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中国莱姆病螺旋体FP1外膜蛋白A的克隆表达及其抗原性的初步研究
目的克隆并表达中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏螺旋体基因种参照菌株FP1的外膜蛋白A(OspA),并对其抗原性进行初步研究和基因序列分析,为研制中国莱姆病疫苗提供资料.方法设计引物,用聚合酶链反应(PCR)从莱姆病螺旋体FP1全基因组DNA中扩增出OspA编码基因,经酶切、连接,插入原核表达载体pET-11d,构成重组质粒pET-11d-ospA,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物用SDS-PAGE、Western blot分析,并进行基因序列测定.结果 rOspA在宿主菌内获得高效、稳定表达;相对分子质量(Mr)约为31×103,Western blot显示其与抗OspA的多抗有良好的免疫反应性;经测序显示该rOspA的基因片段长度为783bp,编码261个氨基酸,与欧洲标准菌株Pko和瑞士标准菌株VS461的OspA的DNA碱基序列比较,同源性均为94%.结论在国内首次成功地对中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏旋体基因种的代表菌株FP1的OspA基因进行了克隆和表达.并且证实rOspA有良好的抗原性,可进一步对其免疫保护性进行研究,以便为研制有效的莱姆病疫苗提供数据.
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中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白A的克隆表达及免疫保护性的初步研究
目的克隆并表达中国莱姆病螺旋体Borrelia garinii基因型代表菌株PD91的外膜蛋白A(OspA),并对其免疫保护性进行初步研究,为进一步研制莱姆病疫苗提供基础. 方法用聚合酶链反应(PCR)从莱姆病螺旋体PD91全基因组DNA中将OspA基因调出,插入原核表达载体P42,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物用SDS-PAGE、Western blot分析,并进行基因序列测定.用重组OspA(rOspA)免疫新西兰家兔,用间接免疫荧光(IFA)检测其血清特异性抗体(IgG),并进行体外中和试验,从而对其免疫保护性有初步的了解. 结果 rOspA在宿主菌内表达高效、稳定;Western blot显示其与抗OspA的多抗有较好的免疫反应性;用rOspA免疫新西兰家兔后,其血清抗体(IgG)效价显著升高(32倍),体外中和试验表明,每毫升兔抗rOspA血清可杀灭105个莱姆病螺旋体. 结论在国内首次成功地对中国莱姆病螺旋体Borrelia garinii基因型的OspA基因进行了克隆和表达.rOspA有较好的免疫保护性,可作为多价莱姆病疫苗的一种成分.
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对《核包膜蛋白gp210、p62和LBR 自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探》一文的商榷
编辑同志:贵刊2005年第11期刊登了李永哲等《核包膜蛋白gp210、p62和LBR 自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探》一文,在阅读过程中,发现有些表述欠妥,特提出与作者商榷.
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答复《对核包膜蛋白gp210、p62和LBR 自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探一文的商榷》
编辑同志:拜读编辑部转来的胡红焱读者的来信,信中所提问题绝大部分是正确的,大多为论文写作及编辑过程疏忽造成所出现的低级错误,以后应从中吸取教训.请转达我对读者严谨认真的科学态度的敬意和谢意.现对胡红焱读者所提出的问题逐条答复如下.
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肿瘤抑素T7肽及其衍生物T7-NGR载体构建及表达
目的 为了提高作用靶向性,将导向肽NGR与肿瘤抑素T7肽的C端连接,获得T7肽及其衍生物T2-NGR的载体.方法 通过PCR和合成基因序列方法分别构建了肿瘤抑素T7肽及T7-NGR的克隆载体pMD-T7和pMD-T7N,经酶切和测序鉴定后,将2种载体分别双酶切,经低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后,切下目的 片段与酶切回收的质粒载体pET28a在低熔点琼脂糖中直接进行连接反应.阳性克隆经酶切和测序鉴定,转化感受态E.coli BL21(DE3),IFTG诱导表达.结果 酶切和测序鉴定结果正确,分别成功构建表达载体pET-T7和pET-T7N,经IPTG诱导,完成了表达条件的优化.Tricihe-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,当IPTG浓度为1 mmol/L时,25℃诱导8 h,分别获得了T7肽和T7-NGR的表达产物.结论 已经成功构建T7肽和T7-NGR的表达载体,获得了表达产物,为下一步的小肽活性实验奠定了基础.
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胶体金标记技术检测麻疹抗体方法的建立
[目的]利用原核基因表达的麻疹H蛋白,结合胶体金微粒,制备检测麻疹IgG抗体的胶体金层析试纸条.[方法]利用抗IgG抗体结合IgG抗体-麻疹H蛋白-金微粒的原理,优化条件,确定佳标记蛋白pH值及蛋白量等,制备胶体金试纸条,并进行样本检测.[结果]根据自身表达蛋白的特点及浓度,标记的金微粒pH值为9.0,蛋白量为24μg/ml.79份样品中,阳性符合率为94.2％,阳性检出率组间比较差异无统计学意义.[结论]该试纸条测定麻疹IgG抗体表现了良好的符合率,可以考虑用于条件比较差的县区麻疹IgG的监测,简便快速,有良好的经济效益.
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内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达
目的 构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达.方法 从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达.结果 成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达.结论 构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白.
关键词： Arresten基因 序列测定 E.coli BL21 基因克隆表达 -
催化合成西格列汀的转氨酶基因的克隆表达
将可催化合成西格列汀的转氨酶基因克隆到表达载体pGEX-6p-1上,并转入大肠杆菌E.coli中表达,获得高效表达重组转氨酶的菌株.分别考察基因在不同大肠杆菌[E.coli W3110、E.coli BL21 (DE3)、E coli Rosetta(DE3)和E coli Rosetta-gami2 (DE3)]中的表达情况,结果显示,转氨酶在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达量较高,而且多为可溶性表达.所得重组转氨酶(粗酶)比活力也较高,为0.32 u/mg.
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大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的表达
目的:在乳酸乳球菌中表达大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)基因.方法:采用RT-PCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增血红素加氧酶HO-1基因,将该基因克隆进pGEM-T easy质粒中,转化大肠杆菌DH5α提取质粒,鉴定HO-1基因.酶切后与pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养.用nisin诱导HO-1表达,SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物,并采用分光光度法测定HO-1活性.结果:表达产物相对分子量约为32 kU,表达量约为7.0 mg/L,H0-1活性为2.386 U/(mg·h).结论:乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的大鼠H0-1.
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浙江省人群戊型肝炎血清学调查
戊型肝炎(戊肝,HE)在发展中国家流行甚广,戊型肝炎病毒(HEV)基因克隆表达及诊断试剂的研制成功,为流行病学研究带来了深刻的变化[1,2],检测戊型肝炎病毒抗体(抗-HEV)试剂盒得以迅速完善,便于开展人群流行病学研究.我们于2001年10月对浙江省温州、绍兴、衢州、舟山四个市进行了戊肝血清流行病学调查,现报告如下.
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日本血吸虫(中国大陆株)Cathepsin L基因的克隆、表达及其免疫保护功能的研究
目的 开展日本血吸虫组织蛋白酶L(SjCL)功能研究,为研发血吸虫病抗病疫苗提供基础.方法 应用RTPCR技术分离、克隆日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L保守功能域编码基因,并在大肠杆菌系统中表达,应用免疫亲和层析法纯化组织蛋白酶L重组抗原,用该基因纯化重组表达产物进行小鼠免疫保护实验.结果 获得了672 bp的血吸虫组织蛋白酶L保守功能域cDNA序列,成功构建了原核表达载体pET28a(+)-SjCL,并在大肠杆菌中进行了表达,经免疫亲和层析获得了高纯度的SjCL融合蛋白,以该纯化物免疫小鼠,结果实验组减虫率为36.04%,肝组织减卵率为34%,粪卵减少率达49%,与对照组进行方差分析,差异均显著.结论 获得日本血吸虫组织蛋白酶L保守功能域cDNA克隆,其原核表达产物免疫小鼠对抗血吸虫感染具有-定的保护性.
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丙型肝炎病毒NS5a高免疫源区基因的表达及抗原性检测
第3代诊断丙型肝炎病毒(HCV)感染免疫酶分析法(EIA)诊断试剂盒中增加了来自HCV非结构蛋白NS5抗原,但其敏感性和特异性均较低.
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结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究
目的为结核病新型疫苗研制提供靶基因和靶抗原.方法根据结核杆菌H37Rv株免疫保护性抗原Ag85A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物,以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得具有完整开架读码框(ORF)的Ag85A抗原基因,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体pBK-CMV构建重组质粒,重组质粒转入大肠杆菌后IPTG诱导表达,并对其表达产物进行Western-blotting分析.结果 PCR扩增获得了具有完整开架读码框的Ag85A抗原基因;构建了Ag85A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体;Ag85A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达.结论成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.
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铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化
目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.
