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IL-32γ活化Akt通路诱导肝星状细胞LX-2表达MMP2
目的 探讨IL-32γ 诱导肝星状细胞LX-2表达基质金属蛋白酶2(MMP2)及其机制.方法 不同浓度(0、10、20μg/L)的IL-32γ 蛋白与LX-2细胞共培养,RT-PCR检测细胞MMP2 mRNA水平;ELISA检测MMP2蛋白水平,Human Phospho-Akt Immunoassay试剂盒检测活化的Akt水平.不同浓度(0、25、50μg/L)的重组人活化Akt蛋白与LX-2细胞共培养后,ELISA检测MMP2蛋白;不同浓度(0、10、20μmol/L)的Akt抑制剂Perifosine与IL-32γ 和LX-2细胞共培养后,ELISA检测MMP2蛋白.3组Akt、MMP2 mRNA及蛋白比较采用单因素方差分析和LSD-t检验.结果 不同浓度的IL-32γ 蛋白与LX-2细胞共培养后,MMP2 mRNA和蛋白水平分别为(0.9±0.4)、(5.5±1.4)、(12.2±2.6)和(53±13)、(234±38)、(523±101)μg/L,呈剂量依赖性升高(LSD-t=5.517,3.952和7.855,4.634;P<0.05).IL-32γ 可诱导LX-2细胞Akt表达,依浓度分别为(86±9)、(287±60)、(650±170)RFUs,呈剂量依赖性升高(LSD-t=5.700,3.489;P<0.05).重组人活化的Akt蛋白可诱导LX-2细胞MMP2表达,依浓度分别为(54±14)、(277±45)、(550±132)μg/L,呈剂量依赖性升高(LSD-t=8.155,3.387;P<0.05).不同浓度的Perifosine可抑制IL-32γ 诱导LX-2细胞的MMP2表达,MMP2蛋白依浓度分别为(553±86)、(233±28)、(89±12)μg/L,呈剂量依赖性降低(LSD-t=6.130,8.083;P<0.05).结论 IL-32γ 可能通过活化Akt通路诱导肝星状LX-2细胞表达MMP2而参与肝纤维化和肝癌的发生、转移.
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LX-2与HK-2细胞共培养模型的建立及对其细胞转分化的影响
[目的]#建立人肝星状细胞（LX-2）与人肾小管上皮细胞（HK-2）共培养体系的理论模型，研究LX-2对HK-2转分化的影响。[方法]以Transwell小室建立体外LX-2细胞和HK-2细胞间接共培养体系。应用细胞免疫组织化学法检测HK-2细胞平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达；用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测各组细胞培养液中转化生长因子-β1（TGF-β1）的含量；逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR法）检测HK-2细胞TβRⅠmRNA、TβRⅡmR－NA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA的表达。[结果]除了空白组，形态学上其他两组均可看到HK-2细胞胞浆染棕黄色，不同数量细胞由立方铺路石样转变为梭形长条状，细胞肥大；HK-2细胞高表达α-SMA（P＜0.01）；HK-2细胞上清液中TGF-β1含量明显高于空白组（P＜0.01）；HK-2细胞TβRⅠ、Smad2、Smad3基因表达明显上调，而TβRⅡ、Smad7基因表达明显下调。[结论] Transwell共培养法可诱导HK-2细胞转分化，其机制可能与TGF-β1/Smad信号通路有关。
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益气活血方对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响
目的 探讨中药“复方益气活血方”(Yiqihuoxue prescription)对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响.方法 体外培养肝星状细胞LX-2,浓度分别为1.125,2.228,3.31,4.37,5.41 mg/ml益气活血方作用于LX-2细胞24h,48h,然后用MTT比色法检测细胞的增殖情况,选取合适的益气活血药物浓度(1.125,2.228,6.432 mg/ml)用流式细胞术检测益气活血药作用24 h后对LX-2细胞凋亡的影响.结果 ①MTT检测结果显示,不同浓度的益气活血方用于LX-2细胞24h和48h后,能够抑制LX-2细胞增殖(P＜0.05),24h抑制率随药物浓度的增加而提高.48 h时,当药物浓度达到3.31 mg/ml后,其抑制作用不随药物浓度的增加而增强(P＞0.05).②流式细胞术检测显示,益气活血方(浓度分别为1.125,2.228,6.432 mg/ml),可明显促进LX-2细胞凋亡.结论 益气活血方能抑制LX-2细胞的增殖,促进LX-2细胞凋亡,其抑制作用呈时间-剂量依赖性.
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丹参联合β-榄香烯对肝星形细胞LX-2增殖和凋亡的影响
目的:探讨丹参联合β-榄香烯对肝星形细胞LX-2增殖和凋亡的影响.方法:体外培养肝星形细胞LX-2,分别将丹参(浓度为1、2、4、6、8 mg/ml),β-榄香烯(浓度为25、50、100、150、200 μg/ml),单独作用于LX-2细胞后24 h、48 h用CCK-8 (Cell Count Kit-8)法检测细胞的增殖情况,并选取合适的药物浓度(丹参3.6 mg/ml,β-榄香烯125 μg/ml),然后进行联合用药,加药24h、48h后用CCK-8(Cell Count Kit-8)法检测细胞的增殖情况,用流式细胞术检测细胞的凋亡率.结果:①CCK-8法显示丹参(浓度为1、2、4、6、8 mg/ml),β-榄香烯(浓度为25、50、100、150、200 μg/ml)作用LX-2细胞24h、48h后,其增殖抑制率均明显高于正常对照组(P＜0.05),并且呈浓度和时间依赖性.②联合用药(丹参3.6 mg/ml,β-榄香烯125 μg/ml)时,LX-2细胞的增殖抑制率和凋亡率均显著高于单独用药(P＜0.01).结论:丹参、β-榄香烯单独或二者联合作用均能抑制LX-2细胞的增殖,且联合应用的作用显著高于单独用药,可协同促进LX-2细胞的凋亡.
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凉血活血方对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响
目的:探讨凉血活血方(Liang Xue Huo Xue Fang)对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响.方法:体外培养肝星状细胞LX-2,分别将凉血活血方(浓度为1.125,2.228,3.31,4.37,5.41 mg· mL-1),作用于LX-2细胞后24 h,48 h用MTT比色法检测细胞的增殖情况,选取合适的药物浓度(4,8,12,16 mg· mL-1),用流式细胞术检测加药24h后细胞的凋亡率.结果:①MTT法显示不同浓度凉血活血方作用LX-2细胞24 h,48 h后,除24 h,1.125 mg·mL-1和2.228 mg·mL-1外,其余组增殖抑制率均明显高于正常对照组(P＜0.05).②流式细胞术检测显示,凉血活血方浓度为4,8,12,16 mg·mL-1)时,可明显促进LX-2细胞凋亡.结论:一定剂量的凉血活血方能抑制LX-2细胞的增殖,可能与其促进细胞凋亡有关.
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黄芪多糖和黄芪总甙调控LX-2细胞因子分泌
目的:用黄芪多糖和黄芪总甙对LX-2细胞分泌的与纤维化相关的主要细胞因子进行研究,以探讨黄芪抗纤维化的确切分子机制.方法:不同浓度的黄芪多糖和黄芪甙作用于LX-2细胞,以Real Time Cell Electronics Sensing技术实时检测细胞增殖状态;分别再以25 pμg/ml和300 μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙作用LX-2细胞24 h,提取细胞mRNA,以荧光定量PCR测定转化生长因子1(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA的变化.结果:300μg/ml的黄芪多糖可抑制LX-2的增殖(P＜0.05,94.7 h),但不同浓度的黄芪总甙对LX-2细胞均有促进增殖的作用(P＜0.05);25μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙在TGF-β1促进分泌的同时,也上调其它抗纤维化因子,其中黄芪多糖对MMP2的上调(104.9倍)、黄芪总甙对IL-10的上调(550.65倍)为显著;300μg/ml的黄芪多糖可抑制TGF-β1及HGF、MMP9、IL-10的表达,但仍然上调MMP2的表达,300 μg/ml的黄芪总甙也可抑制TGF-β1的表达,但对抗纤维化因子MMP2、MMP9及IL-10仍有明显的上调作用.结论:低浓度(25μg/ml)和高浓度(300μg/ml)的黄芪多糖和黄芪总甙可通过不同的分子机制调控肝星状细胞因子的分泌而发挥抗纤维化作用;黄芪多糖主要以促进MMP2分泌为主,而黄芪总甙则主要通过上调MMP2、MMP9及IL-10的分泌而发挥作用.高剂量的黄芪多糖和总甙抗纤维化效果优于低剂量组.
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白细胞介素32γ通过活化核转录因子κB通路诱导LX-2细胞表达基质金属蛋白酶9
目的：研究白细胞介素?32（Interleukin?32， IL?32）可否诱导肝星状细胞LX?2表达基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9， MMP?9）。方法用不同浓度的IL?32γ与LX?2细胞共培养，收集细胞培养上清，用TRizol试剂提取细胞总RNA，用定量 PCR检测MMP?9 RNA表达水平， MMP?9蛋白质表达水平用酶联免疫吸附试验（ enzyme?linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒检测。接下来将Nuclear factor kappa B （ NF?κB）亚基p50、 p65真核表达载体pCMV?p50、 pCMV?p65单独或联合转染LX?2细胞，48 h后收集细胞培养上清，酶联免疫吸附测定（ enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）检测MMP?9蛋白质表达水平。将不同浓度的NF?κB抑制剂SN50加入IL?32γ与LX?2细胞共培养的培养液中，48 h后收集细胞培养上清，用ELISA检测MMP?9蛋白质表达水平。结果 IL?32γ可以诱导人LX?2细胞表达MMP?9，且其表达水平随IL?32γ浓度增加而增强； NF?κB亚基p50、 p65可以诱导LX?2细胞MMP?9表达增高； NF?κB抑制剂SN50阻断NF?κB通路可降低IL?32γ诱导的MMP?9表达。结论 IL?32γ通过活化NF?κB通路诱导LX?2细胞表达MMP?9， IL?32可能通过诱导肝星状细胞表达MMP?9参与肝纤维化形成。
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甲基莲心碱对人肝星状细胞共培养条件下的人肝癌细胞中的转化生长因子(TGF-β1)的影响
目的:研究甲基莲心碱对人肝星状细胞LX-2细胞株共培养条件下的人肝癌细胞HepG2细胞株中的转化生长因子(TGF-β1)的影响.方法:Transwell建立HepG2细胞和LX-2细胞共培养系统,同时设置阴性对照组和单独的HepG2细胞培养组;倒置显微镜下观察甲基莲心碱诱导肝星状细胞共培养条件下的肝癌细胞的凋亡形态变化;酶联免疫(ELISA)检测上清液中分泌的转化生长因子(TGF-β1)的浓度;Western Blot和实时定量PCR分别从蛋白水平和mRNA水平测定TGF-β1的表达情况.结果:甲基莲心碱作用共培养条件的HepG2细胞48 h,给药组相较于对照组细胞数目减少,形态皱缩,但没有单独的HepG2细胞组凋亡形态明显;TGF-β1经ELISA、Western Blot和实时定量PCR检测,其表达水平均随着药物剂量的增大而下调,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),但没有单独的HepG2细胞组TGF-β1水平下调明显.结论:甲基莲心碱能够下调肝星状细胞LX-2细胞株共培养条件下的肝癌细胞HepG2细胞株的TGF-β1的表达来诱导细胞凋亡,并呈现出剂量依赖性,但肝星状LX-2细胞对甲基莲心碱诱导共培养下的HepG2细胞的凋亡有一定地抑制作用.
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FAK抑制剂对人肝星状细胞Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响
目的:探讨FAK抑制剂(PF562,271)对人肝星状细胞(LX-2) Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响,为抗肝纤维化寻找新的作用靶点.方法:CCK-8法检测不同浓度范围(0～7 μmol· L-1)FAK抑制剂(PF562,271)在12、24、48 h和72 h时对LX-2细胞增殖的影响,Real-time PCR分析PF562,271对LX-2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ mRNA表达水平的影响,Western-blot检测不同浓度PF562,271对LX-2细胞中Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达的影响,评价PF562,271对LX-2细胞中Akt/ GSK-3 β/ β-catenin信号通路的影响.结果:PF562,271能够抑制LX-2细胞增殖,且该作用呈剂量和时间相关性;qRT-PCR检测到PF562,271能够抑制LX-2细胞中α-SMA、collagen Ⅰ mRNA表达,与对照组相比,表达量显著降低(P＜0.05);Western-blot结果显示PF562,271对Akt/GSK-3β的磷酸化表达水平显著降低(P＜0.05).结论:FAK抑制剂能够抑制LX-2细胞增殖,促进其凋亡,其作用机制可能是通过抑制Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路从而缓解肝纤维化进程.
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IL －32γ对 LX －2细胞表达Ⅰ型胶原的影响
目的：研究IL－32γ可否诱导肝星状细胞LX－2表达Ⅰ型胶原（ Collagen Ⅰ）。方法不同浓度的IL－32γ与LX－2共培养，分别收集培养上清液、提取细胞总RNA，real－time PCR检测Collagen Ⅰ mRNA表达水平，ELISA法检测CollagenⅠ蛋白质表达水平。用不同浓度的人重组磷酸化p38α蛋白（ recombinant human active p38α蛋白）与LX－2细胞共培养，48 h后收集细胞培养上清液，ELISA法检测Collagen Ⅰ蛋白质表达水平。再用不同浓度的p38MAPK抑制剂SB203580加入LX－2细胞与IL－32γ共培养的培养液中，分别收集培养上清液，采用ELISA检测CollagenⅠ蛋白质表达水平，同时提取细胞总RNA采用real－time PCR检测Collagen Ⅰ mRNA表达水平。结果 IL－32γ诱导人LX－2细胞表达CollagenⅠ，且其表达水平随IL－32γ浓度的增加而增强；人重组磷酸化p38α蛋白可诱导LX－2细胞表达Collagen Ⅰ增高，阻断p38MAPK可降低IL－32γ诱导的Collagen Ⅰ表达。结论 IL－32γ通过活化p38MAPK通路诱导LX－2细胞表达CollagenⅠ，IL－32γ可能通过诱导肝星状细胞表达Collagen Ⅰ而参与肝纤维化的形成。
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过表达Raf激酶抑制蛋白(RKIP)抑制人肝星状细胞增殖
目的 研究Raf激酶抑制蛋白(RKIP)对LX-2人肝星状细胞增殖的影响.方法 用重组质粒pcDNA3.1-RKIP转染LX-2细胞,G418筛选并培养稳定转染的细胞.MTT法和集落形成试验检测过表达RKIP对LX-2细胞增殖、集落生成的影响;Western blot法检测RKIP、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、1型胶原蛋白(Coi1)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、MMP-2及胞外信号调节激酶/丝裂原激活蛋白激酶(ERK/MAPK)信号通路相关蛋白的表达水平.结果 与对照细胞相比,过表达RKIP明显抑制LX-2细胞增殖和集落形成,下调Col1、α-SMA、MMP-1和MMP-2蛋白表达,降低ERK/MAPK磷酸化水平.结论 过表达RKIP抑制LX-2细胞的增殖,其机制与抑制ERK/MAPK信号通路有关.
