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MiR-181a和miR-181b靶向调控FUT1对结直肠癌进展的影响
目的 通过研究miR-181a及miR-181b与岩藻糖基转移酶FUT1的相关性,阐明miR-181a和miR-181b靶向调控FUT1在结直肠癌转移中的功能机制.方法 收集2014年3月至2016年1月大连医科大学附属第一医院经手术切除的结直肠癌及其癌旁组织共32对组织标本,男性18例,女性14例;采用RT-PCR方法检测了32对结直肠癌患者癌组织、癌旁组织、结直肠癌患者和健康人血清及结直肠癌高转移细胞株SW620、低转移细胞株SW480中miR-181a和miR-181b的表达.通过皮尔森"Pearson"相关曲线得出FUT1与miR-181a、miR-181b表达相关趋势.通过生物信息学网站TargetScan、microRNA.org和Starbase v2.0预测及双荧光素酶实验报告验证miR-181a、miR-181b与FUT1的靶向关系;通过CCK8,划痕实验,transwell小室及血管形成进一步检测SW480、SW620细胞中miR-181a和miR-181b表达调控对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管形成的影响.两独立样本间的比较采用t检验,多个样本间的比较采用单因素方差分析,相关分析采用Pearson相关系数分析.结果 miR-181a、miR-181b在结直肠癌组织中的表达明显低于癌旁组织(3.12±1.88 vs 6.44±2.32,t=11.74;3.16±1.77 vs 5.52±2.45,t=3.24,P均<0.05);miR-181a、miR-181b在结直肠癌患者血清的表达量明显低于健康人血清中的表达量(1.32±0.25,2.57±0.48,t=10.26;0.91±0.14,1.63±0.29,t=5.19;P均<0.05);在结直肠癌细胞株SW480和SW620中的表达明显低于正常结直肠上皮细胞株FHC[(0.65±0.10、0.50±0.09)vs 1.0,(0.60±0.12、0.42±0.03)vs 1.0;t=3.08,P均<0.05];FUT1在结直肠癌组织及SW620中高表达(t=5.23,P<0.05).TargetScan、microRNA.org和Starbase v2.0软件预测FUT1与miR-181a、miR-181b具有靶向结合位点,双荧光素酶实验验证FUT1为miR-181a、miR-181b的共同靶基因.特异性上调SW620细胞中miR-181a、miR-181b,细胞的增殖、迁移、侵袭、血管形成能力明显降低且FUT1的表达量显著下降.干扰SW480细胞中的miR-181a、miR-181b,细胞的增殖、迁移、侵袭、血管形成能力明显增加且FUT1的表达显著增强.干扰FUT1的表达逆转了miR-181a和miR-181b对SW480细胞侵袭能力的抑制作用.结论 miR-181a、miR-181b通过靶向调控FUT1的表达抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭及血管形成.
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类孟买血型两例的分子遗传机制研究
目的 探讨2例类孟买血型个体的分子遗传机制.方法 先证者为女性,在无偿献血时发现ABO血型正反定型不符,遂将其本人及家系成员(包括先证者爷爷、奶奶、父亲、母亲、弟弟、妹妹)血液标本(EDTA抗凝)和唾液标本送至广州血液中心进一步鉴定.采用常规血清学方法对先证者及其家系成员血液标本进行血型鉴定,对唾液标本进行ABH血型物质的检测；利用PCR扩增先证者及家系成员的FUT1和FUT2基因编码区和ABO血型基因第6、7外显子编码区,对PCR产物进行直接测序后分析结果,对FUTI基因的缺失突变进行克隆测序分析.结果 先证者及其弟弟为类孟买血型,其他家系成员中未发现类孟买血型；直接测序结果显示先证者和弟弟的FUT1基因为第547 -552位碱基AG缺失、880-882位碱基TT缺失的杂合型；其爷爷和父亲为单链880-882位碱基TT缺失杂合型,母亲和妹妹为单链547-552位碱基AG缺失杂合型；克隆测序结果证实上述缺失分别发生在FUT1基因编码区第547-548位和第881-882位；先证者和弟弟的FUT2基因编码区均存在第390位C＞T、第749位G＞A突变,家系成员中还存在第418位A＞T突变.结论 FUT1基因不同位点双碱基缺失杂合可导致类孟买血型,单链缺失突变杂合型的ABO表型正常；发现了FUT2基因中3个新的突变位点.
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转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞抗人血清溶破实验
目的 研究转人α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因克服异种移植超急排斥反应(HAR)的作用.方法 构建pcDNA3-HTcDNA重组质粒,体外培养猪动脉内皮细胞(PAEC),脂质体转染法将pcDNA3-HTcDNA转染PAEC,新霉素(G418)筛选具有抗性的细胞克隆,PCR检测重组基因的整合,流式细胞术(FCM)检测转染细胞H抗原和异种抗原α-Gal表达.分别以未转染的PAEC和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作对照.将转染细胞和正常细胞分别以20%、40%和60%人血清孵育2 h,比较溶破细胞百分数.结果 重组质粒转染PAEC经筛选得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,FCM检测正常PAEC与转染PAEC,α-Gal平均荧光强度由1346.81降至194.44,H抗原平均荧光强度由9.10增至215.93;α-Gal M2区由99.98%降至37.18%,H抗原M2区由13.80%升至78.54%.转染细胞以人血清孵育后溶破细胞百分数较正常细胞降低,分别由(32.32±2.37)%、(59.54±4.56)%和(71.46±5.94)%降至(15.78±2.69)%、(30.16±1.46)%和(40.48±3.77)%,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论 转人HT基因PAEC α-Gal表达明显降低,H抗原表达升高,对人血清溶破的耐受性增强.转人HT基因可以一定程度抑制HAR.
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岩藻糖转移酶基因亚型与乳腺癌转移和预后的关系
目的检测和分析岩藻糖转移酶(fucosyltransferase,Fuc-T)基因各亚型与乳腺癌转移和预后的关系.方法采用80例乳腺癌石蜡组织标本,应用DNA提取、聚合酶链反应的方法半定量检测Fuc-T基因Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ亚型的基因拷贝量,分析其与乳腺癌转移和预后的关系.结果在乳腺癌组织中Fuc-T Ⅶ基因拷贝量高于其他亚型;Fuc-T Ⅶ强阳性组的5年无瘤生存率为20.00%,明显低于阳性组的80.77%和阴性组的86.36%(P<0.01);与临床病理特征的关系分析显示,仅Fuc-TⅦ与淋巴结转移相关(P<0.01).其他各亚型与转移和预后的相关性未达显著性水平.结论 Fuc-TⅦ基因与乳腺癌的转移和预后相关,Fuc-T Ⅶ基因可能在乳腺癌唾液酸化糖原分子Sialyl Lewis X的合成过程中具有重要作用,从而影响乳腺癌的转移和预后.
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Lewis Y寡糖在小鼠胚泡表面的表达受α1,2-岩藻糖基转移酶基因的反馈调控
目的探讨胚泡的Lewis Y寡糖合成关键酶α1,2-岩藻糖基转移酶基因FUT1及α1,3-岩藻糖基转移酶基因FUT4的表达和其表面Lewis Y寡糖抗原表达间的关系.方法以寡糖特异性单克隆抗体封闭体外培养的胚泡表面Lewis Y抗原,应用RT-PCR和间接免疫荧光方法检测胚泡的Lewis Y寡糖合成关键酶α1,2-岩藻糖基转移酶基因FUT1和α1,3-岩藻糖基转移酶基因FUT4及其表面Lewis Y抗原的表达.结果在胚泡表面Lewis Y寡糖被抗体封闭后,其FUT1的表达迅速升高,FUT4的表达则未见明显变化,而胚泡表面的Lewis Y寡糖在除去抗体后一直到再培养约21 h后才重新出现,在约30 h几乎全部复现.结论着床前胚泡表面的Lewis Y寡糖的表达主要受胚泡α1,2-岩藻糖基转移酶FUT1的反馈调节.
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携带人α1,2-岩藻苷转移酶基因转基因小鼠的建立
目的:建立携带人α1,2-岩藻苷转移酶[alpha(1,2)-fucosyltransferase,HT]基因的转基因小鼠模型.方法:采用受精卵显微注射法,将人HT转基因构件导入昆明白小鼠受精卵的雄原核内,然后将注射后仍健康的受精卵植入假孕母管内,等其自然分娩.对G0代小鼠,应用聚合酶链反应(PCR)和Southern杂交检测人HT基因的整合情况、应用逆转录PCR(RT-PCR)检测人HT基因mRNA水平的表达,应用流式细胞计数(FCM)检测H抗原及α-Gal抗原在小鼠外周血单核细胞(PBMCs)表面的表达.结果:注射后卵的存活率和幼鼠出生率分别为84.9%(968/1 140)和10.8%(105/968),外源基因的整合率为7.6%(8/105),基因整合阳性小鼠中有7只的心、肝、肾及骨骼肌组织均有人HT mRNA表达,并且PBMCs表面H抗原表达阳性,表达强度为人PBMCs的95%～150%,同时α-Gal抗原表达减少,为正常小鼠的5%～10%.转基因小鼠已经稳定传3代.结论:携带人α1,2-岩藻糖苷转移酶基因的转基因小鼠模型已制备成功.
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α-1,3岩藻糖转移酶各亚型在小鼠胚胎着床前后子宫内膜表达的半定量研究
目的:研究小鼠胚胎着床前后蜕膜组织α-1,3岩藻糖转移酶(FucT)Ⅲ～Ⅶ型的表达及其在胚胎着床中的作用.方法:取未孕和孕1～7d小鼠子宫内膜,每组6例.用RT-PCR法测定Ⅲ～Ⅶ型mRNA水平的表达,并经测序鉴定.结果:正常小鼠内膜有一定的FucT-Ⅳ的表达,其表达在妊娠第1天和胚胎着床前后即妊娠第4天出现峰值.结论:5种糖基转移酶中只有FucT-Ⅳ参与了胚胎着床的过程.它的作用可能是参与了胚泡表面特异性抗原Lex等抗原的糖基化,从而促进胚胎的植入.
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核心岩藻糖基转移酶siRNA抑制肾小管上皮细胞转化生长因子β-Smad2/3通路活化
目的 探讨α-1,6核心岩藻糖基转移酶(FUT8)小分子干扰RNA( siRNA)对肾小管上皮细胞转化生长因子( TGF) β-Smad2/3信号通路的影响.方法 HK-2细胞共分为6组:正常组、阴性对照组、TGF-β1组、TGF-β1加FUT8干扰组、TGF-β1加阴性对照组、FUT8干扰组.利用外源性TGF-β1激活HK-2细胞TGF-β-Smad2/3信号通路.应用siRNA技术沉默FUT8.用免疫荧光方法测定细胞表面核心岩藻糖链表达；用免疫沉淀、凝集素免疫印迹以及免疫双染的方法测定FUT8基因沉默后TGF-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)、TGF-β Ⅰ型受体(ALK-5)的核心岩藻糖基化变化,并检测Smad2/3蛋白表达和磷酸化(p)-Smad2/3蛋白表达及其核转位的变化.结果 与正常组及阴性对照组相比,加入5 μg/L的TGF-β1孵育HK-2细胞48 h,能显著上调TGF-βRⅡ和ALK-5蛋白表达水平(P＜0.05),导致p-Smad2/3表达水平明显升高(P＜0.05),并促使其发生核转位.HK-2细胞表面存在核心岩藻糖链表达.与正常组及阴性对照组相比,TGF-β1孵育后,TGF-βRⅡ与ALK-5两种受体的核心岩藻糖链均显著升高(P＜0.05),FUT8 siRNA能显著抑制TGF-βRⅡ与ALK-5核心岩藻糖链表达(P＜0.05),从而抑制p-Smad2/3表达升高(P＜0.05)及其核转位,但不影响TGF-βRⅡ和ALK-5的蛋白表达(P＞0.05).结论 在肾小管上皮细胞中,TGF-βRⅡ和ALK-5蛋白翻译后的核心岩藻糖基化修饰是它们发挥生物学功能所需要的,阻止TGF-βRⅡ和ALK-5的核心岩藻糖基化,能抑制TGF-β-Smad2/3信号转导通路的活化.
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岩藻糖基化修复脐血造血干细胞归巢缺陷研究的新进展
造血干细胞(HSC)植入延迟是脐血移植(UCBT)面临的主要问题,由于植入延迟导致患者移植后感染发生率高,移植相关死亡率增高,限制了UCBT的进行.脐血HSC存在归巢缺陷是造成植入延迟的原因之一.多项研究发现,岩藻糖基化处理能修复脐血HSC的归巢缺陷,并且其操作简便、快捷、安全、有效,对脐血HSC的自我更新与分化能力无损伤,是解决上述难题的可行方法.笔者拟就岩藻糖基化修复脐血造血干细胞归巢缺陷技术的相关研究与临床应用进展进行回顾与展望.
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腺病毒载体介导的人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶的表达降低Galα(1，3)Gal抗原表位水平
目的：检测人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶降低Galα(1，3)Gal表位(gal表位)水平.方法：以人腺病毒载体表达人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶.流式细胞术比较H血型抗原和gal表位的表达水平.MTT法分析小鼠NIH3T3细胞对人天然抗体和补体介导的细胞裂解作用的敏感性.结果：设计并构建了表达人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5hSeFT.流式细胞分析结果表明，NIH3T3细胞及Ad5null和Ad5hSeFT感染后的NIH3T3细胞，UEA-I凝集素结合细胞的平均荧光强度(MFI)分别为2.3±0.6，2.1±1.0和36.5±5.9；GS-IB4凝集素结合细胞的MFI值分别为167±23，170±19和100±14；人天然IgG和IgM抗体结合细胞的MFI值分别为31±3，32±4和22±4.结论：NIH3T3细胞被Ad5hSeFT感染后在细胞表面表达了H血型抗原，导致细胞表面gal表位的表达下降了40％，并且这种下降增强了细胞对正常人血清裂解作用的抵抗力.
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以腺病毒为载体表达猪α(1，3)半乳糖基转移酶反义RNA抑制Galα(1，3)Gal抗原表位的表达
目的：尝试以反义RNA的方法抑制Galα(1，3)Gal抗原表位(gal抗原)的表达.方法：以人腺病毒载体表达猪α(1，3)半乳糖基转移酶基因的反义RNA.流式细胞术比较H血型抗原和gal抗原的表达水平.结果：构建了表达反义RNA的重组腺病毒载体Ad5anti-sGT600和Adanti-sGTll00.反义RNA的表达使NIH3T3细胞表面的gal抗原表位下降约30％.另外，反义RNA与人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶的共同作用可使gal抗原表位的水平进一步下降.结论：重组腺病毒Adanti-sGT600和Ad5anti-sGTll00可有效降低gal抗原表位的表达.
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FUT2基因参与人肿瘤细胞系BEL-7404、SGC-7901和SPC-A-1上H血型抗原的表达
目的：调查H血型抗原在人肿瘤细胞系BEL-7404、SPC-A-1和SGC-7901上的表达.方法：免疫组织化学和流式细胞术分析细胞上H抗原在体内外的表达.RT-PCR，Southern印迹和限制性酶切分析确定FUT2基因在细胞中的表达.结果：SGC-7901，BEL-7404和SPC-A-1细胞表面H抗原表达的平均荧光强度分别为162±43，81±25和28±17.并且用RT-PCR从这些细胞中扩增出一约1.0kbDNA条带，此条带能被FUT2特异核酸探针检出.结论：人肿瘤细胞系BEL-7404，SPC-A-1和SGC-7901于体内外在细胞表面均表达H抗原，但表达水平在细胞之间变化显著.FUT2基因的表达在细胞膜上产生这些抗原.
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人类岩藻糖基转移酶5特异性分布及其在精细胞的表达与定位
目的 研究人类岩藻糖基转移酶5 (fucosyltransferase 5,FUT5)的特异性分布及在精细胞的表达与定位.方法 收集健康志愿者的精液(分离精细胞并提取精细胞膜蛋白)、阴道拭子、唾液及静脉血,应用免疫印迹方法检测FUT5在人类精细胞膜、精浆、阴道液、唾液及血清中的表达量,采用免疫荧光技术检测FUT5在精细胞中的表达与定位.结果 免疫印迹方法结果显示FUT5在精细胞膜及血清中有较高表达,但在精浆、阴道液及唾液中未被检测到.免疫荧光实验结果显示FUT5主要存在于精细胞头部.表明人类精细胞膜存在一定表达量的特异性FUT5,可采用抗原-抗体反应分离精液和阴道液混合斑中的精细胞.结论人类FUT5表现出分布特异性,可应用到法医学性犯罪案件中混合斑的鉴定.
