:假手术组大鼠肾小管间质α-SMA少量表达,TGF-β1微量表达,肾小球硬化模型组大鼠肾小管间质α-SMA明显阳性表达(P<0.01),TGF-β1显著阳性表达(P<0.01),肾小管间距加宽,肾间质纤维化和大量淋巴细胞和单核细胞浸润,血白蛋白、总蛋白明显降低(P<0.01),尿蛋白、血尿素氮、肌酐明显升高(P<0.01),肾疏宁治疗组和苯那普利治疗组24 h尿蛋白排泄量、血尿素氮、肌酐明显降低(P<0.01),肾小管间质α-SMA阳性相对面积、TGF-β1阳性相对面积以及间质纤维化相对面积较模型组显著减少(P<0.01),其相关性分析显示α-SMA和TGF-β1、α-SMA和间质纤维化分别呈显著正相关(r=0.484,P<0.01;r=0.690,P<0.01).结论:肾小球硬化模型大鼠肾小管上皮细胞和肾间质成纤维细胞均发生了表型转化.肾疏宁和血管紧张素转换酶抑制剂苯那普利均可明显抑制肾小球硬化大鼠肾小管间质细胞转分化和TGF-β1的表达,减少肾组织纤维化,有效防治肾小球硬化的进展.肾疏宁在降低24 h尿蛋白方面优于苯那普利,但无统计学差异(P>0.05).肾疏宁是防治肾小球硬化的有效措施.
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肾疏宁抑制腹膜透析腹膜纤维化大鼠基质及新生血管的实验研究
目的:观察中药肾疏宁对腹膜纤维化大鼠腹膜功能、腹膜组织基质积聚、新生血管、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)及骨形态蛋白-7(BMP-7)表达的影响.方法:腹膜透析液+阿霉素注射法诱发SD大鼠腹膜透析腹膜纤维化模型,依体重随机分为4组,1.5%腹膜透析液模型组、4.25%腹膜透析液模型组、1.5%腹膜透析液+肾疏宁干预组及4.25%腹膜透析液+肾疏宁干预组,每组各15只,另设空白对照组(对照组,15只).1.5%腹膜透析液+肾疏宁干预组及4.25%腹膜透析液+肾疏宁干预组予肾疏宁(按43.93 g·kg-1·d-1)灌胃,对照组和模型组予等量生理盐水灌胃.检测腹透液葡萄糖浓度,计算超滤量(UF)及葡萄糖转运量(MGT).观察腹膜病理形态学改变,分析腹膜厚度、腹膜血管计数、腹膜纤维连接蛋白(FN)及CTGF、VEGF、HGF、BMP-7表达.结果:治疗第6周末,1.5%腹膜透析液+肾疏宁干预组及4.25%腹膜透析液+肾疏宁干预组腹膜透析腹膜纤维化大鼠超滤量(-3.26±14.17) ml及(-2.04±10.74) ml、葡萄糖转运量(18.12±0.81) mmol/kg及(16.14±1.20) mmol/kg、腹膜厚度(74.68±15.33) μm及(211.75±58.23) μm、腹膜血管计数(8.21±2.66)个/mm2及(13.70±4.71)个/mm2、FN(152.47±36.94)%及(231.49±53.49)%、CTGF(708.67±127.22)%及(791.20±126.37) %、VEGF(0.42±0.08)%及(0.50±0.09)%、HGF(245.71±24.38)%及(222.05±23.43)%、BMP-7(351.27±31.99)%及(284.43±26.82)%,与同浓度透析液组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论:肾疏宁可能通过调控CTGF、VEGF、HGF、BMP-7表达,阻抑基质过度积聚及新生血管生成,进而延缓腹膜透析大鼠腹膜纤维化进展.
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肾疏宁对肾小球系膜细胞ICAM-1及其mRNA表达的影响
目的:探讨中药肾疏宁对系膜细胞分泌细胞间粘附分子的作用.方法:应用细胞培养技术扣血清药理学方法,采用血管紧张素Ⅱ作为一种刺激因子,观察肾疏宁血清对血管紧张素Ⅱ条件系膜细胞分泌ICAM-1的影响.结果:系膜细胞受到血管紧张素Ⅱ刺激后,ICAM-1的分泌显著增加,而肾疏宁血清能明显抑制ICAM-1的分泌和表达.结论:肾疏宁对粘附分子介导的病理损伤过程有明显的抑制作用.
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肾疏宁对大鼠系膜增生性肾炎的实验研究
目的:验证中药肾疏宁对大鼠系膜增生性肾炎的治疗作用.方法:综合应用葡萄球菌肠毒素B尾静脉注射,口服牛血清白蛋白,定期注射弗氏佐剂,复制大鼠系膜增生性肾炎模型,观察肾疏宁对其生化、病理形态学的影响并以肾炎康复片为对照.结果:肾疏宁能明显减少蛋白尿,改善肾功能,减轻肾小球损伤,促进肾脏组织损伤的修复.结论:肾疏宁治疗系膜增生性肾炎的作用机理,可能与其抑制系膜细胞增生和系膜基质扩张有关.
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肾疏宁对肾小管间质损害大鼠TGF-β1及其下游因子CTGF mRNA表达的影响
目的观察肾疏宁对肾小管间质损害大鼠TGF-β1、CTGF蛋白及CTGF mRNA表达的影响.方法在系膜增生性肾炎(MsPGN)模型基础上,延长造模时间至12～16周,使其自然发展成肾小管间质损害模型,观察肾疏宁对肾小管间质TGF-β1、CTGF蛋白及CTGF mRNA表达的影响,并设苯那普利为阳性对照组.结果第12～16周末,造模各组肾小管间质TGF-β1、CTGF蛋白及CTGF mRNA表达量均明显高于正常组(P＜0.01),肾疏宁组、苯那普利组均显著低于模型组(P＜0.01);第12周末,肾疏宁组与苯那普利组比较无显著性差异(P＞0.05),而第16周末,肾疏宁组明显低于苯那普利组(P＜0.01).结论肾疏宁可对抗CTGF基因的表达,直接或间接抑制TGF-β1,从而保护肾小管间质损害.
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肾疏宁调节肾小球硬化细胞因子网络平衡的研究
目的:探讨肾疏宁对肾小球硬化模型大鼠肾组织细胞外基质及其主要调控细胞因子的作用.方法:采用单侧肾切除并阿霉素尾静脉注射建立大鼠肾小球硬化模型,分组观测肾组织细胞外基质成分collagenⅣ、FN、LN表达及含量,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定HGF和TGF-β1的基因表达.结果:模型组HGF基因表达明显下降,TGF-β1表达上升.细胞外基质成分显著增多.肾疏宁治疗组HGF基因表达上升,TGF-β1基因表达降低.结论:肾疏宁能调节HGF和TGF-β1基因表达的平衡,减少细胞外基质增多,防治肾小球硬化进展有效.
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肾疏宁对肾小球硬化大鼠肝细胞生长因子的影响
目的:探讨肾疏宁对肾小球硬化大鼠肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的影响.方法:采用单侧肾切除及尾静脉注射阿霉素方法建立大鼠肾小球硬化模型.42只造模大鼠随机分为模型组,肾疏宁治疗组和苯那普利治疗组,另设8只大鼠作为假手术组.肾疏宁治疗组和苯那普利治疗组分别予以肾疏宁和苯那普利治疗8周,其余两组予以等量蒸馏水灌胃.治疗8周末,测定大鼠24 h尿蛋白定量(urine protein,Upr)、血清肌酐(creatinine,Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN);光镜下观察各组大鼠肾组织病理形态学改变,比较各组大鼠肾小球毛细血管直径、系膜基质和肾小球硬化指数;采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测肾组织HGF mRNA的表达水平.结果:模型组大鼠24 h Upr、血清Cr和BUN较假手术组明显升高(P＜0.01);肾小球硬化呈弥漫性分布,肾小球内部分毛细血管腔缩小或塌陷闭塞,系膜基质增多,系膜区增宽,肾小球硬化指数3.32±0.35;肾组织HGF mRNA的表达明显下调(P ＜0.05).肾疏宁治疗组和苯那普利治疗组大鼠24 h Upr、血清Cr和BUN较模型组明显降低(P ＜0.01);系膜细胞增生和系膜基质明显减少,毛细血管开放好转,肾小球硬化指数降低(P ＜0.01);肾组织HGF mRNA的表达明显上调(P ＜0.01).结论:肾疏宁可以上调肾组织HGF mRNA的表达,减少系膜基质,改善肾脏病理形态,延缓肾小球硬化的进程.
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肾疏宁治疗系膜增生性肾炎30例临床研究
目的:探讨中药复方肾疏宁治疗系膜增生性肾炎(MsPGN)的临床疗效.方法:选择经肾穿刺活检确诊为MsPGN的30例患者,给予肾疏宁治疗,观察其治疗前后24 h尿蛋白定量,肾功能及免疫球蛋白和血脂等的变化情况.3个月为1个疗程.结果:经肾疏宁治疗1～2个疗程后,患者的24 h尿蛋白明显减少,肾疏宁能调节异常的免疫球蛋白,改善肾功能和血浆蛋白质代谢.结论:肾疏宁是临床治疗MsPGN疗效较好的方剂之一.
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肾疏宁对系膜增生性肾炎模型大鼠肾小球固有细胞表型转化的影响
目的:观察肾疏宁对系膜增生性肾炎(MsPGN)模型大鼠肾小球系膜细胞(MC)表型转化的作用,探讨肾疏宁防治肾小球硬化的作用机制.方法:在建立MsPGN大鼠模型基础上,延长造模时间至12～16周,使其向肾小球硬化进展,观察肾疏宁对肾小球α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,并设苯那普利为阳性对照组.结果:12、16周末造模各组α-SMA表达量明显高于正常组(P＜0.01).16周末肾疏宁组α-SMA表达量明显优于苯那普利组(P＜0.01).结论:肾疏宁能抑制MC表型转化,减少肾小球内固有细胞α-SMA的表达,可能是防治肾小球硬化的部分作用机制.
