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创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对人Caco-2细胞IL-8基因表达和IL-8分泌的影响
目的 研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)对人肠上皮细胞(human intestinalepithelial cell,Caco-2)IL-8基因表达的影响.方法 IPTG诱导、表达、纯化、复性及Western blot鉴定rVvhA表达和纯化情况;CCK-8法检测rVvhA对Caco-2的细胞毒性作用;RT-PCR检测rVvhA诱导Caco-2细胞IL-8基因的表达情况;ELISA检测Caco-2细胞培养上清IL-8的分泌情况.结果 Ni~(2+)-NTA亲和层析柱对rVvhA进行纯化后纯度可达95%以上;CCK-8结果显示rVvhA活性蛋白显著降低了Caco-2细胞的存活率,有效浓度为1.5 HU/ml(P<0.05);RT-PCR结果显示,0.6 HU/ml rVvhA30 minllp可诱导Caco-2细胞IL-8 mRNA基因表达上调;ELISA结果显示,Caco-2细胞经rVvhA作用后,培养液上清中IL-8多肽的表达时相在4 h.RT-PCR与ELISA结果皆显示,IL-8基因的转录及IL-8表达皆具有时间-剂量依赖性.结论 rVvhA在转录水平上能诱导人Caco-2细胞IL-8 mRNA表达,促进IL-8的合成,在创伤弧菌引起的过度炎症反应和败血症的发生、发展中可能具有重要意义.
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rVvhA诱导小鼠单核巨噬细胞凋亡的作用及其机制
目的 研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导小鼠单核巨噬细胞(J774A.1)凋亡的作用及机制.方法 MTT法、电子透射电镜、流式细胞仪结合Annexin V-PI标记法、线粒体膜电位和cagpase活性检测等方法测定rVvhA诱导J774A.1凋亡的作用.结果 MTT结果显示rVvhA能够抑制J774A.1生长.2.0溶血单位(HU)/ml和3.0 HU/ml的rVvhA作用J774A.18 h后,透射电镜观察细胞和线粒体形态发生凋亡改变;流式细胞仪检测凋亡率分别为(7.80±0.62)%、(12.33±0.12)%,均高于正常组(3.07±0.67)%;线粒体膜电位也下降,流式细胞仪结果显示绿色荧光率分别是9.8%、39.2%.其中3.0 HU/ml rVvhA作用组,caspage-3、9活性增加,并且具有时间依赖性,而cagpage-8活性没有明显改变.3.0HU/ml rVvhA加caspage-3抑制剂(Ac-DEVD-FMK)或caspase-9抑制剂(Ac-LEHD-FMK)的凋亡率与3.0 HU/ml rVvhA作用组相比都降低,分别为(6.23±3.95)%、(9.60±3.14)%;同时cagpage-3、9活性也下降.结论 rVvhA具有诱导J774A.1凋亡的生物学活性;其机制可能与依赖cagpase的线粒体途径有关.
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钙离子对重组创伤弧菌溶细胞素诱导THP-1细胞损伤的影响机制
目的 研究重组创伤弧菌溶细胞素( rVvhA)诱导人单核细胞白血病细胞(THP-1)的凋亡机制及其Ca2+的变化.方法 采用CCK-8法、激光共聚焦显微镜结合Fluo 3/AM法、流式细胞术结合AnnexinV -PI标记等检测rVvhA对THP-1细胞的影响,并观察胞内Ca2+浓度变化.结 果rVvhA可诱导THP-1细胞发生凋亡并引起细胞内Ca2+浓度升高,细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM处理组胞内钙离子升高幅度远高于细胞外钙离子螯合剂EGTA处理组.结论 rVvhA具有诱导THP-1细胞凋亡的生物学活性,并能引起细胞内Ca2+浓度升高,升高的Ca2+主要源于胞外钙离子内流.
关键词： 创伤弧菌 溶细胞素 钙离子 人单核细胞白血病细胞 -
创伤弧菌溶细胞素体外诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及其在细胞中的定位
目的 了解创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnifru,cytolysin,WC)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡作用及其机制.方法 采用PCR扩增创伤弧菌GTC333株VVC编码基因vvhA,T-A克隆后测序并构建vvhA基因原核表达系统E.coli BL21DE3pET-42a-vvhA.采用Ni-NTA亲和层析法提纯目的 重组蛋白rVVC,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统确定rVVC表达量及提取物纯度.采用溶血试验检测rVVC溶解兔红细胞的活性.2,4-二硝基苯肼比色法和四苯硼钠比色法分别测定rVVC作用的HUVEC培养物上清中乳酸脱氢酶(LDH)和K+含量.采用流式细胞术检测rVVC诱导HUVEC凋亡的作用.将FITC标记rVVC,采用激光共聚焦技术对HUVEC中的FITC标记rVVC进行定位.结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的vvhA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.09%和98.26%.1μg/ml的rVVC即可溶解兔红细胞(P<0.01).10 μg/ml的rVVC可引起HUVEC培养物上清中K+含量明显增高(P<0.01),但LDH含量无明显改变(P>0.05).1～100μg/ml的rVVC作用2 h可使HUVEC凋亡.在FITC标记rVVC作用HUVEC 5～240 min内,rVVC逐渐从细胞膜表面向膜内侧和胞浆内移行,作用30 min时多数rVVC进入细胞.结论 rVVC具有溶细胞素活性.VVC可进入HUVEC,诱导细胞凋亡是其损伤HUVEC的主要机制.
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创伤弧菌溶细胞素融合蛋白细胞毒活性相关分子机制研究
目的 研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVVC)诱导人ECV304细胞(人脐静脉内皮细胞)凋亡过程中Caspase-3,-8,-9活性变化.方法 应用MTT法、Hochest33342/PI荧光双染、流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳分析rVVC对人ECV304细胞诱导凋亡的影响;比色法测定rVVC诱导人ECV304凋亡过程中Caspase-3,-8,-9活性变化.结果 MTT结果显示rVVC具有降低人ECV304细胞的存活率活性;浓度为2.0溶血单位(HU)/ml的rVVC作用人ECV304 12 h后,其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5 HU/ml的 rVVC处理组,具有剂量依赖性;浓度为2.0 HU/ml rVVC处理组加40 μmol/L Caspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0 HU/ml rVVC处理组有一定程度降低.浓度为2.0 HU/ml rVVC处理人ECV304细胞0.5 h后Caspase-3活性开始增高,于3 h达高峰,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),Caspase-8,-9活性无明显变化.结论 rVVC对人ECV304具有凋亡诱导的生物学活性,Caspase-3可能与活性rVVC诱导的人ECV304凋亡有关.
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创伤弧菌溶细胞素蓖麻毒素B活性模序的预测、克隆表达和功能鉴定
目的 研究克隆表达的创伤弧菌溶细胞素(vvC)中的重组蓖麻毒素B(rRicin B)功能模序,明确其功能,进一步阐明创伤弧菌溶细胞素的分子致病机制.方法 生物信息学预测VVC中的功能模序,构建pET28a-rRicin B原核表达系统,并通过IPTG诱导表达、三步洗涤、Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化、复性、ELISA检测和激光共聚焦显微镜检测FITC标记的rRicin B与Hela细胞相互作用等.结果 通过生物信息学预测到VVC中336～465位氨基酸序列可能存在蓖麻毒素B链的功能模序,克隆表达这段模序后,其相对分子质量为20×103,经ELISA法检测复性后蓖麻毒素抗原性为28.71 U/L;Hela细胞经FITC标记的rRicin B作用后其细胞膜表面和胞质均有绿色荧光产生.结论 VVC中存在具有类似天然蓖麻毒素B链功能的模序,能与细胞膜表面结合并进入胞质,可能与创伤弧菌溶细胞素膜成孔和细胞毒活性有关.
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创伤弧菌溶细胞素对小鼠骨髓来源巨噬细胞坏死性凋亡的作用及机制
目的 探讨创伤弧菌溶细胞素(VVc)对永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞(iBMDM)坏死性凋亡的作用及机制.方法 iBMDM细胞按照不同浓度的VVc刺激以及是否接受受体相互作用蛋白1(RIP1)特异性抑制剂Nec-1的预处理分为5组:对照组、Wc 2μg/ml组,VVc 4μg/ml组、Nec-1+VVc 2μg/ml组和Nec-1 +VVc 4μg/ml组.Nec-1各组在VVc处理前1h加入5μmol/L Nec-1,实验中各组在VVc处理2h后收集培养上清及细胞.采用乳酸脱氢酶(LDH)法评价VVc对细胞的毒性情况;采用流式细胞仪检测细胞状态;采用Western blotting检测细胞焦亡和坏死性凋亡相关蛋白GSDMD(gasdermin D protein)和混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)的表达.结果 培养基上清内LDH水平随Wc浓度上升而升高,且可被Nec-1预处理所抑制(P＜0.05).流式细胞检测结果显示,VVc处理后呈Annexin V/PI双标阳性的细胞比例明显增加,使用Nec-1预处理后,该比例明显下降(P＜0.05).Western blotting检测结果显示,VVc处理组pMLKL水平明显高于对照组和Nec-1 +VVc处理组(P＜0.05),各组均未观察到焦亡相关蛋白存在剪切体活性形式.结论 VVc可通过RIP1诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞发生坏死性凋亡.
关键词： 创伤弧菌 溶细胞素 坏死性凋亡 依赖受体相互作用蛋白 -
创伤弧菌溶细胞素细胞毒性机制的研究进展
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌,存在于海水及海产品中.该菌主要引起原发性败血症和严重的创口感染.原发性败血症病人多发生低血容量性休克伴多脏器功能衰竭,病死率高.创伤弧菌感染的致病机制至今尚未完全阐明.动物实验发现该菌的毒力可能包含诸多因素,如胞外溶细胞素(VVC)、金属蛋白酶(弹性蛋白分解酶)、荚膜多糖(CPS)等.VVC是由结构基因vvhA编码的一种相对分子质量(Mr)为50 851的细胞外蛋白质,是一种能使细胞形成孔道的细胞毒素和溶血毒素,是创伤弧菌向胞外释放的唯一细胞毒素,由大多数致病菌株产生,具水溶性,对热不稳定,能溶解哺乳动物红细胞及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,具有血管渗透因子活性.经VVC注射的实验鼠可出现与创伤弧菌败血症病人同样的临床和病理表现,毫克以下水平即可对实验鼠致死.VVC在创伤弧菌感染致病机制中的确切地位尚有争议,但因其具有穿孔特性而颇受人们关注.目前对VVC的细胞毒性机制已有广泛研究和报道,但其确切机制尚未完全明了.本文将近年来国外有关研究的情况作一综述.
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创伤弧菌致病机制的研究进展
创伤弧菌是一种致病性极强的细菌,可引起严重的伤口感染和败血症等疾患.其确切的致病因子和致病机制至今尚未完全阐明.兹将近年来有关其主要致病因素,如溶细胞素、金属蛋白酶、儿荼酚亲铁物质、荚膜多糖及磷脂酶的研究动态作一综述.
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海葵溶细胞素的生物信息学分析
利用生物信息学的软件与方法对已报道的17种海葵溶细胞素的氨基酸组成、理化性质、结构特征以及系统演化关系等进行预测和分析.结果表明不同海葵溶细胞素在氨基酸组成和理化性质上具有一定相似性,但其在结构上有一定差别.以MP法和NJ法对不同海葵溶细胞素构建的系统发生树基本一致,在亲缘关系较近的7种海葵溶细胞素中可以找到6个保守序列.
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重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备
目的:制备重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC)鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素( Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础.方法:IPTG诱导含pET28a(+)-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠.SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果.采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC 单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养.采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型, ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性.结果:将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经 ELISA检测,血清有效稀释度达1:12800.共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7 和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应.结论:本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型.
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创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定
目的 制备创伤弧菌(Vibrio vulnificus)溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性,为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础.方法 采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rvvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果.采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株,有限稀释法进行细胞克隆.采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型.采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性.结果 在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rvvhA产量可占细菌总蛋白的18%.提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带.共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株,其中A5E8和C3B6株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体,其抗体类型分别为IgG1和IgG2a.A5E8和C3B6单克隆抗体有较高特异性,与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应,对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1:4000～1:8000、免疫双扩散效价为1:4～1:8,Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA.结论 本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株,rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素.
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创伤弧菌溶细胞素抗原表位预测及其噬菌体展示肽的构建
目的 预测创伤弧菌溶细胞素(vibrio vulnificus cytolysin)的抗原表位,为研制多抗原肽疫苗(MAP)奠定基础.方法 采用生物信息学技术对Vvc的T细胞和B细胞表位进行预测及分析.选取Vvc主要T细胞和B细胞联合表位肽构建噬菌体展示系统.PEG/NaCl沉淀法提纯重组噬菌体,SDS-PAGE鉴定目的重组PIII蛋白(rPIII).Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白rVvc常规皮下免疫法制备兔抗血清.rVvc抗血清为一抗,采用Western blot对上述表位肽进行鉴定和筛选.结果 预测的4个主要表位肽Vvha1、 Vvah2、 Vvha3和Vvha4在M13噬菌体中获得成功表达.采用rVvc抗血清为一抗,Western blot对上述表位肽进行鉴定和筛选:Vvha2、Vvha4反应强度高于Vvha1和Vvha3.结论 本实验成功地构建Vvc主要T细胞和B细胞联合表位肽噬菌体展示系统.
