应用水痘-带状疱疹病毒报告细胞系筛选抗病毒药物的研究

目的 应用构建的水痘-带状疱疹病毒(VZV)报告细胞系MV9G建立一种筛选抗VZV药物的新方法。方法 将VZV疫苗株(vOka)的无细胞病毒液(CFV)直接感染MV9G细胞2h后移除（CFV直接感染法），或将感染vOka株的MeWo细胞（含带细胞病毒，CAV）与MV9G细胞共培养48 h（CAV共培养法），以激发MV9G细胞表达报告基因萤火虫荧光素酶。在培养基中加入肝素、磷酸甘露糖(M-6-P)、阿昔洛韦(ACV)、白藜芦醇、roscovitine等抗病毒药物，通过比较加药前后MV9G细胞荧光素酶活性变化来分析药物对VZV的作用。结果 抗病毒药物各浓度组不同程度地抑制CFV直接感染和/或CAV共培养激发的MV9G细胞荧光素酶活性，荧光素酶活性的降低与平行对照组中病毒蚀斑数的降低一致。抗病毒药物中肝素、M-6-P和roscovitine 2.5 μmol/L组抑制CFV激发荧光素酶的作用强于抑制CAV激发荧光素酶的作用，而ACV和白藜芦醇抑制CAV激发荧光素酶的作用强于抑制CFV激发荧光素酶的作用。ACV抗药株Kanno和rOka YSR的CAV与MV9G细胞共培养均激发其强表达荧光素酶，但ACV抑制抗药株激发荧光素酶50％时浓度(IC50)显著高于抑制敏感株pOka和CaGu的IC50。结论 CFV直接感染法和CAV共培养法分别有助于筛选针对VZV感染早期和后期的药物，利用MV9G细胞建立的报告细胞法可为抗VZV药物筛选和作用机制研究提供一种简便、快速、敏感和高通量的新方法。

Roscovitine抑制HBV复制的机制研究

目的 研究周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制剂Roscovitine抑制HBV复制的分子机制.方法 首先通过构建SAMHD1蛋白dNTPase活性位点及T592磷酸化位点的突变体研究磷酸化负调控抑制作用;接着在肝癌细胞Huh7.0细胞中加入不同浓度的Roscovitine,通过MTT法检测了Roscovitine化合物对细胞毒性的影响;转染HBV复制质粒后,提取病毒核心颗粒DNA,通过Southern blot检测了Roscovitine对HBV的抑制作用,Western blot检测SAMHD1蛋白的磷酸化水平.结果 在增殖细胞中,SAMHD1 蛋白dNTPase活性突变体D207N丧失了对HBV的抑制作用;T592位点的去磷酸化增强了SAMHD1对HBV的抑制作用;Roscovitine的半数毒性浓度(TC50)为11.20 μmol/L,Roscovitine可以显著抑制SAMHD1的磷酸化和HBV的复制.结论 在增殖细胞中,SAMHD1蛋白T592位点的去磷酸化增强了其对HBV的抑制作用,Roscovitine可以通过抑制SAMHD1的磷酸化后抑制HBV的复制.

Roscovitine抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的研究

目的:观察roscovitine对球囊损伤后大鼠颈总动脉血管平滑肌细胞及内膜增生的抑制作用,以期提供新型的支架涂层药物.方法:建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型模拟经皮冠状动脉腔内介入术(PCI)术后再狭窄,干预组损伤局部给予roscovitine(200μmol/L)孵育10分钟.14天后取材,免疫荧光染色观察roscovitine对局部血管平滑肌细胞增殖的作用;HE染色观察roscovitine对内膜增生的作用.结果:本研究建立了大鼠颈总动脉球囊损伤模型,球囊损伤后14天,局部血管平滑肌细胞增殖活跃、内膜增生明显.Roscovitine干预后,血管平滑肌细胞增殖率明显降低,内膜增生被显著抑制,管腔狭窄率和内膜中膜面积比值显著降低.结论:Roscovitine显著抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后局部血管平滑肌细胞增殖,进而有效抑制内膜增生,降低再狭窄发生率.

Traumatic brain injury induces secondary injury that contributes to neuroinlfammation, neuronal loss, and neurological dysfunction. One important injury mechanism is cell cycle activation which causes neuronal apoptosis and glial activation. The neuroprotective effects of both non-selective (Flavopiridol) and selective (Roscovitine and CR-8) cyclin-dependent kinase inhibitors have been shown across multiple experimental traumatic brain injury models and species. Cyclin-depen-dent kinaseinhibitors, administered as a single systemic dose up to 24 hours after traumatic brain injury, provide strong neuroprotection-reducing neuronal cell death, neuroinflammation and neurological dysfunction. Given their effectiveness and long therapeutic window, cyclin-depen-dent kinase inhibitors appear to be promising candidates for clinical traumatic brain injury trials.

人细胞周期蛋白依赖性激酶2与抑制剂roscovitine作用的理论研究

目的:研究人细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)与抑制剂roscovitine相互作用的机制.方法:利用分子动力学模拟的方法研究roscovitine与CDK2之间的相互作用.结果:和空载CDK2相比,roscovitine的存在会使RMSD和RMSF值略微降低,但roscovitine会显著影响CDK2活性位点残基侧链二面角.Roscovitine在分子动力学模拟过程中会与Ile10和Leu83形成稳定的氢键作用.结论:Roscovitine对CDK2骨架运动影响不大,但会使CDK2活性位点残基的侧链构象发生变化.Roscovitine与Ile10和Leu83之间的氢键作用是CDK2对roscovitine进行识别的重要途径.

Roscovitine在衣霉素诱导足细胞损伤中的保护作用

目的 应用衣霉素诱导内质网应激(ERS),观察Roscovtine对ERS导致足细胞损伤的保护作用.方法 体外培养永生化小鼠足细胞,取37℃分化成熟细胞随机分组:(1)正常对照组、DMSO组及衣霉素Tunicamycin(1.0μmol/L,TM)组,各实验组分别刺激3、6、12 h.(2)正常对照组、Tunicamycin(1.0μmol/L,TM)组及Tunicamycin+Rosco-vitine(20、40μmol/L,TM+ROS)组,各实验组分别刺激12 h.应用流式细胞术及TUNEL法检测足细胞凋亡情况;应用Western blot检测细胞周期素依赖性蛋白激酶5(Cdk5)及ERS标志蛋白GRP78、Caspase-12、CHOP的表达变化.结果 (1)与正常对照组和DMSO组相比,Tunicamycin刺激3、6及12 h后,TM组足细胞凋亡率及Cdk5、GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表达水平均呈明显的时间依赖性增高(P<0.05);(2)加入Roscovitine干预后,与TM组相比,TM+ROS(20、40μmol/L)组足细胞凋亡率及GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05),其干预作用呈现明显的剂量依赖性.结论 Cdk5抑制剂Roscovitine能显著抑制衣霉素诱导的足细胞凋亡,从而发挥细胞保护作用.Roscovitine的足细胞保护作用可能有助于糖尿病肾病的治疗.

细胞周期蛋白依赖激酶Roscovitine诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡及制的研究

目的:探讨细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)抑制剂Roscovitine (Ros)诱导非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞凋亡及其作用机制.方法:以不同浓度Ros(10μ M、20μ M、40μ M)处理细胞24h,采用Annexin V-PI染色以流式细胞仪检测细胞凋亡,Westernblot法检测胞浆中和线粒体促凋亡蛋白Bax和Bad的表达,流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP)变化.结果:Ros以剂量依赖的方式诱导A549细胞凋亡,同时Bad和Bax在胞浆的含量随着Ros剂量的增加而减少,而在线粒体中却出现相反的结果,线粒体膜电位随Ros剂量的增大而降低.结论:Ros可通过促进Bax和Bad由胞浆向线粒体易位,诱导NSCLC A549细胞由线粒体途径发生凋亡.

Roscovitine和Mimosine在Fas介导白血病细胞凋亡中的作用及其可能机制

目的:探讨细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)抑制剂roscovitine和DNA合成阻滞剂含羞草碱(mimosine)在Fas介导的白血病细胞凋亡过程中的作用及其可能的机制. 方法:以急性成淋巴细胞白血病细胞Molt-4和急性T细胞白血病细胞Jurkat为靶细胞,用rhFasL、Roscovitine、Mimosine分别单独作用Molt-4细胞18 h(Jurkat细胞8 h)、24 h、24 h,或rhFasL分别与后两者联合作用靶细胞,用流式细胞术检测cyclins的表达和细胞凋亡率,Western blotting法检测CDK2和CDK1的磷酸化水平. 结果:Fas介导的细胞凋亡定位于G1期,Roscovitine和Mimosine作用后均可使Fas介导的细胞凋亡率明显增加(P<0.05).Roscovitine作用后G1期的cyclin D3和cyclin E表达升高,靶细胞被阻滞在G1期的比例明显升高,并下调CDK2 Thr-160位点的磷酸化水平;Roscovitine和rhFasL共同作用后,CDK2 Thr-160位苏氨酸磷酸化水平进一步减弱.Mimosine作用后 cyclin D3的表达下降和CDK2 Thr-160位点磷酸化水平明显下降,靶细胞被完全阻滞在G1期.Mimosine和rhFasL共同作用后cyclin D3、E、A和B1均有所下降,CDK2 Thr-160位苏氨酸和CDK1 Thr-161位苏氨酸的磷酸化水平明显减弱. 结论:Roscovitine和Mimosine均有协同rhFasL促进白血病细胞凋亡的作用,其机制与该两制剂阻滞细胞于G1期、抑制CKD2活性以及影响细胞周期蛋白表达有关.

鞘内注射Roscovitine对小鼠骨癌痛行为学的影响

目的 探讨鞘内给予细胞周期依赖性激酶5(cyclin-dependent kinases,Cdk5)特异性拮抗剂Roscovitine对小鼠骨癌痛行为学的影响.方法 24只C3H/Hej 小鼠采用随机数字表法随机分为3组,S组(假手术后14 d+溶媒)、C组(接种后14d+溶媒)、R组(接种后14 d+Roscovitine),每组8只.C组和R组将含2×105个纤维肉瘤NCTC 2472细胞的小必需培养基(α-MEM)20μl注射到小鼠右侧股骨远端骨髓腔内,制作骨癌痛模型.S组只注入不含肿瘤细胞的α-MEM.术后14 d,R组小鼠鞘内注射含有20μg Roscovitine的二甲基亚砜(DMSO)5μl,C组及S组小鼠鞘内注DMSO 5 μl.观察给药前及给药后1、6、24、48、72 h检测小鼠痛行为学的变化:机械缩足阈值(paw uithdrawal mechanical threshold,PMWT)和热缩足潜伏期(Paw withdrawal thermal latency,PWTL).结果 各组术前基础机械缩足阈值及热缩足潜伏期比较差异无统计学意义(P＞0.05).接种后7 d,C组PMWT(1.08±0.24)g,与S组(1.85±0.28)g相比明显降低(P＜0.05);接种后10 d,C组PTWL(12.7±1.4)s较S组(18.6±2.1)s明显缩短(P＜0.05),C组小鼠的痛行为学随时间逐渐加重,与S组小鼠比较差异有统计学意义(P＜0.05);与C组及给药前基础值相比,鞘内注射Roscovitine 20μg后6 h PMWT(0.70±0.19)g显著增加(P＜0.05),PTWL(14.16±1.07)s显著延长(P＜0.05),并随时间逐渐增加,12 h达大值,后逐渐降低,72 h降低到C组水平.结论 鞘内注射Roscovitine可有效缓解小鼠骨癌痛.

鞘内注射Roscovitine缓解大鼠慢性神经病理性疼痛

目的 在SD大鼠脊髓后根神经节慢性压迫(CCD)模型上观察鞘内注射Roscovitine的镇痛效果.方法 用不锈钢棒(长4 mm,直径0.7 mm)持续件压迫脊髓背根神经节(DRG)建立慢性神经病理性疼痛模型.术后第7天鞘内注射溶解于DMSO 10 μl中的Roscovitine 50 μg(R组);同时设CCD术后第7天只给予鞘内注射二甲基亚砜(DMS0)10 μl的CCD组(C组)和非CCD处理、并给予鞘内注射DMSO 10 μl的假手术组(S组).三组均于CCD术前、术后第7天(给药前)及给药后2、24、72 h榆测机械痛缩足阈值(PWMT)和热痛缩足潜伏期(PWTL).CCD术前及给药后72 h用免疫组化技术检测脊髓背角N-甲基-D天冬门氨酸(NMDA)受体2A亚基(NR2A)的表达水平.结果 R组和C组给药前PWMT均较术前显著降低[(3.64±0.40)g vs.(14.38±1.53)g,(3.50±0.77)g vs(13.25±2.21)g],也明显低于S组的(11.31±1.13)g(P<0.05).R组和C组给药前PWTL均较术前显著缩短[(9.28±1.18)s vs(18.34±1.23)s,(8.91±1.08)s vs.(18.59±1.92)s],也短于S组的(18.45±1.44)s(P<0.05).R组PWMT在给药后24 h较给药前和C组显著增加[(7.32±0.69)g vs.(3.64±0.40)g,(3.86±1.14)g](P<0.05),而给药后2 h PWTL,较给药前和C组显著延长[(15.464±1.51)s vs.(9.28±1.18)s,(9.91±1.07)s(P<0.05).给药后72 h,R组脊髓背角NR2A受体表达水平明显低于C组[(0.21±0.02)vs.(0.26±0.01)](P<0.05).结论 鞘内注射Roseovitine能有效改善CCD大鼠痛行为学反应;其作用可能与抑制脊髓背角NR2A受体表达有关.

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂

目的系统介绍细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的抗肿瘤作用.方法对近几年国外有关CDK抑制剂的发现、构效研究及临床试验等文献进行检索和综述.结果 olomoucine, roscovitine等三取代嘌呤类化合物, flavopiridol及butyrolactone三类化合物具有明显的CDK抑制活性,对多种人类肿瘤均有疗效,且不良反应小.结论细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂有望成为新一代抗肿瘤药.

Roscovitine对TNF-α诱导的 大鼠血管平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响

目的 观察Roscovitine对TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及细胞周期的影响.方法 组织贴块法培养大鼠VSMC细胞,采用TNF-α诱导其增殖,加入不同浓度的Roscovitine预处理15 h,将细胞分为:对照组、TNF-α组、Roscovitine 5、10、15、30μmol·L-1组.MTT比色法检测细胞增殖活性;Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA);流式细胞仪检测细胞周期;荧光定量RT-PCR及Western blot检测细胞周期蛋白(Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E)、细胞周期蛋白依赖激酶(CDK4、CDK5)、细胞周期抑制蛋白(p53、p21、p27)的表达.结果 Roscovitine能抑制VSMC增殖;抑制细胞周期从G0/G1期向S期转化.与TNF-α组比较,Roscovitine 5、10、15、30μmol·L-1组能降低细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E蛋白表达,降低细胞周期蛋白依赖激酶CDK4、CDK5蛋白表达,升高细胞周期抑制蛋白p53、p21、p27蛋白表达(P<0.05).结论 Roscovi-tine可抑制大鼠VSMC细胞周期进程及增殖活性.

Cdk5抑制剂Roscovitine对糖尿病大鼠肾功能及nestin表达的影响

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见的微血管并发症之一.研究显示,足细胞损伤在糖尿病肾病的进展中发挥了重要作用[1-2].Nestin是属于第Ⅵ类中间丝的细胞骨架蛋白,对维持足细胞的形态和功能起着重要作用[3-4].我们前期研究[5-6]表明,高糖刺激的足细胞中,nestin表达降低,与足细胞损伤关系密切;细胞周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)参与了对足细胞nestin表达的调节.本实验拟通过腹腔注射Cdk5抑制剂Roscovitine,从体内进一步观察Cdk5对肾功能及nestin表达的影响,以明确Cdk5的作用机制,为糖尿病肾病的防治提供新思路.

细胞周期素依赖蛋白激酶-5抑制剂Roscovitine对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛行为的影响

目的 探讨预先鞘内注射细胞周期素依赖蛋白激酶-5(Cdk5)抑制剂Roscovitine对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛行为的影响.方法 SD雄性大鼠45只,随机数字表法分成5组(n=9):对照组(C)、切口痛组(Ⅰ)、瑞芬太尼组(R)、Roscovitine组(ROS)、Roscovitine+瑞芬太尼组(ROS+ R).ROS,ROS+R组术前30 min鞘内给予Roscovitine10μl(50μg),余组给予20％ DMSO10μl.除C组外均制作切口痛模型；R和ROS+R组切皮同时皮下泵注瑞芬太尼0.4ml (0.04mg/kg) 30 min.于术前24h、术后2h、6h、24h、48h检测大鼠术侧足底机械缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)和热缩足潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL).结果 与C组相比,Ⅰ组术后PWMT、PWTL明显降低(P＜0.01).与Ⅰ组相比,R组术后PWMT,PWTL明显降低(P＜0.01)；而ROS组术后PWTL明显升高[2h:(20.26±1.33)s,(17.97±0.47) s;48h:(22.15±0.60)s,(19.89±1.27)s] (P＜0.05).ROS+R与R组相比,术后2h PWTL[ (19.13±1.72)s,(14.41±2.30)s]及PWMT[(10.4±1.95)g,(6.38±0.91)g]开始升高,分别持续至48h[(19.24±2.80)s,(14.87±1.95)s]和24h[ (8.88±1.41)g,(6.83 ±0.80)g] (P＜0.05).结论 Roscovitine能减轻大鼠切口引起的热痛敏,并能缓解瑞芬太尼诱发的切口痛大鼠痛觉过敏.

玻璃体腔注射roscovitine对大鼠视网膜中Cdk5/p25活性和tau蛋白磷酸化的抑制作用

背景 视网膜色素变性(RP)与阿尔茨海默病有着共同的发病机制,细胞周期依赖性蛋白激酶(Cdk5)活性及其激活剂参与中枢神经系统的退行性病变.Cdk5抑制剂roscovitine可以抑制Cdk5/p25通路的活性,从而抑制细胞凋亡,但其对RP的影响尚不清楚. 目的 探讨玻璃体腔注射roscovitine对RCS大鼠视网膜组织中p35、p25和tau蛋白表达的影响.方法 12只RCS大鼠于出生后17d右眼玻璃体腔注射4 μlroscovitine作为实验眼,左眼未进行任何干预作为对照眼.分别于注射后8d(出生后25 d)和18d(出生后35 d)用过量麻醉法各处死6只大鼠并分离视网膜,Western blot法检测RCS大鼠视网膜组织中Cdk5、p35、p25蛋白的相对表达水平和tau蛋白磷酸化水平,采用分光光度仪(光谱法)测定大鼠视网膜组织340 nm处的吸光度(A)值,定量分析大鼠视网膜中Cdk5/p25激酶活性,采用配对t检验比较实验眼和对照眼的检测结果.结果 玻璃体腔注射后8d和18d,大鼠实验眼视网膜组织中p35蛋白的相对表达水平分别为1.186±0.019和1.069±0.019,明显低于对照眼的1.364±0.016和1.214±0.008,差异均有统计学意义(t=-6.294、-6.477,均P＜0.05);大鼠实验眼视网膜组织中p25蛋白的相对表达水平分别为0.312±0.009和0.269±0.018,明显低于对照眼的0.595±0.013和0.473±0.011,差异均有统计学意义(t=-36.508、-11.879,均P＜0.05);实验眼与对照眼间大鼠视网膜中Cdk5蛋白的相对表达水平差异均无统计学意义(t=0.213、-0.540,均P＞0.05);实验眼大鼠视网膜组织中tau蛋白磷酸化水平均低于对照眼,差异均有统计学意义(t=-9.854、-6.744,均P＜0.05).玻璃体腔注射后8d和18d,比色定量测定法测得大鼠实验眼视网膜中Cdk5/p25活性分别为(0.003 83±0.000 14)mol/(s·mg)和(0.00201±0.000 11)mol/(s·mg),明显低于对照眼的(0.005 47 ±0.000 27) mol/(s·mg)和(0.003 35±0.000 15) mol/(s·mg),差异均有统计学意义(t=-9.152,P=0.000;t=-9.248,P=0.000). 结论 玻璃体腔注射roscovitine可以在一定程度上抑制RCS大鼠视网膜组织中Cdk5/p25激酶活性及tau蛋白磷酸化水平.

Roscovitine对C型尼曼-皮克病小鼠的神经保护作用

目的观察细胞周期依赖性蛋白激酶特异性抑制剂Roscovitine对C型尼曼-皮克病(NPC)小鼠(npc-/-)的治疗作用.方法采用72、144、300和600 nmol/d的Roscovitine对5周龄的npc-/-小鼠(n=6～10)进行2周侧脑室灌注,以DMSO灌注的同龄npc-/-小鼠(n=6～10)为对照;采用免疫组织化学染色、H & E染色和小鼠衣架悬挂试验来进行检测.结果Roscovitine能显著减少球状轴突的数量,延缓浦肯野细胞的死亡并改善npc-/-小鼠的运动功能.结论Roscovitine对NPC的神经系统变性有一定的保护作用.

嘌呤类CDK抑制剂嘌呤电子等排体研究进展

Roscovtine是人工合成的嘌呤类CDK抑制剂,已进入抗肿瘤临床研究阶段.Roscovitine的发现使得许多研究团队开始关注这类结构,并在此基础上进行了大量的结构优化.已经报道的嘌呤类CDK抑制剂中,仅有6类结构以Roscovitine作为对照进行生物活性研究.其中,吡唑并[1,5-a]-1,3,5-三嗪类、吡唑并[1,5-a]嘧啶类、吡唑并[1,5-a]吡啶类和吡唑并[4,3-d]嘧啶类在生物活性方面有所提高.对这一系列CDK抑制剂的研究进展进行综述,为新型CDK抑制剂的研究提供帮助.

STAT3途径介导roscovitine抑制大鼠血管 平滑肌细胞增殖

目的:探讨roscovitine抑制大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖和信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)途径介导的作用机制.方法:组织块贴壁法培养大鼠VSMC,加入不同浓度的roscovitine预处理15 h后,应用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导其增殖,将细胞分为对照组、TNF-α组及5、10、15和30μmol/L roscovitine+TNF-α组.MTT法和活细胞计数法检测细胞活力和增殖;比色法检测细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量及超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)的活性;real-time PCR及Western blot检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及STAT3表达的变化.结果:Roscovitine能抑制TNF-α诱导的VSMC增殖;降低MDA水平,升高SOD活性;抑制PCNA、cyclin D1和ICAM-1表达;阻断STAT3磷酸化活化及核转位.给予STAT3抑制剂WP1066能阻断roscovitine对VSMC增殖的抑制作用.结论:Roscovitine可通过STAT3途径抑制大鼠VSMC增殖.