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利用珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565氨甲酰基化4,5-双氢-7-去氨甲酰基格尔德霉素
格尔德霉素（geldanamycin,GDM）和安丝菌素(ansamitocin,ASM)分别是由吸水链霉菌（如streptomyces hygroscopicus 17997）和珍贵橙色束丝放线菌（如actinosynnema pretiosum ATCC 31565）产生的具有抗肿瘤活性的安莎类抗生素[1-2].GDM与ASM具有相同的生物合成机制;它们均以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)为特异性生物合成起始物,在Ⅰ型聚酮合酶(PKS)作用下将7个二碳单位连接形成安莎链,在酰胺合酶的作用下将安莎链与AHBA连接环化;再经过PKS后修饰过程,形成GDM或ASM[3-4].
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组合生物合成聚酮类药物研究进展
在筛选和发展新型微生物药物方面组合生物合成日益成为生物、化学和医药界关注的重点.基于聚酮类(PK)天然产物的独特化学结构和良好生物活性,研究它们的生物合成机制,将为合理化遗传修饰生物合成途径获得结构类似物提供遗传和生物化学的基础,实现利用现代生物学和化学的技术手段在微生物体内进行药物开发的目的.现综述近年来组合生物合成技术的基本原理、聚酮合酶的基本作用机制以及合成途径的改造情况等.
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avermectin生物合成基因簇的研究进展
近期对除虫链霉菌avermectin生物合成基因簇的研究揭示,它包含4个大的开放阅读框,分别编码avermectin聚酮合成酶4个巨大多功能多肽(AVRS1,AVRS2,AVRS3和AVRS4),构成了迄今已知的复杂的多功能酶系统.此外,序列分析结果还显示,在这4个大的开放阅读框的前、后及中间还存在另14个开放阅读框,它们分别与聚酮后修饰以及avermectin生物合成的其它步骤有关.本文综述了对avermectin生物合成基因簇分子研究的新进展.
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烯二炔类抗生素生物合成研究进展
烯二炔类抗生素是迄今发现的抗肿瘤活性强的抗生素.本文介绍其生物合成机制,并结合组合生物技术、药物靶点核苷酸数据库及基因组文库的序列标签,提出两种新颖的有较高可行性的烯二炔生物合成方法.
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产生芳香环聚酮类天然产物放线菌的分子筛选研究
目的建立一套简便、快速、高效的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系,为聚酮类药物筛选搭建一个新的技术平台;认识PKS-Ⅱ基因在不同环境放线菌群中的分布规律,为新药筛选中微生物资源的定向分离提供依据.方法通过对芳香环聚酮类化合物生物合成途径所用的Ⅱ型聚酮合酶氨基酸和核苷酸序列的同源性比较分析,设计一对简并引物且以微波炉法提取的基因组DNA为模板扩增KS/CLF功能域约0.8kb目的基因片段,依据放线菌基因组中Ⅱ型PKS合酶基因的存在与否标定可能的芳香环聚酮类天然产物产生菌.结果利用建立的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系对99株嗜碱放线菌、100株链霉菌、47株嗜盐放线菌和776株一般放线菌进行了筛选,研究表明链霉菌、嗜碱放线菌、嗜盐放线菌和一般放线菌Ⅱ型聚酮合酶基因的阳性率分别为54%、29.3%、25.5%和24.1%.结论组合放线菌基因组DNA快速提取技术和PKS Ⅱ基因简并引物PCR扩增技术建立了快速、简便、高效的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系并对不同环境条件的放线菌菌群的PKS Ⅱ基因分布进行了研究.结果表明放线菌PKSⅡ聚酮合酶分布具有广泛性;而且同时表明链霉菌是芳香环聚酮类化合物的丰富来源;在极端环境放线菌中,嗜盐放线菌的PKS Ⅱ基因在中度嗜盐放线菌分布的频率远高于嗜盐放线菌,嗜碱和中度嗜盐放线菌也是芳香环聚酮类化合物潜在的丰富资源.本研究为新药筛选中新的有效菌源的确定提供了可靠依据.
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聚酮合酶与药物筛选的研究进展
由于结构多样化和生物活性多样性,聚酮化合物已经成为新药的重要来源.聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)是合成聚酮类物质的酶复合体.本文介绍了聚酮合酶的分类、作用机制及相关药物筛选的研究进展.并对通过宏基因组技术,从自然环境中获得新聚酮化合物的基因筛选方法的研究进展进行了总结.
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聚酮化合物及其组合生物合成
聚酮化合物的组合生物合成是当前国际化学与生物学交叉学科研究的热点之一,也正在发展成为药物创新超常规的重要手段.本文对近十年来聚酮化合物,特别是Ⅰ型聚酮化合物的组合生物合成的常用技术和方法学发展进行了回顾和展望.
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新型聚酮合酶基因簇的分离与部分鉴定
目的 从海洋沉积物中分离新型聚酮合酶(PKS)基因簇,并解析其基因结构,为研究PKS的组合生物合成提供新组件.方法 采集中国东海沉积物样本,并提取宏基因组DNA,以其为模板,通过简并PCR扩增新型PKS片段,用地高辛标记正确的扩增片段作为探针,然后从本研究中构建的海洋沉积物样本Fosmid宏基因组文库中筛选完整基因簇,测序、结构分析.结果 (1)所分离得到的海洋沉积物宏基因组DNA可直接作为PCR模板,简并PCR扩增得到26个新型KS编码片段,并成功提交GenBank;(2)所得DNA构建成滴度约5×108cfu/ml的Fosmid文库,插入片段平均长度约为40kb;(3)将其中的一个KS片段(GenBank登录号DQ942531)用地高辛标记并筛选部分文库,得到4个克隆,测序得到7981bp的序列(GenBank登录号EF568935),结构分析发现含典型的I型PKS组件,如酮缩酶(KS)、酰基转移酶(AT)、酰基载体蛋白(ACP)等.结论 简并引物扩增、宏基因组文库筛选、测序、结构分析,在本研究中被证明是有效的分离新PKS基因簇的途径;通过系统进化树分析得出26条新KS片段属于I型KS片断和杂合PKS/NRPS基因簇,主要来自放线菌门、δ变形菌门、蓝藻门和β变形菌门的微生物.
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新型酰基转移酶AT-EF080951的重组表达及底物结合分析
目的 研究新型聚酮合酶(PKS)基因簇EF568935(Gen Bank登录号)中酰基转移酶(AT)EF080951(GenBank登录号)底物特异性,为PKS的功能研究及组合生物合成研究提供新组件.方法 从酰基转移酶AT-EF080951结构域两端的连接肽区设计引物,通过PCR克隆其结构域基因at-EF080951;连接入原核表达载体pMAL-c2X,与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合表达;直链淀粉树脂柱亲和层析纯化MBP-AT-EF08095l;融合蛋白用Xa因子切除MBP,得到AT-EF080951单体;以MBP、小牛血清白蛋白(BSA)为对照蛋白,用紫外分光光度法测定MBP-AT-EF080951与AT-EF080951对底物的结合能力,计算结合常数(Ka,μmol/L),分析其结合底物的特异性.结果 (1)MBP-AT-EF080951与底物的结合常数为:甲基丙二酰辅酶A,0.0049±0.001;丙二酰辅酶A,0.0049±0.003;乙酰辅酶A,0.107±0.002;辅酶A,0.005±0.003.(2)AT-EF080951与底物的结合常数为:甲基丙二酰辅酶A,0.005±0.002;丙二酰辅酶A,0.0041±0.002;乙酰辅酶A,0.120±0.001;辅酶A,0.0042±0.003.结论 MBP-AT-EF080951和AT-EF080951都特异性结合乙酰辅酶A,AT-EF080951可能是乙酰转移酶.
