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不同浓度钙蛋白酶抑制剂ALLN对C2C12成肌细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察不同浓度的钙蛋白酶抑制剂ALLN对C2C12成肌细胞增殖和凋亡的影响.方法 Ca2+和ALLN干预C2C12细胞后,采用噻唑蓝法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况,采用Giemsa染色观察细胞形态.结果 0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mmol/L Ca2+干预C2C12细胞72h的吸光度(A)值显著低于对照组(均P ＜0.05);16 mmol/L的Ca2+和ALLN干预6、12、24、36 h后,ALLN1～7组(含16 mmol/L Ca2+和ALLN终浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L的无血清培养基)A值均显著高于Ca2+组(干预6 h:0.449 ±0.024、0.472 ±0.022、0.513 ±0.008、0.540±0.014、0.588 ±0.016、0.607 ±0.030、0.700 ±0.020比0.355±0.012,P值均为0.000;干预12 h:0.407±0.007、0.414±0.006、0.434 ±0.004、0.441 ±0.003、0.460 ±0.010、0.484 ±0.006、0.525±0.006比0.368 ±0.027,P值均为0.000;干预24 h:0.436 ±0.005、0.431 ±0.015、0.441 ±0.006、0.459 ±0.013、0.527 ±0.009、0.581 ±0.005、0.599 ±0.011比0.386±0.007,P值均为0.000;干预36 h:0.464±0.022、0.460±0.018、0.461±0.007、0.434±0.020、0.454±0.028、0.479±0.006、0.524 ±0.011比0.379 ±0.011,P值均为0.000),干预48 ～72 h后差异无统计学意义.36 h时ALLN10、50、100、200 μmol/L组的凋亡率分别为(6.00±1.20)％、(5.02±1.13)％、(4.89±1.11)％、(2.7l±1.15)％,均显著低于Ca2+组(13.70±2.30)％ (P值均为0.000).Giemsa染色显示Ca2+组出现细胞凋亡形态学改变,ALLN组细胞凋亡情况明显改善.结论 16 mmol/L的Ca2+可诱导C2C12细胞凋亡,ALLN可抑制细胞凋亡、促进增殖,该作用呈时间和剂量依赖性.
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“神舟10号”空间飞行对骨骼肌C2C12成肌细胞可塑性的影响
目的 研究空间飞行对骨骼肌C2C12成肌细胞增殖和分化可塑性的影响.方法 利用“神舟10号”飞船(Shenzhou-10,SZ-10)舱内环境,开展空间细胞学实验,并在地面同步模拟空间舱环境进行实验.进行天基与地基实验细胞的同步活细胞影像监测和细胞固定,天基实验细胞返回后与地基细胞同步开展细胞影像与免疫细胞化学的对比分析.结果 1)活细胞影像监测提示,与地基培养细胞相比,天基细胞培养48 h单核细胞(增殖)减少,且96 h仅见地基培养细胞中出现多核肌管(分化).2)免疫细胞化学分析表明,地基细胞48 h增殖标志蛋白MyoD表达显著增加,96 h有所下降,而天基培养细胞MyoD表达均显著减少;3)地基实验中48 h细胞开始融合分化,中间结蛋白Desmin阳性单核细胞数目明显增加,但在分化96 h后,Desmin阳性单核细胞数目减少,而3个核以上的肌管明显粗大且数目较多;而天基细胞48 h虽有Desmin阳性单核细胞,但比地基阳性细胞数目明显较少,分化96 h后肌管融合率(约30％)比地基96 h(约78％)显著减少.结论 空间飞行期间骨骼肌成肌细胞增殖分化的可塑性显著降低,这可能参与了空间飞行中失重性肌萎缩的形成.
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反映成骨细胞特异转录因子Runx2活性的细胞模型构建
目的 构建稳定表达由6OSE2启动子驱动的萤火虫荧光素酶的小鼠C2C12成肌细胞,并筛选出能定量反映Runx2活性的细胞株.方法 双酶切pUC57-6OSE2,获得启动子片段;插入到消化后的pGL4.14,构建真核表达载体;随后将其转染到C2C12细胞中;用潮霉素B筛选获得稳定转染的细胞株C2C12-6OSE2-Luc.将Runx2瞬时转染到该细胞株中,鉴定其对Runx2的响应性.利用不同浓度的IGF-I和BMP2处理,通过Luc报告基因的活性增高,筛选出能够响应BMP2的细胞株.结果 构建了p6OSE2-Luc表达载体,利用p6OSE2瞬时转染C2C12-Runx2细胞的相对荧光素酶活性是同样处置后的C2C12细胞的4倍.通过筛选获得C2C12-6OSE2-Luc细胞株.转染Runx2质粒后细胞的相对荧光素酶活性是转染空载体细胞的7倍.利用荧光素酶活性筛选出一株报告基因活性随BMP2处理增强的细胞株.结论 构建了能定量反映成骨细胞Runx2活性的细胞模型,可以用于进一步Runx2的转录活性及信号传导途径的研究中.
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ShRNA介导的Smad4基因沉默对C2C12成肌细胞纤维化的影响
目的:研究慢病毒介导的Smad4-shRNA对TGF-β1诱导的纤维化进程的影响.方法:(1)设计并选择抑制效能高的Smad4-shRNA,包装生产慢病毒,转染C2C12成肌细胞,并检测转染后细胞的Smad4表达；(2)根据TGF-β1诱导C2C12成肌细胞向成肌纤维细胞分化的模型,以慢病毒介导的Smad4-shRNA转染细胞,将不同处理的细胞分为A、B、C、D四组,分别为C2C12细胞组、TGF-β1诱导组、C2C12细胞转染组和TGF-β1诱导后转染组.通过荧光Realtime-PCR和Westerblot检测各组collagen Ⅰ和α-SMA表达水平.结果:(1)慢病毒介导Smad4-shRNA1转染C2C12细胞后,其Smad4 mRNA和蛋白表达显著低于未转染组(P＜0.05)；(2) TGF-β1诱导组α-SMA和Collagen Ⅰ mRNA及蛋白表达均显著高于C2C12细胞组(P＜0.05);(3) TGF-β1诱导后转染组α-SMA与collagen Ⅰ mRNA及蛋白表达显著低于TGF-β1诱导组(P＜0.05),与C2C12细胞组和C2C12细胞转染组相比则无明显差异(P＞0.05).结论:降低Smad4表达能有效抑制成肌细胞及受TGF-β1诱导成肌纤维细胞的纤维化过程,提示Smad4可能成为拮抗骨骼肌纤维化的靶点.
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保元解毒汤通过细胞因子-泛素-蛋白酶体途径干预癌因性肌管萎缩机制的研究
目的 观察保元解毒汤对癌性环境下C2 C12小鼠成肌细胞分化的影响,探讨其缓解肌肉萎缩的可能机制.方法 先分别用1:2、1:4、1:8的Lewis肺腺癌细胞上清液诱导C2 C12细胞,确定癌因性肌管萎缩模型建立的佳浓度和培养时间.造模成功后,将细胞分为模型组,保元解毒汤高剂量组(125 g/L)、中剂量组(62.5 g/L)、低剂量组(31.25 g/L),光学显微镜下观察肌管形成情况;ELISA法检测C2 C12细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)含量;Western blot、Real-Time PCR法检测肌肉萎缩盒F蛋白(Atrogen-1)和肌肉特异性环指蛋白1(MuRF-1)的表达.结果 1:2的Lewis肺腺癌细胞上清液诱导C2C12细胞96 h,TNF-α和IL-6含量明显增多,为构建癌因性肌管萎缩模型的佳条件.高、中、低剂量的保元解毒汤干预后,肌管横径增加(P<0.05);上清液中TNF-α和IL-6含量减少(P<0.05),Atrogin-1和MuRF-1蛋白及mRNA表达下调(P<0.05).结论 保元解毒汤可能通过降低细胞因子含量,抑制泛素-蛋白酶体途径(UPP),减少肌蛋白分解而改善癌因性肌管萎缩.
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周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的影响
背景：在力学刺激下，肌肉组织发生改建，其中的成肌过程是一个多阶段的发育过程，细胞外基质的许多信号参与了成肌过程，其中力学信号是肌肉形成和再生的重要外界因子。目前国内外有许多关于周期性张应力刺激成肌细胞凋亡和增殖的报道，但是力学刺激在成肌作用中的具体机制目前还明确。
目的：探讨周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的作用及影响机制。
方法：采用FX4000T应力加载系统对体外培养的C2C12成肌细胞施加10%的周期性张应力，分别作用6，12，24 h。
结果与结论：MTT结果显示，随着加力时间的延长C2C12成肌细胞的增殖情况及S期的细胞周期率逐渐增加，在应力作用12 h时增殖效果明显(P<0.05)，随后开始降低。Western blot检测显示，C2C12成肌细胞中核转录因子κB蛋白的表达随加力时间增加而不断减少，加力24 h时表达量又开始上升。结果提示，周期性张应力可以诱导C2C12成肌细胞增殖，能够改变其细胞周期，核转录因子κB可能也参与了此调节过程。 -
脉冲电磁场对C2C12成肌细胞增殖影响的实验研究
目的:研究不同强度脉冲电磁场干预对成肌细胞增殖的影响.方法:10Hz脉冲低频电磁场刺激经复苏后培养贴壁良好的C2C12成肌细胞,根据不同磁场强度和作用时间将其分为A、B、C组,无磁场干预的为对照组.采用RT-qPCR检测不同磁场强度下成肌细胞标记基因Myf5、MyoD及Pax7的mRNA的表达.结果:经RT-qPCR检测三种基因的表达情况,Myf5 mRNA在1.5 mT磁场强度下照射第五天表达高;0.5 mT磁场强度下Myf5 mRNA的表达与对照组相比无统计学意义(P＞0.05);1.0 mT磁场强度下Myf5 mRNA表达与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);1.5 mT磁场强度下Myf5 mRNA表达与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).对照组MyoD mRNA的表达要比磁场作用下表达要高.三个磁场强度下MyoD mRNA表达与对照组相比均无统计学意义(P＞0.05).0.5 mT、1.0 mT磁场强度下Pax7 mRNA的表达要比对照组要高,与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05);1.5 mT磁场强度下Pax7 mRNA表达与对照组相比无统计学意义(P＞0.05).结论:1.5 mT脉冲电磁场强度下作用5天对体外培养的成肌细胞Myf5 mRNA标记基因增殖促进作用强.
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人参皂苷Rg1对体外培养C2C12成肌细胞凋亡的影响
目的:研究人参皂苷Rg1对体外无血清诱导培养的C2C12成肌细胞凋亡的影响及其可能机制.方法:采用MTT法、人参皂苷Rg1处理48 h后hoechst 33258-PI染色,以及RT-PCR方法观察不同浓度人参皂苷Rg1对C2C12成肌细胞凋亡的影响.结果:MTT法结果显示人参皂苷Rg1处理48 h后可抑制C2C12成肌细胞凋亡；Hoechst 33258-PI染色可见C2C12成肌细胞凋亡率人参皂苷处理前后差异有统计学意义,人参皂苷处理后C2C12成肌细胞凋亡率显著下降；RT-PCR法结果显示人参皂苷Rg1可抑制Caspase-3、Bax和AIF mRNA表达,并能诱导Bcl-2 mRNA表达.结论:人参皂苷Rg1对C2C12成肌细胞凋亡具有保护作用.
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1,25羟活性维生素D3对白细胞介素-6作用下肌原细胞增殖和分化的影响
目的 探讨1,25羟活性维生素D3(1,25-D3)对白细胞介素-6(IL-6)刺激下肌原细胞增殖和分化的影响及其机制.方法 体外培养小鼠C2C12肌原细胞株,以2％马血清使细胞分化为肌索,给予IL-6和1,25-D3刺激细胞,观察细胞增殖情况和肌管形态.采用Western印迹法检测维生素D3受体(VDR)、生肌分化因子D(MyoD)、肌细胞生成素(myogenin)和肌动蛋白重链(MHC)的蛋白表达量;采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测肌肉生长抑制素(myostatin)和肌萎缩Fbox-1蛋白(Atrogin-1)、MyoD和肌细胞生成素mRNA的转录水平.结果 倒置相差显微镜下见C2C12细胞呈梭形贴壁生长,增殖迅速;以2％马血清分化培养72 h后,细胞可形成条索状肌管.以20 ng/mL IL-6刺激的细胞在培养48 h内增殖较迅速,此后增殖缓慢;分化培养后的细胞融合形成的肌索较纤细且稀疏,直径明显缩短;以100 ng/mL IL-6刺激的细胞在培养72 h后有较多细胞发生脱落坏死,分化培养后的细胞形成的肌纤维极少且纤细.与对照组比较,IL-6+1,25-D3组的VDR和1,25-D3组的VDR、MyoD、肌细胞生成素、MHC的相对表达量均显著升高(P值分别＜0.01、0.05),IL-6+1,25-D3组MHC和IL-6组MyoD、肌细胞生成素、MHC的相对表达量均显著降低(P值分别＜0.05、0.01).与1,25-D3组比较,IL-6+1,25-D3组MyoD、肌细胞生成素、MHC和IL-6组VDR、MyoD、肌细胞生成素、MHC的相对表达量均显著降低(P值分别＜0.01、0.05).与IL-6组比较,IL-6+1,25-D3组VDR、MyoD、肌细胞生成素、MHC的相对表达量均显著升高(P值分别＜0.01、0.05).与对照组比较,1,25-D3组MyoD mRNA表达显著升高(P＜0.05),肌肉生长抑制素mRNA表达显著降低(P＜0.05);IL-6组MyoD和肌细胞生成素mRNA表达均显著降低(P值均＜0.01),肌肉生长抑制素和Fbox-1蛋白mRNA表达均显著升高(P值分别＜0.01、0.05);IL-6+1,25-D3组肌细胞生成素mRNA表达显著降低(P＜0.05),肌肉生长抑制素mRNA表达显著升高(P＜0.01).与1,25-D3组比较,IL-6+1,25-D3组MyoD mRNA表达显著降低(P＜0.01),肌肉生长抑制素mRNA表达显著升高(P＜0.05);IL-6组MyoD和肌细胞生成素mRNA表达均显著降低(P值均＜0.01),肌肉生长抑制素和Fbox-1蛋白mRNA表达均显著升高(P值分别＜0.01、0.05).与IL-6组比较,IL-6+1,25-D3组MyoD和肌细胞生成素mRNA表达均显著升高(P值均＜0.01),肌肉生长抑制素和Fbox-1蛋白mRNA表达均显著降低(P值分别＜0.01、0.05).结论 1,25-D3可使肌细胞VDR表达水平上调,促进肌细胞分化,使肌纤维增粗肥大,抑制IL-6作用下的肌萎缩;该作用与抑制肌肉生长抑制素mRNA转录,促进成肌分化分子MyoD、肌细胞生成素表达有关.
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Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖与分化作用的初步研究
目的 初步探讨Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖分化的影响.方法 体外培养C2C12成肌细胞系.实验第一步分三组:A组:正常对照组,B组:1μM Reversine处理12h组,C组:1μMReversine处理24 h组.上述三组用Annexin-V/PI双染法处理C2C12成肌细胞并用流式细胞仪技术检测三组C2C12细胞凋亡的影响;实验第二步分五组:D组:正常对照组,E组:单独1 μM Reversine处理7d,F组:单独成骨诱导7 d,G组:1μM Revemine诱导12h+单独成骨诱导7d,H组:1μM Reversine诱导12h+1μM Reversine联合成骨诱导7 d.上述五组光镜下观察细胞形态的变化,并通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测五组C2C12成肌细胞分化抑制因子(ID2),肌肉发生调节因子(Myogenin),生肌因子后结蛋白(Desmin)mRNA的表达.结果 与A组相比,C组1μM Reversine处理24h能引起C2C12细胞明显的凋亡,B组1μM Reversine处理12 h的C2C12细胞未见明显的凋亡.与D组相比,E组和H组的细胞增殖明显受到抑制,F组和G组细胞逐渐增殖并融合.结论 Reversine能够显著的抑制成肌细胞的增殖分化过程.
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失神经萎缩肌组织成分对成肌细胞性能影响的实验研究
目的:探讨长期失神经萎缩骨骼肌组织成分对体外培养成肌细胞的性能影响.方法:①获取长期失神经支配肌萎缩模型大鼠的腓肠肌,无菌条件下清洗、剪碎、匀浆、过滤,收集上清液;②收集Schwann细胞的体外培养基;③体外培养C2C12成肌细胞系,扩增传代并分组:A.对照组,常规培养,无任何处理因素;B.添加Schwann细胞培养基;C.添加萎缩肌匀浆液.倒置显微镜观察3组细胞的形态特征,免疫荧光检测C2C12细胞MyoD和Myogenin的差异表达.结果:倒置显微镜下,各组细胞贴壁良好,A、C组形态无差异,未见分化肌管;B组于培养48h后细胞变纤细,可见肌管形成.荧光染色证实,培养24h后,3组均出现MyoD阳性细胞,C组阳性细胞数量明显多于A、B组;72h时,3组均可见Myogenin阳性细胞,B组阳性细胞数量明显多于A组,C组阳性细胞数量稀少.结论:长期失神经萎缩肌组织成分能够促进成肌细胞的增殖与活化,但抑制活化成肌细胞的进一步分化成熟.
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周期性机械拉伸对C2C12成肌细胞增殖的影响
目的:探讨不同的周期性拉伸应变条件对C2C12成肌细胞增殖的影响.方法:周期性拉伸的各种力学条件通过BioFlex加载系统实现,采用应用流式细胞术和BrdU法对拉伸应变下的细胞增殖动力学变化进行分析,反映成肌细胞增殖情况.结果:不同的周期性机械拉伸条件影响C2C12细胞的增殖,拉伸的频率对C2C12细胞增殖有较大的影响.在0.5Hz拉伸频率下,2.5%、5%和10%的细胞变形幅度都不能促进细胞的增殖,其中10%(0.5Hz)的拉伸幅度抑制C2C12成肌细胞的增殖;而在0.125Hz拉伸频率下,10%的细胞变形幅度明显地促进C2C12成肌细胞的增殖.结论:较低的拉伸频率有利于成肌细胞的增殖,高频率的拉伸抑制成肌细胞的增殖.
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不同频率周期性应力加载对体外多层肌管极性及分化的影响
目的 探讨不同频率的周期性应力加载对体外培养多层肌管极性与分化的影响,筛选优化的肌组织体外应力加载培养条件. 方法 体外培养C2C12成肌细胞于Sylgard 184铸型凹槽诱导分化形成多层肌管组织,采用自制体外细胞拉伸仪,对培养并分化的肌管进行间歇性应力加载:加载幅度10％,加载频率分别为0(A组)、0.25(B组)、0.50(C组)、1.00 Hz (D组),加载时间3次/d,每次1h.连续加载5、7、10 d时,观察各组肌管形态；RT-PCR和实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,QRT-PCR)分析检测成肌相关基因成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)、肌细胞生成素(Myogenin)、结蛋白(Desmin)、肌球重链蛋白(myosin heavy chain,MyHC) mRNA的表达差异. 结果 倒置相差显微镜观察示,应力加载促进各组肌管的极性融合及数量增加,其中B组加载培养7d时,多层肌管排列紧密,极性显著.加载条件能促进成肌相关基因mRNA的表达:组内随加载时间延长,各组MyoD的mRNA表达逐渐下降,7、10d与5d比较差异均有统计学意义(P＜ 0.05); Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表达呈先升高后降低趋势,以7d表达量高;B组除7d与10d Desmin的mRNA表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点比较差异均有统计学意义(P＜0.05).同时间点随加载频率增加,MyoD、Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表达呈先升高后降低趋势,以B组表达量高；除5dB、C组Desmin和10dA、B组MyHC的mRNA表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各组与B组各相关基因mRNA表达比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 低频(0.25 Hz)、适时(7 d)的周期性应力加载有利于生长于Sylgard 184弹性材料表面的多层肌管极性分化,但随着应力加载时间延长,肌管的老化加速.
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香烟烟雾提取物下调小鼠C2C12成肌细胞组蛋白去乙酰化酶2表达并增强炎性细胞因子释放
目的 观察香烟烟雾暴露后,小鼠C2C12成肌细胞内炎症介质、组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)和核因子κB(NF-κB)的变化.方法 培养小鼠C2C12成肌细胞,用香烟烟雾提取物(CSE)进行处理.采用MTT法观察CSE对细胞生长的影响,以确定作用于细胞的合适浓度.将培养6～7d的C2C12细胞接种到6孔板,分为对照组和(6.25、12.50、25.0) mL/L CSE组,培养24h.ELISA测定各组细胞上清液白细胞介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;实时定量PCR (qRT-PCR)检测各组细胞HDAC2 mRNA的表达;Western blot法检测各组细胞中HDAC2的蛋白相对表达量;免疫共沉淀技术检测细胞内HDAC2/NF-κB复合物.结果 MTT结果提示终浓度为50 mL/L的CSE抑制C2C12细胞的生长;CSE刺激24h后,C2C12细胞IL-8和TNF-α释放增加,HDAC2的mRNA及蛋白相对表达量减少,并在一定程度上具有浓度依赖性;免疫共沉淀技术证实存在HDAC2/NF-κB复合物.结论 CSE下调C2C12细胞HDAC2表达,引起炎症因子释放增加.
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力学信号的拮抗剂或激动剂对体外培养的C2C12成肌细胞自身抗原相关因子表达的影响
目的 探讨力学信号的拮抗剂或激动剂对体外培养的C2C12成肌细胞自身抗原表达的影响.方法 根据不同的处理方法将C2C12细胞分成对照组、EGTA、A23187、钙调蛋白抑制剂calmidazolium chloride、钙调蛋白(calmodulin)、一氧化氮合成酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、硝普钠(SNP)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-2抑制剂1、重组肝细胞生长因子(HGF)、抗HGF抗体、肝细胞生长因子受体C-met和抗C-met处理组.用Western blot法检测不同处理条件下NuRD脱乙酰酶复合物可重构成分(Mi-2)、组氨酰-tRNA合成酶(HRS)、DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)和Ku-70蛋白的表达变化.结果 与对照组相比,A23187、calmodulin组、SNP、重组HGF组、重组C-met处理后,自身抗原表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),EGTA、calmidazolium chloride、L-NAME、抗HGF兔多克隆抗体、抗C-met兔多克隆抗体处理后,自身抗原蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).MMP-2组的自身抗原蛋白水平表达与对照组相比无显著性差异(P＞0.05).结论 细胞外钙离子和钙调蛋白、L-NAME和SNP、HGF、C-met参与介导成肌细胞自身抗原的表达.
