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中国人单纯性先天性心脏病患儿NKX2-5与GATA4基因突变分析
目的 初步研究中国人单纯性先天性心脏病患儿的基因突变类型,为中国人单纯性先天性心脏病患儿的产前诊断和治疗提供依据.方法 收集96例曾住院治疗的、临床确诊的单纯性先天性心脏病患儿的外周静脉血至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管,提取DNA,设计引物,行NKX2-5与GATA4外显子扩增并测序.结果 96例患者中,有6例检测出致病基因突变,检出率为6.25%,具体突变为NKX2-5:c.536 C>T(S179F),c.508 C>T(Q170x),c.88 A>T(A30T),c.554G>T(W185L).GA-TA4:c.1273G>A(D425N),c.799A>G(V267M).本课题检测出4个NKX2-5突变以及两个GATA4基因突变,均为已经报道的突变.结论 本课题突变检出率为6.25%,表明NKX2-5或者GATA4突变可能不是造成中国人单纯性先天性心脏病的主要原因;检出5例房间隔缺损(ASD)突变,表明遗传因素可能对ASD更重要;检出4个NKX2-5基因的突变,表明NKX2.5在早期心脏发育起重要作用.
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房间隔缺损患儿NKX2-5基因突变的研究
目的 本研究旨在识别先天性房间隔缺损(atrial septal defect,ASD)患者的分子遗传缺陷,为其早期防治奠定基础.方法 收集180例特发性ASD患者(其中12例有阳性ASD家族史)的临床资料和血标本,以200名健康者为对照.应用聚合酶链反应扩增NKX2-5基因的全部外显子和外显子两侧的部分内含子,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序.借助BLAST程序将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对以识别基因突变,并用ClustalW软件分析突变氨基酸的保守性.结果 在1例家族史阳性的ASD患者的NKX2-5基因识别出一个新的杂合突变,即编码核苷酸序列第536位的胞嘧啶变为胸腺嘧啶,导致第179位的丝氨酸变为苯丙氨酸.该突变也存在于这个家系中的另外3位患病成员,但不存在于这一家系中的健康成员和200名正常对照者,多物种NKX2-5基因编码氨基酸序列比对显示突变氨基酸在进化上高度保守.此外,还发现了一个常见的单核苷酸多态,即编码核苷酸序列第63位的腺嘌呤变为鸟嘌呤,但这种多态在ASD患者和健康对照者间的频率分布差异无统计学意义(χ~2=2.8641,P=0.0906).结论 NKX2-5基因突变能够导致家族性ASD.
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转录因子Nkx2-5和GATA-4在胚胎心肌发育早期的作用
移植不同来源的干细胞以修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为目前研究的热点.虽然人们已成功地将非心源性的干细胞(如胚胎干细胞、造血干细胞和骨骼肌卫星细胞等),移植至梗死的心肌区域并观察到它们分化成心肌样细胞,但是对于这一横向分化的具体机制所知甚少.
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bFGF对糖尿病心梗大鼠心梗范围及NKx2-5和GATA-4表达的影响
目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子对糖尿病合并急性心肌梗死大鼠心肌梗塞范围及心脏早期转录基因NKx2-5和GATA-4的影响.方法 GK大鼠30只(2型糖尿病大鼠)及Wistar大鼠(正常大鼠)30只,建立大鼠急性前壁心肌梗死模型,制备成功后分为溶媒对照组及治疗组,治疗组缺血心肌内注射bFGF共0.1ml,溶媒对照组及假手术组注射等量磷酸盐缓冲液(PBS),用0.5%的硝基四氮唑蓝(NBT)溶液染色测定梗死范围,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察NKx2-5和GATA-4表达.结果 ①与各自溶媒对照组比较,bFGF组可显著减小结扎冠脉引起的心肌梗死范围(P＜0.01),Wistar大鼠bFGF组与GK大鼠bFGF组比较前者梗死范围减小更明显(P＜0.05);②注射bFGF组较本组假手术组及溶媒对照组心肌早期转录基因NKx2-5和GATA-4的表达升高,但Wistar大鼠bFGF组NKx2-5和GATA-4的表达升高更明显.结论 提示bFGF可促进梗死心肌愈合和促进NKx2-5和GATA-4的表达,但在糖尿病环境下,bFGF的作用有所减低.同时显示bFGF可能是通过刺激心肌细胞的再生,从而达到改善心肌结构的目的.
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外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化
目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用.方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确.将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d.以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达.结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化.
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NKX2-5基因与先天性心脏病的关系
目的:探讨NKX2-5基因与先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)的关系. 方法:收集13()例无血缘关系的CHD患者的临床资料和血标本,以100名无血缘关系的健康者为对照.应用聚合酶链反应扩增CHD候选基因NKX2-5的全部外显子和外显子两侧的部分内含子,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序.将所测的序列与GenBank数据库中公布的NKX2-5基因序列进行比对以识别出NKX2-5基因变异.比较识别出的NKX2-5基因多态在CHD患者和健康对照者间的频率分布差异. 结果:在CHD患者的NKX2-5基因识别出2个单核苷酸多态,一个是NKX2-5基因编码序列第63位的腺嘌呤(A)变为鸟嘌呤(G),即C.63A>G多态;另一个是NKX2-5基因编码序列第606位的G变为胞嘧啶(C),即c.606G>C多态.在NKX2-5基因第606位点的等位基因G、C及其构成的3种基因型GG、GC、CC在CHD患者和健康对照者间的频率分布有显著性差异(等位基因频率比较:X2=4.125,P=0.042;基因型频率比较:X2=4.279,P=0.039).但在NKX2-5基因第63位点的等位基因A、G及其构成的3种基因型AA、AG、GG在CHD患者和健康对照者间的频率分布无显著性差异(等位基因频率比较:X2=0.704,P=0.402;基因型频率比较:X2=0.626,P=0.429). 结论:NKX2-5基因C.606G>C多态可能与CHD有关,等位基因606C携带者可能对CHD的易感性增加.
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同源盒基因Nkx2-5促进5-氮胞苷诱导的单层P19细胞表达心肌标志物
目的:探讨同源盒基因Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层生长的P19细胞向心肌细胞分化中的作用.方法:以稳定表达Nkx2-5的P19细胞为实验组,P19细胞为对照组.两组细胞均单层培养并以5-aza(1μmol/L)诱导,倒置显微镜下观察细胞的生长状态;在诱导后4、8、12、16 d,以RT-PCR检测转录因子GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和心房利钠多肽(ANP)基因的表达.结果:对照组经5-aza诱导后ANP没有表达;GATA-4在8、12、16 d有表达;α-MHC在12、16 d有表达.实验组5-aza诱导后,GATA-4在诱导4、8、12、16 d有表达;α-MHC和ANP都是在5-aza诱导后的8、12和16 d表达.两组结果比较显示实验组GATA-4和α-MHC基因的表达时间提前;两组除α-MHC在12 d的表达无差异外,其他取材时间点实验组两个基因的表达量与对照组相比均增高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).结论:Nkx2-5促进5-aza诱导的单层生长的P19细胞向心肌分化.
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急性心肌缺血对骨髓Nkx2-5+心脏祖细胞的动员作用
骨髓源性Nkx2-5+心脏祖细胞(bone marrow-derived Nkx2-5+ cardiac progenitor cells)具有高度特异性分化为心肌细胞的潜能,在病理状态下可能参与内源性心肌修复.但在器官缺血、特别在急性心肌缺血病理状态下,该细胞如何被动员的机制尚不清楚.本研究在观察Nkx2-5+心脏祖细胞存骨髓中分布特征的基础上,分析急性心肌缺血对骨髓源性Nkx2-5+心脏祖细胞的动员作用,探讨其细胞动员的可能机制.分别建立小鼠急性心肌缺血及脑、后肢急性缺血动物模型.采用纳米金-银免疫标记透射电镜、免疫荧光标记及分子生物学等检测方法,观察骨髓Nkx2-5+心肌祖细胞的定位及其形态学特征:检测急性心肌缺血后外周血Nkx2-5+细胞比例变化、缺血不同时段骨髓及外周血中Nkx2-5蛋白表达的变化;比较不同器官缺血对Nkx2-5+心脏祖细胞的动员作用;应用SDF-1/CXCR4通路特异性阻断剂AMD3100,分析SDF-1在急性心肌缺血后对Nkx2-5+心脏祖细胞动员作用的影响.结果显示:Nkx2-5+心脏祖细胞呈散在分布于骨髓血窦旁.与对照组相比,急性心肌缺血后,外周血Nkx2-5+心脏祖细胞比例显著增加(P<0.01).心肌缺血早期(1 d),外周血Nkx2-5蛋白表达显著增加(P<0.01),并可持续7 d;而此间,骨髓中Nkx2-5蛋白表达立即升高,随后则降低.应用AMD3100阻断剂后,心肌缺血组外周血Nkx2-5蛋白表达受到明显抑制(P<0.05).脑、后肢缺血后,外周血Nkx2-5蛋白表达显著少于急性心肌缺血组(P<0.01),而与对照组相比无显著筹异.上述结果提示,生理状态下,骨髓中存在Nkx2-5+心脏祖细胞亚群;急性心肌缺血对骨髓Nkx2-5+心脏祖细胞具有显著的动员作用,且该动员作用具有显著的器官特异性,SDF-1/CXCR4通路在该动员作用中发挥了重要的趋化作用.
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心肌急性梗死对骨髓及外周血心肌转录因子Nkx2-5的影响
目的观察小鼠心肌梗死后,骨髓及外周血单核细胞心肌特异性转录因子Nkx2-5的变化.方法用大剂量异丙肾上腺素(10 mg/kg)连续注射3天造成小鼠心肌急性缺血性梗死模型,第3天注射后30 min,通过眼球摘除法取外周血,分离双后肢股骨、胫骨,冲洗骨髓腔得骨髓液,经密度梯度离心分离出骨髓及外周血单核细胞,正常组同心肌缺血梗死组.通过细胞Western blotting分析,比较正常组和心肌梗死组骨髓及外周血单核细胞中心肌特异性转录因子Nkx2-5的变化.结果正常骨髓单核细胞中存在Nkx2-5的表达,正常外周血单核细胞中Nkx2-5无表达;心肌梗死后骨髓及外周血Nkx2-5表达均明显增加,同正常组比较有统计学意义,P<0.05.结论正常骨髓中无需培养或诱导即存在表达Nkx2-5的单核细胞,在心肌急性梗死后向外周血动员增加.
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纳米金-银加强法对骨髓微环境中Nkx2-5+细胞定位的实验研究
目的应用包埋前纳米金-银加强法,电镜观察骨髓微环境中Nkx2-5+细胞并进行形态学分析.方法取BALB/c小鼠双后肢胫骨,脱钙后行冰冻切片,利用1.4 nm超微纳金颗粒标记骨髓纵切面Nkx2-5+的细胞,通过银加强使金颗粒增大,Epon 812树脂包埋,常规超薄切片,电镜下观察.结果免疫金颗粒主要标记Nkx2-5+细胞的胞质,极少数胞核也可见到免疫金颗粒.免疫金颗粒标记细胞均为体积较大的骨髓单核细胞,偶见双核细胞.结论包埋前纳米金-银加强法除可应用于神经系统的研究外,也可应用于骨髓微环境中抗原的精确定位.
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心脏转录因子Nkx2-5、GATA-4真核表达质粒的构建
目的:构建人类心脏特异性转录因子Nkx2-5、GATA-4的真核表达质粒,探讨Nkx2-5、GATA-4在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础.方法:以质粒人脑cDNA为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2-5、GATA-4编码区序列.将真核表达载体pCDNA 3.1-HA、pCDNA 3.1-flag分别和Nkx2-5、GATA-4的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCDNA 3.1-HA-Nkx2-5、pCDNA 3.1-flag-GATA-4,转化至大肠杆菌,质粒抽提后经PCR、双酶切及测序鉴定.结果: 成功设计引物扩增出Nkx2-5、GATA-4基因编码区约1 kbp及1.3 kbp的目的片段,PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2-5、GATA-4基因序列.结论:成功构建了含有Nkx2.5、GATA4的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础.
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Nkx2-5、GATA-4转录因子在心脏发育中的作用
心脏是胚胎发育过程中先形成的器官.导致心脏形成和发育的确切机制目前还不清楚.转录因子以组织特异性和定量的方式调节其它器官形成和发育,从而在胚胎发育过程中起主要的调节作用.转录因子在心脏发育过程中可以调节心肌特异性基因的表达.
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Nkx2-5与窦房结发育及相关转录调控因子
转录因子Nkx2-5与窦房结胚胎发育有关,同时与一系列转录调控因子如Tbx3、Shox2以及Isl1在胚胎发育过程中存在相互关系,微妙调控心脏发育分化.Nkx2-5可抑制Shox2、Tbx3和Isl1表达,Shox2和Tbx3亦可抑制Nkx2-5表达,其间关系复杂.深入了解转录因子与窦房结发育的关系对生物起搏的研究有重要的提示作用.
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Nkx2-5和Sam68在子痫前期胎盘组织中的表达及意义
目的 探讨Nkx2-5和Sam68在子痫前期胎盘组织中的表达及其与围产结局的关系.方法 选取临床确诊的子痫前期孕产妇236例为疾病组,并以择期行剖宫产的正常妊娠晚期孕产妇30例为对照组.在两组新生儿娩出15 min内在母体面取胎盘组织进行Nkx2-5、Sam68和可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)表达水平的检测,统计两组围产儿死亡率,并分析疾病组胎盘组织Nkx2-5和Sam68表达与胎盘组织sFlt-1表达水平和围产结局的关系.结果 疾病组患者围产儿死亡率为6.36％(15/236),高于对照组的0(0/30)(P<0.05).疾病组胎盘组织Nkx2-5、Sam68和sFlt-1 mRNA相对表达量亦均高于对照组(P<0.05).与疾病组围产儿存活者比较,其围产儿死亡者的胎盘组织Nkx2-5、Sam68和sFlt-1 mRNA相对表达量均较高(P<0.05).Logistic相关分析结果显示,子痫前期胎盘组织Nkx2-5和Sam68 mRNA相对表达量与围产儿死亡均密切相关(P<0.05);Pearson线性相关分析结果显示,子痫前期胎盘组织Nkx2-5和Sam68 mRNA相对表达量与胎盘组织sFlt-1 mRNA相对表达量均呈正相关(r=0.886,0.879,P<0.05).结论 Nkx2-5和Sam68在子痫前期胎盘组织中的表达水平较高且与其病情相关因子sFlt-1和围产结局相关,Nkx2-5和Sam68可能参与子痫前期的发生、发展.
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5-氦胞苷诱导外源表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的研究
目的 研究在单层培养条件下,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的可能性和效率.方法 实验分为实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞.2组细胞均在单层培养条件下,以5-aga(1 μmol/L)诱导.倒置显微镜观察细胞的生长状态;诱导4、8、12、16 d,Western blot检测α-fiareomeric actin和cTnT的表达;并用免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT的共表达.结果 实验组和埘照组细胞在5-aza诱导下,生长缓慢,死亡细胞数目增多.随贴壁细胞密度增加,形成类似于聚集体贴壁生长的状态,中心细胞小、密集,周边细胞呈放射状排列,胞体长梭形,伸出突起.实验组诱导8、12、16 d检测到α-sarcomeric actin和cTnT 2种蛋白的表达和共表达,表达量呈增多趋势;诱导12、16 d时α-sarcomeric aetin的表达量与8 d比差异有统计学意义(P<0.01),诱导16 d的表达量与12 d比差异有统计学意义(P<0.01);cTnT在诱导12、16 d的表达量与8 d比差异有统计学意义(P<0.01).对照组没有2种蛋白的表达和共表达.结论 5-aza可诱导单层生长的表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化.
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5-氮胞苷诱导单层P19细胞向心肌分化
目的:研究Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层P19细胞向心肌分化中的作用.方法:实验分实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞.两组细胞均单层培养,以5-aza(1 pxnol/L)诱导,倒置显微镜观察细胞的生长状态;5-aza诱导的4,8,12,16 d,免疫细胞化学检测横纹肌α-actin(α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;取5-aza诱导16 d的细胞透射电镜观察超微结构的变化.结果:实验组5-aza诱导的8,12,16 d检测到α-SA和cTnT的阳性表达,表达量逐渐增多.对照组没有两种抗体的阳性表达;实验组5-aza诱导16 d,电镜观察发现部分相邻细胞分化出细胞连接和心肌发育早期的闰盘结构,胞质中出现密集平行排列肌丝样结构.对照组没有发现分化的细胞.结论:外源表达Nkx2-5基因促进P19细胞单层生长时向心肌分化.
