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利用珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565氨甲酰基化4,5-双氢-7-去氨甲酰基格尔德霉素
格尔德霉素（geldanamycin,GDM）和安丝菌素(ansamitocin,ASM)分别是由吸水链霉菌（如streptomyces hygroscopicus 17997）和珍贵橙色束丝放线菌（如actinosynnema pretiosum ATCC 31565）产生的具有抗肿瘤活性的安莎类抗生素[1-2].GDM与ASM具有相同的生物合成机制;它们均以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)为特异性生物合成起始物,在Ⅰ型聚酮合酶(PKS)作用下将7个二碳单位连接形成安莎链,在酰胺合酶的作用下将安莎链与AHBA连接环化;再经过PKS后修饰过程,形成GDM或ASM[3-4].
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17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素对HeLa细胞辐射增敏作用机制研究
格尔德霉素(geldanamycin,GA)及其衍生物17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素(17-AAG)和17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)是已经发现的热休克蛋白90(HSP90)特异性抑制剂[1].它们可以与肿瘤细胞特异性结合,抑制肿瘤生长,增加其凋亡[2-3].HSP90特异性抑制剂17-AAG对肿瘤细胞辐射敏感性影响的研究报道较少,已有的研究结果表明,17-AAG对宫颈癌细胞有辐射增敏作用,而对正常成纤维细胞无辐射敏感性影响[4-5].但其辐射增敏的作用机制是否通过抑制DNA损伤的修复和影响细胞周期而发挥作用,本研究将对这一问题进行探讨.
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Geldanamycin对HER2/neu高表达人乳腺癌细胞系SKBr3增殖及迁移能力的影响
目的 探讨Hsp90抑制剂苯醌安莎霉素类抗生素(GA)对HER2/neu高表达人乳腺癌细胞系SKBr3增殖及迁移能力的影响.方法 用Western蛋白印迹法检测GA介导的HER2/neu酪氨酸激酶的降解;MTT法分析GA对肿瘤细胞存活率的影响;流式细胞仪测定GA对肿瘤细胞周期的影响;RT-PCR和real-time PCR分析GA对cyclin D1表达的影响以及分析GA对肿瘤细胞迁移能力的干预作用.结果 GA以剂量/时间依赖性的方式降解了HER2/neu酪氨酸激酶的表达并抑制了SKBr3乳腺癌细胞的增殖,这种增殖抑制效应表现在:GA干预后乳腺癌细胞的存活率明显降低;GA阻断了乳腺癌细胞细胞周期的进展,使细胞周期停滞于G1期,而这两种表现与cyclin D1表达量的减低有着明显的关系.GA的干预也同时降低了肿瘤细胞的迁移能力.结论本研究证实GA能够降解HER2/neu酪氨酸激酶并抑制HER2/neu高表达人乳腺癌细胞系SKBr3的增殖和迁移能力.
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HSP90在乳腺癌细胞株ZR-75-30中的表达及对粘附侵袭能力的影响
目的:研究热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)90在乳腺癌细胞株ZR-75-30中的表达及对该细胞粘附侵袭能力的影响,并探讨相关机制及意义.方法:体外培养ZR-75-30乳腺癌细胞株,以HSP90抑制剂Geldanamycin(GA)作用处理;免疫印迹技术(Western-blot)检测GA处理前后HSP90在乳腺癌细胞株ZR-75-30中的表达情况;噻唑兰比色(MTT)法检测GA对ZR-75-30细胞的增殖抑制作用;噻唑兰比色(MTT)法检测细胞对人工基底膜(Matrigel)的粘附能力变化;TranswellCham-ber法观察癌细胞侵袭、迁移能力的改变.结果:HSP90抑制剂GA对ZR-75-30细胞具有增殖抑制作用,呈时间剂量依赖关系;GA作用后HSP90在乳腺癌细胞株ZR-75-30中表达明显下降;HSP90抑制剂GA处理的乳腺癌细胞ZR-75-30的粘附率较未加GA的对照组下降明显(P＜0.01);在GA未处理对照组侵袭、迁移实验穿膜细胞数分别为95.4±5.2,103±15.4与GA处理实验组穿膜细胞数46.2±4.9,52.4±8.4相比具有显著性差异(P＜0.01).结论:通过抑制HSP90在乳腺癌细胞株ZR-75-30中的表达,GA能明显减弱乳腺癌细胞株ZR-75-30增殖粘附侵袭能力,HSP90与乳腺癌细胞增殖侵袭转移能力相关.
关键词： 乳腺癌细胞 Hsp90 geldanamycin 转移 -
HSP90的抑制剂Geldanamycin对乳腺癌细胞侵袭、转移能力的影响
目的:探讨HSP90抑制剂Geldanamycin(GA)对高转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s侵袭、转移能力的影响.方法:噻唑兰比色(MTT)法检测两株细胞对人工基底膜(Matrigel)的粘附能力变化;Transwell Chamber体外侵袭运动实验研究GA处理前后MDA-MB-231、MDA-MB-435s细胞侵袭、运动能力的改变.结果:GA处理后的MDA-MB-231和MDA-MB-435s细胞的粘附、侵袭、运动能力与未处理组细胞相比均明显下降,差异具有显著性(P＜0.05和P＜0.01).结论:HSP90抑制剂Geldanamycin(GA)能够明显抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s粘附、侵袭和运动能力.
关键词： 乳腺癌细胞 geldanamycin Hsp90 -
作用于基质金属蛋白酶的抗生素
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是在与组织重塑有关的生理过程和以细胞外基质过度破坏为主要特征的病理过程中起重要作用的一类锌离子依赖性内肽酶.近些年来,MMPs在恶性肿瘤侵袭、生长和转移过程中的作用日益受到重视.我们以在肿瘤细胞破坏和穿过基底膜发生侵袭和转移过程中起重要作用的MMPs家族成员IV型胶原酶为研究对象,利用抗IV型胶原酶单克隆抗体3D6为工具,采用间接ELISA方法研究了四种抗生素对IV型胶原酶或能够分泌IV型胶原酶的PG细胞的作用.结果表明,geldanamycin和博安霉素均能竞争性地抑制3D6与IV型胶原酶或PG细胞的结合,说明其作用于IV型胶原酶并可能对其活性产生抑制作用;而米诺环素在实验浓度下仅对3D6和PG细胞的结合表现出抑制作用.另外,我们发现地红霉素亦能够抑制单抗3D6与IV型胶原酶或PG细胞的结合.结果表明,这四种抗生素可能作用于基质金属蛋白酶.
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Geldanamycin产生菌生物合成相关基因的克隆与分析
目的从geldanamycin产生菌吸水链霉菌(S.hygroscopicus)中克隆生物合成基因,为阐明生物合成机制及改造其结构奠定基础.方法以链霉菌/大肠埃希氏菌穿梭cosmids pKC505为载体构建了插入片段为20～30kb的S.hygroscopicus总DNA文库.以利福霉素中与3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合成相关基因为探针,经菌落杂交,Southern杂交筛选同源基因片段.测序结果与Genbank进行同源性比较分析,并以attp-噬菌体载体KC515利用基因阻断实验对克隆的基因片段进行功能鉴定.结果构建的基因文库含重组基因比率高、基因组覆盖率高,稳定性好.经同源基因探针杂交,从文库中筛选出9个阳性cosmids克隆pCGB20、pCGB26、pCGB28、pCGB29、pCGB36、pCGB45、pCGB49、pCGB63、pCGB75.测序分析表明,cosmidpCGB20中BamHI-BamHI 8kb片段两端的不完整ORF编码蛋白与竹桃霉素(oleandomycin)PKS Module 5、Module 6(一致性为79%)和红霉内酯合成酶ORF2(一致性为75%)、ORF1(一致性为73%)、ORF3(一致性为70%)高度同源;BamHI-BamHI 3kb片段一端与编码类结核分枝杆菌的磷酸吡哆醛依赖的氨基转移酶家族中半胱氨酸脱硫酶的DNA有同源性,该家族与AHBA合成酶关系密切.Cosmid pCGB20的BamHI-BamHI 8kb及BamHI-BamHI 3kb基因片段已通过基因阻断实验初步鉴定,证明它们参与geldanamycin生物合成.而其他cosmids阳性克隆的序列分析及功能研究尚在进行中.
关键词： geldanamycin 生物合成基因 基因文库 基因阻断
