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电刺激硬脑膜对三叉神经节连接蛋白40表达和痛阈的影响
目的:探讨三叉神经节中连接蛋白40在偏头痛发作中的临床意义.方法:将健康成年SD大鼠随机分为假手术组、对照组、实验Oh组、实验12h组、实验24h组、实验48h组,采用电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜模型.应用免疫荧光和Western blot技术观察各组三叉神经节连接蛋白40表达,应用von frey纤维丝测定大鼠眼周皮肤的痛觉阈值.结果:免疫荧光显示实验Oh组、实验12h组、实验24h组连接蛋白40的表达均高于假手术组、对照组和实验48h组,于12h达表达高峰(P＜0.05).各组左右侧无统计学差异(P＞0.05).Western blot显示实验Oh组、实验12h组、实验24h组连接蛋白40的表达均高于假手术组、对照组及实验48h组(P＜0.05).各组左右侧无统计学差异(P＞0.05),于12h达表达高峰.Von Frey纤维丝测定显示实验组大鼠实验前1h、实验刺激后2h、12h、24h、48h左、右眼周皮肤的痛觉阈值呈先下降后上升的趋势,于12h达低点,48h基本恢复正常.结论:电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜可上调三叉神经节连接蛋白40的表达,降低大鼠面部的痛觉阈值,增强面部的痛觉敏化,表明连接蛋白40在偏头痛的发生及发展中可能起到一定作用.
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雌激素改善高血压靶器官损害与T淋巴细胞连接蛋白40表达的相关性
目的 观察雌激素改善高血压造成的靶器官损害与T淋巴细胞连接蛋白40 (Cx40)表达的相关性.方法 选取16～17周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠,SHR随机分为SHR组和雌激素干预SHR组.测量尾动脉压后,采用苏木素一伊红染色观察大鼠脑基底动脉和肾脏组织的病理学改变,应用流式细胞术检测大鼠外周血中CD4+/CD8+、CD4+ CD25+T淋巴细胞比值以及Cx40在CD4+和CD8+T细胞的表达比例,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清炎症因子的表达.结果 与WKY组相比,SHR组肾脏血管壁增厚,部分血管周围炎性细胞浸润和肾小球萎缩等肾损伤现象明显,雌激素干预组管壁增厚和炎性浸润程度均减弱;与WKY组相比,SHR组大鼠外周血CD4+/CD8+值升高(P＜0.05),CD4+ CD25+T细胞占CD4+细胞比例降低(P＜0.01),雌激素干预组较SHR组CD4+/CD8+值降低(P＜0.05),CD4+ CD25+T细胞占CD4+细胞比例增高(P＜0.05);与WKY组相比,SHR组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞上Cx40表达增高(P＜0.01,P＜0.05),雌激素干预组较SHR组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞上Cx40表达降低(P＜0.05);与WKY组比较,SHR组大鼠血清中白细胞介素(IL)6和肿瘤坏死因子(TNF)α表达升高(P＜0.05,P＜0.01),雌激素干预组较SHR组大鼠血清中IL-6和TNF-α表达降低(P＜0.05),而SHR组大鼠血清中IL-10表达低于WKY大鼠(P＜0.01),雌激素干预组较SHR组IL-10表达升高(P＜0.05).结论 雌激素改善高血压炎症造成的肾脏和脑血管损害可能与其抑制T淋巴细胞上Cx40的表达相关,其可能的机制是雌激素通过下调外周血T淋巴细胞Cx40的表达,抑制细胞间的缝隙连接通讯,进而抑制炎症因子的释放,从而改善高血压造成的靶器官损害.
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风湿性心脏病慢性心房颤动患者界嵴连接蛋白40蛋白和基因转录表达
目的 通过检测风湿性心脏病(风心病)慢性心房颤动(房颤)患者界嵴连接蛋白(con-nexin,Cx)40的蛋白表达、mRNA表达情况,探讨Cx40重构的形式与可能机制.方法 选择风心病二尖瓣病变手术患者20例分为窦性心律(窦律)组10例,心房颤动(房颤)组10例,另取6例非风心病窦律患者作为对照组.换瓣术中剪取界嵴组织约200 mg.采用Western blot蛋白印迹法检测Cx40蛋白表达量;实时荧光定量聚合酶链反应法检测Cx40 mRNA表达水平.结果 (1)风心病慢性房颤组界嵴Cx40蛋白表达水平明显较窦律组和对照组低.(2)3组患者界嵴Cx40 mRNA表达量差异无统计学意义.结论 风心病慢性房颤患者Cx40重构形式是Cx40表达下调;而Cx40重构的具体机制在于转录后水平.
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力竭运动对大鼠心脏窦房结、房室交界区组织结构及连接蛋白40的影响
目的:探讨一次力竭和反复力竭运动后大鼠心传导组织窦房结(SAN)、房室交界区(AJ)的组织结构及连接蛋白40(Connexin 40,Cx40)表达的时相性变化和规律.方法:健康成年雄性SD大鼠90只,分为一次力竭游泳组、反复力竭游泳组及安静对照组.游泳组分别于力竭后即刻、6小时、12小时、24小时取材.采用HE、Msson及免疫组织化学染色和图像分析法,观察大鼠SAN、AJ组织结构及其Cx40的表达.结果:一次力竭和反复力竭两种力竭运动后大鼠SAN、AJ组织出现缺血缺氧和胶原纤维增生等改变;Cx40在力竭运动后失去原有的规律分布,由胞膜转移至胞浆,Cx40积分光密度值有所降低,6小时时降低为显著(P<0.01).结论:一次力竭运动和反复力竭运动可导致心脏窦房结、房室交界区组织结构缺血缺氧性改变,Cx40不仅表达减少,其分布模式等缝隙连接结构功能也发生异常改变,是急性大强度运动后心律失常与心肌微损伤发生的重要机制.
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抑制ERK1/2通路激活改善大鼠心房纤维化和缝隙连接蛋白40重构
目的 探讨ERK1/2通路抑制剂U0126对盐酸异丙基肾上腺素(ISO)诱导的大鼠心房纤维化和缝隙连接蛋白40(Cx40)重构的影响.方法 将32只雄性SD大鼠随机等分为空白对照组、DMSO组、ISO[5 mg/(kg·d)]+DMSO组(模型组)和ISO[5 mg/(kg·d)]+U0126[0.5 mg/(kg· d)]+DMSO组(干预组).每组1次/d给予相关试剂,连续7d后处死大鼠并取心肌组织.用放射免疫法测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量；H-E和Masson染色法观察心肌纤维化程度；免疫组化法测定磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2 (p-MEK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2( p-ERK1/2)以及Cx40的表达.结果 (1)空白对照组[(242.133±4.870) ng/L]与DMSO组[(239.412±1.795)ng/L]的AngⅡ含量差异无统计学意义,而模型组[(500.250±8.869)ng/L]和干预组[(498.695±9.340)ng/L]的AngⅡ含量较空白对照组与DMSO组均升高,差异有统计学意义(P均＜0.01).(2)空白对照组与DMSO组无心房纤维化,而干预组心房纤维化程度较模型组减弱(P＜0.01).(3)空白对照组与DMSO组中p-MEK1/2和p-ERK1/2的含量差异无统计学意义,模型组中两者含量较空白对照组与DMSO 组均增加(P均＜0.01),干预组中两者含量与空白对照组和DMSO组比较差异均无统计学意义,而与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01).(4)空白对照组与DMSO组中Cx40含量差异无统计学意义且呈线性分布于心肌细胞闰盘处,模型组中Cx40含量较空白对照组和DMSO组均减少(P均＜0.01)且分布无规律性,而干预组中Cx40含量与空白对照组和DMSO组比较差异均无统计学意义且部分呈线性分布于心肌细胞闰盘处；干预组中Cx40含量减少程度较模型组减弱(P＜0.01),且部分呈线性分布于心肌细胞闰盘处.结论 心肌组织中AngⅡ含量长期升高可能参与了心房纤维化的形成和Cx40重构,U0126通过抑制ERK1/2通路激活可有效改善心房纤维化程度和Cx40重构.
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风湿性心脏病心房颤动心房肌缝隙连接蛋白40和43 mRNA表达水平的变化
目的:测定风湿性心脏瓣膜病(风心病)心房颤动(Af)心房肌缝隙连接蛋白(Connexin)40(Cx40)和Connexin43(Cx43) mRNA表达水平的变化.方法:11例风心病患者[Af 8例,窦性心律3例;男4例,女7例;平均年龄(50.8±13.7)岁;平均Af时间(5.6±6.5)年]的右心耳心肌1小块,提取所有标本的总RNA,等量转移至尼龙膜上,用PCR合成的特异cDNA探针,标记上放射性同位素(α-32P-dCTP)后与尼龙膜杂交,然后将杂交膜与X光胶片行放射自显影,在灰度扫描仪下得到每例标本mRNA 水平的灰度值,为了进一步矫正转膜时可能的定量不统一,将同1块杂交膜先后与Cx40探针、Cx43探针和内参照β-actin杂交,以Cx40/β-actin和Cx43/β-actin的百分比作为统计变量进行分析.结果:在Af与窦性心律标本中,Cx40和Cx43 的mRNA 表达量未发生明显改变(P>0.05).结论:在风心病Af患者中,未发现缝隙连接蛋白Cx40和Cx43的mRNA表达量明显改变.
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创伤性急性肺损伤时兔肺微血管内皮细胞Cx40调控内皮细胞通透性的研究
目的 观察创伤性急性肺损伤(ALI)兔血清对肺微血管内皮细胞连接蛋白40(Cx40)表达和间隙连接通道(GJC)功能的影响,及后者与内皮细胞单层通透性的关系.方法 组织块贴壁法分离、培养兔肺微血管内皮细胞.细胞分为3组,对照组、创伤血清处理组和阻滞剂组.在阻滞剂组,细胞GJC阻滞剂1-庚醇(0.5 mmol/L)加入到培养液中.1 h后,阻滞剂组和创伤血清组的20%胎牛血清的培养液均被更换为含有20%创伤血清的培养液.对照组则只更换培养液.3组细胞继续孵育6 h后,进入实验观察.分别行划痕实验、Cx40蛋白免疫印迹、单层细胞通透性和细胞内Ca2+钙浓度检测.结果 Cx40蛋白印迹见创伤血清组与阻滞剂组蛋白表达水平较对照组有明显降低,且2组之间亦不同,阻滞剂组蛋白水平较创伤血清组低,吸光度和值减少(对照组726293.2±83 684.1,创伤血清组397 798.1±87 145.7,阻滞剂组316977.6±76 325.9,n=4,P＜0.05).3组细胞划痕边缘的细胞均被染料荧光黄(LY)染色,LY在对照组细胞扩散得远,显色的周边细胞的数量多,创伤血清组次之,阻滞剂组显色的细胞数量少,相邻细胞与边缘细胞比值的差异有统计学意义(23±5、11±3比7±2,n=4,P＜0.05).3组细胞伊文思蓝清除率均随着时间的延长而增加,且3组细胞间亦有不同,阻滞剂组清除率高于创伤血清组和对照组.组间差异和时间点差异均有统计学意义(P＜0.05).通过共聚焦显微镜的观察,3组细胞荧光强度不相同,阻滞剂组荧光强,对照组弱.创伤血清组和阻滞剂组细胞内Ca2+浓度均显著高于对照组[(494.80±41.94)、(569.80±6.70)nmol/L比(158.80±13.09)nmol/L,P＜0.05].结论 创伤性ALI动物血清抑制肺微血管内皮细胞Cx40表达,进而引起GJC功能下降,导致肺血管内皮细胞单层通透性增加,该机制可能参与了胸部创伤后肺血管通透性增加的形成,促进了伤后急性肺损伤的发病.
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新疆哈萨克族人群缝隙连接蛋白40基因多态性与原发性高血压的关系
目的：研究新疆哈萨克族原发性高血压（essential hypertension， EH）患者缝隙连接蛋白40（connexin， Cx40）基因多态性位点-44G＞A、＋71A＞G与EH的关系。方法：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性对新疆哈萨克族130名EH患者及150名正常对照组进行基因分型。结果：-44G＞A位点EH组基因型AA、AG、GG和等位基因A、G频率分别为5．38％、40．0％、54．62％和25．38％、74．62％，EH组与对照组差异无统计学意义（P＞0．05）；＋71A＞G位点EH组基因型AA、AG、GG和等位基因A、G频率分别为54．62％、40．0％、5．38％和74．62％、25．38％，EH组与对照组差异无统计学意义（P＞0．05）。结论：新疆哈萨克族人群Cx40基因的多态位点-44G＞A、＋71A＞G可能与EH无关。
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阿托伐他汀对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞缝隙连接的影响
目的:研究阿托伐他汀对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)连接蛋白(Connexin) 43、Connexin 40表达的影响.方法:将体外培养的HUVECs分为对照组、ox-LDL组、阳性对照组和阿托伐他汀组,除对照组外,其余组分别先在培养液、加入50 μmol/L庚醇的培养液、加入不同剂量(0.01、0.1、1.0、10 μmol/L)阿托伐他汀的培养液中处理30 min,再分别加入50 mg/L的ox-LDL继续培养24 h.采用硝酸还原酶法测定各组NO浓度,免疫细胞化学法测定Connexin 43蛋白定位表达,蛋白印迹法检测Connexin 43、Connexin 40蛋白定量表达.结果:与对照组比较,其余各组NO浓度均明显减少、Connexin 43和Connexin 40蛋白定量表达均明显增加(P均＜0.01),其中除阳性对照组和10 μmol/L阿托伐他汀组外,剩余各组均有Connexin 43蛋白定位表达.与ox-LDL组比较,阳性对照组NO浓度明显增加、Connexin 43和Connexin 40蛋白定量表达明显减少(P＜0.05或P＜0.01),阿托伐他汀组随剂量增加NO浓度逐渐增加、Connexin 43和Connexin 40蛋白定量表达逐渐减少(P＜0.05或P＜0.01).与阳性对照组比较,10 μmol/L阿托伐他汀组上述指标均无统计学差异(P＞0.05).结论:阿托伐他汀呈剂量依赖性抑制ox-LDL诱导的HUVECs中Connexin 43、Connexin 40蛋白的增加,保护内皮间缝隙连接,从而发挥他汀类药物调脂外的抗动脉粥样硬化作用.
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大鼠BMSCs体外诱导培养后连接蛋白40及超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4表达的初步研究
目的 观察大鼠BMSCs与窦房结组织块混合诱导培养后连接蛋白40 (connexin 40,Cx40)及超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4,HCN4)的表达情况,探讨大鼠BMSCs向窦房结细胞诱导分化的可能性. 方法 4～6周龄SD大鼠20只,雌雄不限,体重200～300 g.取6只SD大鼠,采用贴壁筛选法分离BMSCs,取第3代细胞以羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯标记后,接种于6孔培养板内,同时制作细胞爬片.取14只SD大鼠窦房结组织,剪成0.3 cm×0.3 cm大小组织块,与标记后的第3代BMSCs混合培养,作为实验组；对照组仅单独培养第3代BMSCs.对照组培养1周及实验组混合培养1、2、3周,采用免疫组织化学方法检测Cx40和HCN4表达,并采用Image pro plus 5.0图像分析软件检测各组细胞表达Cx40和HCN4的平均积分吸光度值(mean integrated absorbance,MIA)；采用实时荧光定量PCR检测细胞Cx40及HCN4 mRNA表达水平. 结果 免疫组织化学染色检测示,实验组混合培养1、2、3周,Cx40和HCN4 MIA值均显著高于对照组(P＜0.01)；且实验组随培养时间延长,Cx40和HCN4 MIA值均逐渐增加,各时间点间差异均有统计学意义(P＜0.05).实时荧光定量PCR检测示,实验组混合培养后1、2、3周,Cx40和HCN4 mRNA表达水平均显著高于对照组(P＜0.01)；实验组随培养时间延长,Cx40和HCN4 mRNA表达水平均逐渐增加,各时间点间差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 将大鼠BMSCs与窦房结组织块体外混合培养,诱导后细胞高表达Cx40及HCN4,具有向窦房结细胞分化的可能.
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粉防己碱防止家兔快速心房起搏间隙连接蛋白40降解
目的: 观察家兔快速心房起搏所致的心房肌间隙连接蛋白40(Connexin 40, Cx40)的改变及粉防己碱(tetrandrine)的防治效果. 方法: 32只家兔随机分为3组:正常对照组(n=8),快速心房起搏组(n=12)、粉防己碱组(n=12). 经颈内静脉将电极置入右心房,后两组以600次/min行快速心房起搏,同时粉防己碱组于快速起搏前30 min按每小时30 mg/kg静脉给药,另两组给等容量的生理盐水. 连续刺激8 h后开胸取右心耳组织,分别用生化方法检测心肌细胞内Na+, K+和Ca2+水平,用Western blot检测Cx40含量,用透射电镜观察超微结构. 结果: 快速心房起搏组心肌细胞内Na+, Ca2+水平增加,而Cx40含量降低(P<0.01),心房肌细胞损伤的超微结构变化明显. 粉防己碱组心肌细胞内Na+, Ca2+水平降低,Cx40的降解和心房肌细胞损伤的超微结构变化减轻. 结论: 钙超载至少部分参与了持续快速心房起搏引起的Cx40降解. 粉防己碱能防止快速心房起搏引起的Cx40的降解,对快速起搏造成的心肌细胞损伤有保护作用.
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心脏性猝死病人心肌组织CX43和CX40的表达
目的 观察心脏性猝死病人左、右心室肌及室间隔肌缝隙连接蛋白43(CX43)及缝隙连接蛋白40(CX40)的表达,探讨CX43、CX40表达与心脏性猝死的关系.方法 应用免疫组化及Simple PCI 图像分析系统,分析比较心脏性猝死与非心脏性猝死病人心室肌及室间隔肌CX43、CX40的表达,并用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析.结果 非心脏性猝死病人CX43、CX40主要表达于心肌细胞闰盘处,少数表达于细胞侧面连接及胞浆中.心脏性猝死病人CX43、CX40多数弥散于胞浆及细胞侧面连接处,表达于闰盘的数量减少.心脏性猝死病人CX43在左心室、室间隔及右心室的表达明显低于对照组(t=2.09～8.01,P均<0.05);心脏性猝死病人CX40在左心室、室间隔及右心室的表达也明显低于对照组(t=3.24～9.40,P均<0.05).结论 CX43、CX40表达部位的改变与表达数量的减少,可能与心脏性猝死有一定关系.
