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人类血小板抗原HPA-15系统PCR-SSP基因分型技术的建立
本研究目的是采用PCR-SSP技术建立人类血小板抗原HPA-15系统的基因分型方法,并应用于血小板供者库的HPA基因定型.采用第11届国际输血协会(ISBT)血小板血清学与基因分型协作组推荐的序列特异性引物,调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索佳PCR扩增条件,建立HPA-15系统基因分型技术.该分型技术的准确性和可靠性,采用第11届ISBT血小板协作组提供的质控样本进行验证,同时采用本研究合成的引物及商品化试剂盒,对50名随机的汉族血小板捐献者进行HPA-15系统基因分型,作为平行对照.应用本研究的方法,对第11届ISBT送检的10份考核样本进行基因分型.结果表明:基因分型结果与ISBT公布的结果完全一致.50名随机的血小板志愿捐献者,经本研究的方法及美国G&T公司的试剂检测,基因分型的结果相符合;观察到的基因频率:HPA-15a和-15b分别为0.5100和0.4900.结论:本研究建立的HPA基因分型技术具有简便、快速、准确的特点,适合于常规HPA基因分型,具有广泛的应用前景.
关键词： 人类血小板抗原 HPA-15系统 序列特异性引物-PCR 基因分型 -
献血者血小板1-16抗原基因遗传多态性分析及已知HPA型供者数据库的建立
本研究的目的是分析人类血小板抗原(human platelet antigen,HPA)基因多态性,根据分布频率来判断HPA抗原不配合比率以及抗体产生的机会,确定有临床意义的血小板抗原系统,并建立邯郸地区血小板基因频率数据库和供者库.采用SSP-PCR方法对邯郸地区148名随机献血者进行HPA1-16抗原32个等位基因的检测分析,并与不同人群的分布频率进行比较.结果表明:每个样本均检测到HPA-1a、2a、4a-14a、16a基因;HPA-4a、7a-14a、16a呈现单态性,未检测出相应的等位基因HPA-b;对于HPA-1、-2、-5、-6主要以a/a纯合子为多,a/a基因型频率分别是0.9595、0.8108、0.9865、0.9797,没有b/b纯合子出现.在HPA1-16中,具有高杂合度的是HPA-15,基因型HPA15a/15a、HPA15a/15b、HPA15b/15b频率分别是0.2230、0.5270、0.2500;HPA-3在其次,基因型HPA3a/3a、HPA3a/3b、HPA3b/3b频率分别是0.3851、0.5135、0.1014.经x2检验,结果符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律.邯郸地区随机献血者HPA1-5系统基因频率与石家庄地区相似(P＞0.05);与我国台湾人群进行HPA1-13、HPA-15的比较,HPA-1、-2、-6具有明显的不同(P＜0.05),其它相似(P＞0.05);与韩国人群进行HPA1-8的比较,除HPA-3具有明显不同外(P＜0.05),其余均相似(P＞0.05);与美国黑人进行HPA1-5的比较,HPA-1、-2、-5具有明显的差异(P＜0.05);与英国人进行HPA1-11的比较,HPA-1、-5具有明显的不同(P＜0.05).结论:北方地区中国人群HPA-2、-3、5、-15系统具有多态性,且HPA抗原分布不配合比率较高,这必然造成免疫暴露的机会增加,提示在临床上可能具有重要的免疫学意义.同时,在此次研究数据的基础上建立了邯郸地区血小板基因频率数据库和血小板已知型供者库.
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重组表达糖蛋白GPⅢa片段偶联荧光微球分析人血小板抗原-1系统同种抗体
目的:应用偶联血小板GPⅢa重组表达片段的Luminex xMAP荧光微球,检测血小板抗HPA-1a和-1b抗体.方法:以倍比稀释成12个浓度(原液～1/2048)的抗HPA-1a WHO国际标准品,比较MAIPA和Luminex xMAP技术检测抗HPA-1a的灵敏度.以8份抗HPA-1 a/b阴、阳性对照,36份WHO血小板抗体质控盲样,评估流式荧光微球技术检测抗HPA-1a和-1b的特异性.结果:MAIPA检测抗HPA-1a的灵敏度为滴度1/64(抗体浓度1.56 IU/ml),流式荧光微球检测的灵敏度远高于滴度1/2048(抗体浓度0.049 IU/ml).微球分析法能特异性鉴别抗HPA-1a和-1b阴、阳性对照.36份盲样中,有1份样本,在高浓度对偶抗体的影响下,产生抗HPA-1b假阳性结果.其余样本的微球分析结果与预期结果相符,能准确检出抗HPA-1a和-1b抗体,而且与HLA和ABO抗体以及其它的血小板抗体(包括抗HPA-3b、-5b、-15b、-GPⅠb/Ⅸ和非HPA-1特异性的抗-GPⅡb/Ⅲa)未发生交叉反应.结论:基于重组偶联血小板GPⅢa的流式荧光微球技术可灵敏、特异性检测血小板HPA-1系统抗体,适合于临床免疫性血小板减少症患者的抗体特异性鉴定.
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人类血小板特异性抗原基因的研究进展
随着血小板制品临床应用的日益广泛,血小板输注过程中产生的问题也明显增多.特别在临床上,许多患者由于血小板减少,血小板输注无效而影响了治疗,甚至发生出血,导致死亡等严重后果.同时,很多心血管疾病研究也表明人类血小板抗原(human platelet alloantigen HPA)在血小板黏附于血管壁及相互聚集过程中起着关键作用,是动脉粥样硬化基础上形成动脉血栓的重要原因之一,在心血管疾病的发生和发展过程中起到重要作用.
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孕期血小板抗原抗体检测的研究进展
大量研究发现妊娠与血小板抗体的产生有着密切的关系,孕妇孕期可能由于同种免疫性因素或自身免疫性因素产生抗血小板抗体,这些抗体可以通过胎盘屏障进入胎儿血液循环,与胎儿血小板结合发生抗原抗体反应,导致胎儿出现一系列血小板减少性出血性疾病,终使孕妇出现早期流产、复发性流产或新生儿出现免疫性血小板减少症.新生儿同种免疫性血小板减少症是由于同种免疫性因素引发的新生儿出血性疾病,该病在高加索人群中的发病率约为0.1％,在日本人群中的发病率约为0.15％,但在我国目前尚没有这方面的统计数据,该病发病较急,可出现全身皮肤和脏器的广泛出血,严重者会出现颅内出血甚至死亡.因此孕期进行血小板抗原抗体检测有着重要的意义,它能够有效地探讨反复流产的病因、早期预测及预防新生儿同种免疫性血小板减少症的发生.目前血小板抗原抗体的检测技术主要包括血清学和分子生物学检测技术,国内外也相继出现了一系列更为先进的检测技术.本文从血小板抗原抗体的分类、血小板抗体的产生及致病机制、新的血小板抗原抗体检测方法以及新生儿同种免疫性血小板减少症研究状况等多方面阐述了新的研究进展,以便引起临床医生及孕妇的重视,为血小板抗原抗体检测在孕妇日常产检中的推广提供重要的参考依据.
关键词： 孕妇 血小板抗体 人类白细胞抗原 人类血小板抗原 新生儿同种免疫性血小板减少症 -
人类血小板抗原（HPA）鉴定技术进展
人类血小板抗原（HPA）在临床医学和输血实践中具有重要意义。因此，对 HPA 进行快速、准确的检测是十分必要的。目前多种 HPA 血清学及分子生物学检测方法已进入自动化分析阶段，现对 HPA 鉴定技术的进展及其临床应用作一综述。
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长春地区无偿献血者HPA1-6,15基因分型
目的 调查北方汉族人群人类血小板抗原(HPA)的基因频率及分布规律.建立一支HPA-1a,-2a,-4a,-5a,-6a阴性及已知HPA抗原的献血者队伍.方法 随机抽取172名长春地区固定无偿血小板捐献者静脉血3ml,枸橼酸钠抗凝;采用TIANGEN试剂盒提取DNA.基因定量仪测定DNA的浓度和纯度.采用PCR-SSP方法进行试验.后进行统计学分析.结果 各表现型的频率分别是:HPA-1aa 0.988,HPA-1ab 0.012,HPA-2aa 0.833,HPA-2ab 0.159,HPA-2bb 0.008,HPA-3aa 0.355,HPA-3ab 0.482,HPA-3bb 0.163,HPA-4aa 0.988,HPA-4ab 0.012,HPA-5aa 0.971,HPA-5ab 0.029,HPA-6aa 0.977,HPA-6ab 0.023,HPA-15aa 0.286,HPA-15ab 0.498,HPA-15bb 0.216.未发现HPA 1bb、4bb、5bb、6bb.各基因型的频率分别是:HPA-1a 0.994,HPA-2a 0.913,HPA-3a 0.596,HPA-4a 0.994,HPA-5a 0.985,HPA-6a 0.988,HPA-15a 0.535.其中基因频率占99%以上的有HPA-1a、-4a.各基因型的不配合率分别是HPA-1a 0.011,HPA-2a 0.147,HPA-3a 0.366,HPA-4a 0.011,HPA-5a 0.028,HPA-6a 0.023,HPA-15a 0.374.结论 本研究有助于在长春地区建立已知HPA抗原的机采血小板捐献者队伍,可以提高血小板抗体的检出率,为同种免疫性血小板减少症患者提供HPA相合的血小板.
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HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b抗体MAIPA定量检测方法的建立
目的 分别建立针对人类血小板抗原(HPA)-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体的定量血小板(PLT)抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测(MAIPA)方法 .方法采用MAIPA方法检测不同浓度的标准或参比HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b抗血清,优化实验条件,在检测范围内绘制线性曲线,并分别分析其敏感性、特异性、准确性和精密度.结果 针对HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体的MAIPA定量检测方法得到了优化,检测范围分别为0～4 IU、0～20 AU、0～20 AU,准确性(回收率)分别为96.20％～103.10％、97.90％～103.10％、100.20％～106.10％.批内精密度[变异系数(CV)]分别为1.3％～3.6％、2.7％～5.2％和4.7％～5.3％,批间精密度(CV)分别为4.0％～5.6％、4.4％～5.9％和3.2％～6.3％,检测人源抗体抗A、抗B、抗I、抗P均无明显阳性,具有良好的特异性.结论 建立的针对HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b抗体的MAIPA定量检测体系均具有较高的敏感度、特异度、准确度和精密度,对于临床相关疾病的诊断和PLT安全输注具有重要的应用价值.
关键词： 人类血小板抗原 单克隆抗体特异性免疫固定检测 定量 标准体系 -
固相凝集法检测血小板抗体的临床意义
目的 探讨不同类型血小板抗体检测在临床中的意义.方法 采用固相凝集法对108例血小板减少的患者进行血小板同种抗体和血小板自身抗体的检测分析.结果 108例血小板减少的患者检测出血小板同种抗体阳性77例,阳性率为71.3％,其中再生障碍性贫血20例,急性白血病14例,慢性白血病10例,骨髓增生异常综合征6例,血小板减少症27例.对77例血小板同种抗体筛查阳性的患者进行同种异型和自身(结合、游离)抗体的检测,结果仅血小板减少症表现为同种异型、自身(结合、游离)抗体及同种异型+自身抗体三类情况均有阳性病例,再生障碍性贫血、急性白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合征等均仅表现为单一同种异型抗体阳性.结论 患者机体对来自不同血小板抗原刺激可产生不同类型的血小板抗体,血小板抗体的检测对临床有着重要的诊疗作用.
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第2胎抗HPA-3a抗体可使新生儿同种免疫血小板减少症患儿病情加重
目的 观察1例第2胎抗HPA-3a抗体致新生儿同种免疫血小板减少症(NAIT)患儿的病情与治疗情况.方法 观察患儿症状和体征,并记录血小板(PLT);筛查并鉴定患儿及其母亲血清中血小板特异性抗体;检测患儿及其父母HPA-1～21 bw系统基因分型;监测患儿体内抗体效价波动情况并筛选配合性血小板给予输注治疗.结果 患儿出生后15 min内出现瘀斑、皮下出血点,脑部B超提示左侧室管膜下出血.患儿及母亲血清中均含与患儿父亲血小板反应的特异性抗体,经鉴定为抗HPA-3a抗体.HPA-1 ～ 21 bw系统基因分析显示患儿与其父母HPA-3不相容:母亲为HPA-3bb、父亲为HPA-3aa、患儿为HPA-3ab.患儿共输注了4次相容血小板(HPA-3bb),并给予静脉输注γ球蛋白及类固醇激素治疗,于出生后第29天PLT恢复正常后出院.结论 第2胎抗HPA-3a抗体致NAIT患儿经对症治疗及输血治疗PLT恢复正常后出院,但临床表现及诊治过程较该产妇上一个患儿严重及复杂.
关键词： 新生儿 血小板减少 新生儿同种免疫血小板减少症 人类血小板抗原 HPA-3a -
南京地区汉族人群中人类血小板抗原基因多态性及分析
人类血小板抗原(Human platelet antigen,HPA)分型对临床上一些因血小板同种免疫反应导致的同种免疫性疾病,如新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(NAITP), 输血后紫癜(PTP)及血小板输注无效(PTR)等的诊断和治疗有重要意义[1-3].长时期来,人们一直沿用传统的血清学方法进行HPA分型,但由于难以获得高质量、特异性抗血清等多种因素的制约,HPA分型工作始终无法深入下去.随着对HPA基因研究的深入,近年来国外陆续报道将基因检测技术用于血小板分型研究中.本文应用聚合酶链- 序列特异性引物(PCR-SSP)技术,对南京地区100名健康献血员HPA1-5系统等位基因进行分型,现报告如下.
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河南汉族人群血小板抗原HPA1-16bw基因多态性研究
目的 研究河南地区汉族人群血小板抗原基因分布频率,建立地区性血小板抗原基因库,为血小板配合输注提供实验依据.方法 用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)对160例无血缘关系的河南汉族体检健康者进行HPA1-16bw系统基因分型.结果 HPA1-6和HPA-15基因频率分别为1a 0.987 5,1b 0.012 5;2a 0.946 9,2b 0.053 1;3a 0.590 6,3b0.409 4; 4a0.996 9,4b0.003 1;5a0.990 6,5b0.009 4;6a0.981 2,6b0.018 8;15a0.540 6,15b 0.459 4.HPA7-14bw,16bw仅检测到a/a等位基因,基因频率均为1.000 0.经x2检验各系统HPA符合Hardy-Weinberg平衡法则.HPA基因分布存在种族和地区差异.结论 河南汉族人HPA-15和HPA-3基因型杂合率高.HPA基因分型有助于输注血小板时降低免疫性血小板减少症的发生概率.
关键词： 人类血小板抗原 序列特异性引物聚合酶链反应 基因分型 基因频率 -
人类血小板抗原1～6和Gov系统的PCR-SSP同步基因分型
目的:采用序列特异性引物PCR (PCR-SSP)对人类血小板抗原(HPA) 1～6、Gov系统进行同步基因分型,以确定中国大陆汉族人群中的HPA等位基因频率. 方法:随机采集100名中国大陆汉族无偿献血者外周血标本,采用酚/氯仿方法提取基因组DNA.设计合成21条序列特异性引物,在相同的PCR循环条件下对HPA-1～6和Gov进行PCR-SSP同步基因分型. 结果:100名随机供血者中观察到的基因频率分别是HPA-1a和1b为1.000和0.000,HPA-2a和2b为0.995和0.005,HPA-3a和3b为0.655和0.345,HPA-4a和4b为1.000和0.000,HPA-5a和5b为0.990和0.010,HPA-6a和6b为0.980和0.020,Gova和Govb为0.515和0.485.中国人HPA-1～6、Gov的基因频率与亚洲其他人群相一致,HPA-3a/3b和Gova/Govb基因频率在包括高加索人在内的不同人群中基本相等.结论:中国大陆汉族人群中Gov和HPA-3等位基因分布有其自身特点.
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洛阳地区血小板抗原等位基因频率的鉴定
目的 调查本地区人群血小板抗原(HPA)系统等位基因的分布频率,并进行随机输血风险评估.方法 随机收集无偿献血者样本400份,应用PCR-SSP技术检测血小板抗原的基因型.结果 所有样本中均含有高频基因“a”、“aa”、“ab”、"bb”三种基因,在HPA-3和HPA-15中所占比例的差异无统计学意义,但在所检测的其他抗原中分布不均,各种抗原引起随机输血不合概率的差异有统计学意义.结论 HPA-3和HPA-15是引起洛阳地区血小板输注不合的主要原因,基因鉴定技术可为血小板输注无效患者提供HPA相合的血小板.
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人类血小板抗原-1系统基因分型方法的建立及初步应用
目的建立人类血小板抗原-1系统的基因分型方法,并对本地区献血小板者进行血小板抗原-1基因分型.方法以人类基因组DNA为模板,设计特异性引物,扩增目的基因,用琼脂糖凝胶电泳观察;同时将PCR产物纯化后进行测序,将其结果进行同源性比较;再用已建立的方法对本地区的献血小板者进行人类血小板抗原-1基因分型.结果成功建立了人类血小板抗原-1基因分型方法;本地区的HPA-1a、HPA-1b基因频率分别为97.7%、2.3%.结论构建的人类血小板抗原系统-1基因分型方法结果准确,操作简单,为建立血小板血型库奠定基础.
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应用PCR-SSP方法进行人类血小板抗原1～6系统的基因分型
目的研究采用PCR-SSP技术,建立人类血小板抗原1～6系统(HPA-1,2,3,4,5,6)的基因分型方法.方法合成18条序列特异性引物,通过调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索佳PCR扩增条件,建立HPA-1～6系统同步基因分型技术.对第10届及第11届国际输血协会(ISBT)血小板基因定型协作组送检的考核样本进行盲检来验证.并应用该技术对198名深圳地区健康的血小板志愿捐献者进行基因分型.结果应用本研究的方法,对第10届及第11届ISBT送检的考核样本进行基因分型,结果与ISBT公布的结果完全一致,符合率达100%.对198名随机的血小板志愿捐献者观察到的基因频率分别是:HPA-1a和1b为0.9924和0.0076,HPA-2a和2b为0.9545和0.0455,HPA-3a和3b为0.5556和0.4444,HPA-4a和4b为0.9975和0.0025,HPA-5a和5b为0.9848和0.0152,HPA-6a和6b为0.9798和0.0202.结论本研究建立的HPA基因分型技术具有简便、快速、准确的特点,适合于常规HPA基因分型,具有广泛的应用前景.
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血小板及其相关因子在妊娠过程中的特异性作用
妊娠过程既是一个母体对胎儿体内父源抗原产生同种免疫的过程,也是一个血小板激活、血液中凝血因子增加的过程.在病理性妊娠中,血小板的活性以及其释放的多种血浆标志物会产生特异性的改变.本文就血小板及其相关因子在妊娠过程中的特异性作用作一简要综述.
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贵阳地区汉族人群 HPA-1～5基因多态性与2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化的关系
目的：研究贵阳地区汉族人群中人类血小板抗原（HPA）1～5基因多态性与2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化的相关性。方法2型糖尿病患者99例（糖尿病组），按有无颈动脉粥样硬化分为CA （＋）组（ n＝56）和CA （-）组（ n＝43）两个亚组，同期健康体检者100例作为正常组，采用酚-氯仿法提取基因组DNA，序列特异性引物-多聚酶链反应（SSP-PCR）技术扩增目的基因，进行HPA基因分型。结果正常组、CA（＋）组、CA（-）组三组间的HPA-1、2、3、5等位基因频率及基因型比较，差异均有统计学意义（ P均＜0．05）；正常组与糖尿病组的HPA-1、2、3等位基因频率及基因型比较，差异均有统计学意义（P均＜0．05）；CA（＋）组与CA（-）组的HPA-5等位基因频率及基因型比较差异有统计学意义（P＜0．05）。经Logistic回归分析，年龄、糖尿病病程、高血压、吸烟、超重、血脂异常、HPA-5基因多态性为2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化发生的危险因素（ P均＜0．05）。结论 HPA-1、2、3基因多态性与贵阳地区2型糖尿病的发生可能存在相关性，HPA-5基因多态性可能是2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化发生的危险因素。
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937人份石家庄地区血小板捐献者基因资料库的建立
目的:建立石家庄地区已知HLA-I(A、B位点)、HPA基因型别机采血小板捐献者基因资料数据库,探讨石家庄地区血小板捐献者HLA-I(A、B位点)和HPA-1～17系统基因多态性分布特点.方法:采用聚合酶链反应-序列特异引物(PCR-SSP)方法石家庄地区937例无血缘关系的血小板捐献者血液样本进行HLA-I类基因A、B位点、HPA-1～17系统基因分型,计算基因频率和基因型频率.结果:937例无血缘关系的血小板捐献者共检出HLA-A位点抗原特异性18种,其中等位基因频率较高(＞0.05)的特异性依次有A2(0.374 1)、A11(0.166 5)、A24(0.160 7)、A30(0.074 9)、A33(0.065 1)、A1(0.058 2)、A3(0.054 9);检出HLA-B位点抗原特异性40种,频率大于0.05的有8个,依次为B13(0.140 6)、B46(0.077 7)、B61 (0.074 9)、B51 (0.074 9)、B62(0.068 0)、B35(0.059 9〉、B60(0.056 5)、B44(0.050 3),HLA-A-B单体型频率高的为A2-B13(0.045 9),其次为A2-B46(0.029 9);河北地区汉族人群HPA基因HPA-7～14、HPA-16、HPA-17均为aa纯合子,未检出b等位基因.HPA-1～6、15中杂合度高的为HPA-15,不配合率为37.45％;其次为HPA-3,不配合率为36.64％;然后为HPA-2,不配合率为6.84％;在HPA-1～6和15中,HPA-4的杂合度低,不配合率仅为0.22％.结论:初步建立了石家庄地区本地化HLA-A-B和HPA-1～17基因分型库,并进行了基因频率和单体型频率统计,该基因资料库可为患者提供HLA和HPA相容或相合的血小板,减少血小板输注无效的发生.
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214例脑梗死患者与HPA-1～5、15基因多态性关系的检测与分析
目的:探讨老年易感病脑梗死与HPA 1～5、15基因多态性的相关性.方法:采用PCR-SSP技术对214例60岁以上脑梗死病例组和220例健康体检者对照组进行HPA-1～5、15系统基因分型,并应用统计学方法对两组进行χ2检验和Logistic回归分析.结果:①HPA-2抗原系统多态性病例与对照组比较差异有统计学意义.脑梗死组基因频率(a=0.915 9,b=0.048 1)与对照组基因频率(a=0.977 3,b=0.022 7)相比较P＜0.01;脑梗死组基因型频率(aa=0.831 8,ab=0.168 2,bb=0)与对照组基因型(aa=0.9545,ab=0.0455,bb=0)相比较P＜0.01.②HPA-2回归分析:脑梗死HPA-2b基因和HPA-2ab基因型均显著高于对照组,以HPA-2aa为指示符进行Logistic回归分析并以年龄调整后,HPA-2ab的OR值=4.123(95％CI=1.981～8.581).结论:HPA-2抗原系统基因多态性可能是本地区老年人群脑梗死发病的遗传易感因素,HPA-2b可能是其易感基因,HPA-2ab可能是其易感基因型.
