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胶体金标记技术检测麻疹抗体方法的建立
[目的]利用原核基因表达的麻疹H蛋白,结合胶体金微粒,制备检测麻疹IgG抗体的胶体金层析试纸条.[方法]利用抗IgG抗体结合IgG抗体-麻疹H蛋白-金微粒的原理,优化条件,确定佳标记蛋白pH值及蛋白量等,制备胶体金试纸条,并进行样本检测.[结果]根据自身表达蛋白的特点及浓度,标记的金微粒pH值为9.0,蛋白量为24μg/ml.79份样品中,阳性符合率为94.2％,阳性检出率组间比较差异无统计学意义.[结论]该试纸条测定麻疹IgG抗体表现了良好的符合率,可以考虑用于条件比较差的县区麻疹IgG的监测,简便快速,有良好的经济效益.
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小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)弱毒疫苗株血凝素蛋白(H)主要抗原表位区进行克隆及原核表达,并制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体.方法 根据GenBank中登录的PPRV弱毒疫苗株H基因序列设计引物,RT-PCR扩增其主要抗原表位区域(去掉信号肽及跨膜区);将扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)后,转化E.coli Transetta(DE3),经IPTG 37℃诱导表达目的蛋白;表达的目的蛋白经带His标签的镍离子蛋白纯化柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定;将纯化的H蛋白与弗氏佐剂混合乳化后免疫昆明鼠,3次免疫2周后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光试验进行鉴定.结果 质粒pET-30a(+)-H经双酶切鉴定证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约60 000,能同时被抗His标签抗体和PPRV阳性绵羊血清识别,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的48％,纯度可达90％以上;制备的多克隆抗体能够识别PPRV全病毒抗原以及杆状病毒表达的重组PPRV H蛋白.结论 成功构建了质粒pET-30a(+)-H,并表达了PPRV H蛋白,制备的鼠源多克隆抗体为建立针对PPRV H蛋白的ELISA抗体检测方法及研制新型亚单位疫苗奠定了基础.
