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壳聚糖纳米粒作为肠三叶因子基因传递载体的实验研究
目的 构建理想的人肠三叶因子(human intestinal trefoil factor,hITF)基因传递系统.方法 利用复凝法制备载基因壳聚糖纳米粒,用透射电镜观察纳米粒的形态及大小,以Zeta电位仪检测不同N/P比及不同pH对制备的载基因纳米粒Zeta电位的影响,琼脂糖凝胶电泳分析纳米粒对基因的包载能力,高速离心法测定纳米粒的包封率和载药量,分析纳米粒中基因的体外释放过程,后检测纳米粒在HEK293细胞中的转染效率.结果 利用复凝法制备了不同N/P比的壳聚糖纳米粒,透射电镜显示粒径小于1 000 nm,粒径呈窄分布;Zeta电位与N/P比呈正相关,而与pH值呈负相关;凝胶阻滞实验说明壳聚糖在N/P比大于1时可以完全包裹质粒;包封率随着N/P比的增加而增加,载药量则随着N/P比的增加而减小;体外释放实验显示,纳米粒释放速度先快后慢,并且随着N/P比的增加而逐渐减慢;壳聚糖纳米粒对HEK293细胞的转染率超过50％.结论 成功构建了理想的hITF基因传递系统,为壳聚糖介导hITF基因治疗的应用打下基础.
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酵母双杂交技术筛选肠三叶因子结合蛋白基因的研究
肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF/TFF3)是三叶因子家族(trefoil factor family,TFF)成员之一,1991年由Suemori等在大鼠空肠黏膜中发现,是一种胃肠黏膜保护因子,也可促进肿瘤的侵袭扩散[1],有学者甚至提出,TFF3可作为胃癌预后不良的标志物[2].因此,TFF3是胃肠黏膜保护与胃肠道肿瘤研究领域中的一种重要蛋白质.但其作用机制迄今尚未阐明.为进一步研究人肠三叶因子(hTFF3)的功能及作用机制,我们采用酵母双杂交技术筛选胃癌细胞cDNA文库中hTFF3结合蛋白基因.
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重组人肠三叶因子联合5-氨基水杨酸对大鼠结肠炎作用的研究
肠三叶因子(intestinal Trefoil factor,ITF/TFF3)是三叶因子家族(Trefoil factor family,TFF)成员,主要分布于小肠和结肠.研究表明,ITF在促进损伤修复、保持黏膜完整性的过程中起关键作用[1].炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是病因不明的慢性非特异性肠道炎性反应,主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD).目前认为感染、免疫、遗传及精神心理等因素导致其发病,其中免疫凶素和肠黏膜屏障起关键作用,肠黏膜的完整性和连续性受到破坏,能触发系列免疫反应和炎性反应,终导致肠黏膜慢性损伤.本研究旨在探讨重组人肠三叶因子(rhITF)联合5-氨基水杨酸(5-ASA)对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎模型的治疗作用及机制.
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人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体.方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITFcDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和a分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF.结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段.结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF.并制备其抗体的进一步研究提供基础.
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壳聚糖-肠三叶因子纳米粒制备与体外转染的实验研究
目的:构建hITF基因传递系统,检测其细胞转染效果.方法:首先构建肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF)的真核表达载体,再利用复凝法制备壳聚糖纳米粒,用透射电镜观察纳米粒的形态及大小,并利用HEK293细胞检验纳米粒的转染能力,后利用RT-PCR和Western blot检测目的基因的转录及表达情况.结果:成功构建出hITF真核表达载体,利用复凝法制备了不同N/P比的壳聚糖纳米粒,透射电镜观察到粒度＜1 000 nm,粒径呈窄分布;荧光显微镜及流式细胞仪检测显示,壳聚糖纳米粒对HEK293细胞的转染率约为80％,和脂质体的转染率基本一致;RT-PCR和Western blot检测说明hITF被成功转录并分泌表达.结论:成功构建了hITF理想的基因传递系统,为壳聚糖介导hITF基因治疗的应用打下基础.
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人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达
目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体，并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段，将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr，得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr；经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞，通过G418筛选，建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系；用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，并建立了稳定转染的CHO细胞系，成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白，为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。
关键词： 人肠三叶因子 真核表达载体 CHO/dhfr-细胞 -
人肠三叶因子在pET系统中的表达、纯化及生物活性
目的 构建人肠三叶因子(hITF)原核表达载体,表达重组hITF,并考察其生物学活性.方法 通过RT-PCR获得hITF cDNA片段,将目的基因插入原核表达载体pET32a,得到重组载体pET32a-hITF,优化表达条件获得大表达产量,Ni-NTA亲和层析一步法纯化重组蛋白,SDS-PAGE、Western blotting及N端测序鉴定重组蛋白,细胞重建模型验证其功能.结果 经PCR及测序证实,hITF cDNA准确插入原核表达载体pET32a中,诱导表达后,SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为32kD,Western blotting分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性;N端15个氨基酸测序证明其序列正确性;体外实验证实其具有细胞促迁移能力.结论 成功构建出原核表达载体pET32a-hITF,获得重组hITF.
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人肠三叶因子真核载体的构建与表达
目的 构建人肠三叶因子(hITF/hTFF3)的真核载体并在真核细胞中表达.方法 从人结肠粘膜提取总RNA,逆转录多聚酶反应制备总cDNA,PCR扩增hTFF3基因,TA克隆至pGEMT载体中,测序鉴定后将hTFF3基因重组到真核表达载体pCMV5-myc中,转染真核细胞293-T,裂解细胞后分别采用鼠抗人c-myc抗体和鼠抗人11下3抗体行Western-blot了解hTFF3表达情况.结果 从人结肠粘膜成功克隆了hTFF3基因并经测序验证,构建了pCMV5-myc-hTFF3真核表达载体,转染细胞后行western-blot提示hTFF3可在293-T细胞中表达.结论 成功构建pCMV5-myc-hTFF3重组真核载体并在293-T细胞中表达hTFF3蛋白,为进一步研究hTFF3的功能、作用机制及相互作用蛋白奠定了基础.
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hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达
目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组hITF,为功能研究奠定基础.方法通过PCR获得hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pGAPZαA分泌信号下游,得到重组载体pGAPZαA-hITF.BspH I线性化后氯化锂转化进入X-33,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测.结果经测序及PCR证实,hITFcDNA准确插入酵母表达载体pGAPZαA中,氯化锂转化后,重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为10×103,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论成功构建出酵母表达载体pGAPZαA-hITF,获得重组hITF,为深入研究hITF奠定了基础.
