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骨髓间质干细胞体外转分化为肌细胞的实验研究
研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为肌源性细胞的可行性.由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞,纯化培养后用不同浓度的5氮杂胞苷(5-azacytidine)诱导,用透射电镜、免疫组化、动作电位、cTnI(肌钙蛋白)检测、Ach(乙酰胆碱)刺激后的反应等鉴定诱导后细胞.结果显示经5-氮杂胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞在透射电镜下可以观察到细胞内有明显的肌丝,免疫组化可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色,电生理检查表明诱导后细胞是可兴奋细胞,可检测到cTnI,Ach刺激后细胞表现为舒张反应.我们认为骨髓间充质干细胞可在体外经5-氮杂胞苷诱导后转分化为肌源性细胞.
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狗骨髓基质干细胞体外分化为肌源性细胞的初步观察
用贴壁法体外分离骨髓基质干细胞,实验组5-氮胞苷诱导,对照组加入等量培养基,用相差显微镜和免疫组织化学方法观察、鉴定培养细胞.探讨成年狗骨髓基质干细胞体外诱导分化为肌细胞的可行性,为心肌梗死和心力衰竭的细胞移植治疗提供新的细胞系.结果表明,实验组诱导后4周,多数培养细胞由梭形变为杆状,免疫组织化学检查结蛋白、平滑肌肌动蛋白和肌钙蛋白I染色阳性;对照组多数培养细胞为梭形,免疫组织化学检查结蛋白染色弱阳性,平滑肌肌动蛋白染色弱阳性,肌钙蛋白I染色阴性.结果提示,成年狗骨髓基质干细胞体外可诱导分化为肌源性细胞.
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大鼠筋膜源性细胞与肌源性细胞成骨能力的对比研究
背景:自体骨髓来源的间充质干细胞具有多分化潜能,能向成骨、成软骨细胞分化,加速骨组织及软骨组织的形成,但是成骨能力各不相同,哪种细胞的成骨能力更强有待进一步研究.目的:比较大鼠筋膜源性细胞与肌源性细胞的成骨能力.方法:从20只大鼠骨骼肌筋膜分离出筋膜源性细胞,从骨骼肌肌腹中分离出肌源性细胞.用流式细胞仪分选筋膜源性细胞和肌源性细胞,培养细胞.利用retro-BMP4病毒转染FDC-LacZ细胞.经过2次转染,转染的筋膜源性细胞通过LacZ和碱性磷酸酶的染色而测定出转染效率.结果与结论:肌源性细胞产生的软骨细胞、钙盐沉积均多于筋膜源性细胞.提示大鼠肌源性细胞的成骨能力强于筋膜源性细胞.
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人脐带华通氏胶间充质干细胞的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力
目的 探讨人脐带华通氏胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton's Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力.方法 收集健康足月产胎儿脐带组织,采用酶消化法从华通氏胶中分离hUCMSCs,选取第3代对数生长期细胞,显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞免疫表型分子的表达,免疫荧光染色检测干细胞标记物及其体外向肌源性细胞的分化,荧光显微镜观察及流式细胞术检测携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染hUCMSCs后GFP的表达.结果 采用酶消化法获得可贴壁生长的大量hUCMSCs,其能在体外成功进行扩增培养.hUCMSCs可高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,而极低表达CD14、CD34、CD45和HLA-Ⅱ;能表达干细胞标记物Oct4和Sox2,且在体外特殊培养条件下表达骨骼肌干细胞标记物Pax7和MyoD;转染的hUCMSCs可稳定表达GFP,转染率高达50％～70％.结论 人脐带华通氏胶组织存在间充质干细胞,且其具有向肌源性细胞分化的潜能.
关键词： 人脐带华通氏胶间充质干细胞 肌源性细胞 细胞分化 -
BMP4、VEGF、sFlt1多基因逆转录病毒转染肌源性细胞对小鼠体内成骨过程的影响
目的:研究以肌源性细胞为基础的BMP4 、VEGF、sFh1多基因治疗在小鼠体内对成骨过程的影响.方法:分别以2种肌源性细胞C2C12和PM为细胞载体,用BMP4、VEGF、sFlt1逆转录病毒进行重复转染.2种肌源性细胞分别重复转染后,产生6组实验细胞,分别是C2C12-B-sFlt1、C2C12-B、C2C12-B-VEGF、PM-B-sFlt1、PM-B、PM-B-VEGF.6组细胞在体外复合明胶海绵后分别植入小鼠的股肌袋内.术后不同时间应用组织学、X线检查观察各组的成骨量以及软骨化骨的组织学演变过程.结果:C2C12-B-sFlt1和C2C12-B 2组细胞在体内可引发软骨化骨过程,2组的成骨量在特定的时间段内无明显区别,但X线检查显示2组的成骨空间方向不尽相同.C2C12-B-VEGF在体内没有诱发软骨化骨的过程,其所诱发的组织学过程类似血管瘤.PM-B-sFlt1、PM-B、PM-B-VEGF 3组细胞在体内诱发软骨化骨的过程较为类似,3组的成骨量在35 d的观察期内无明显区别.结论:骨骼肌源性细胞可作为BMP4基因治疗的基础细胞,而在增加了VEGF和sFlt1基因的复合基因转染后,其软骨化骨的表现具有细胞种群的特异性.
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犬骨髓基质干细胞体外诱导分化为肌源性细胞的研究
目的:探讨成年犬骨髓基质干细胞(MSSCs)体外诱导分化为肌源性细胞的可行性.方法:用贴壁法体外分离MSSCs,实验组5-氮胞苷诱导,对照组加入等量的培养基,用相差显微镜、免疫组织化学和电镜方法观察、鉴定培养细胞.结果:实验组培养细胞诱导后4周,多数培养细胞由梭形变为杆状,免疫组织化学检查结蛋白、平滑肌肌动蛋白和肌钙蛋白Ⅰ染色阳性;对照组多数培养细胞为梭形,免疫组织化学检查结蛋白染色弱阳性,平滑肌肌动蛋白染色弱阳性,肌钙蛋白Ⅰ染色阴性;电镜下实验组培养细胞内可见肌丝样结构,对照组培养细胞无明显肌丝样结构.结论:成年犬MSSCs体外可诱导分化为肌源性细胞.
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重组腺相关病毒载体介导的人载脂蛋白AⅠ及载脂蛋白AⅠ Milano在肌源性细胞C2C12中的表达
目的以重组2型腺相关病毒为载体介导人载脂蛋白AⅠ及载脂蛋白AⅠ Milano在小鼠肌源性细胞C2C12中的表达,探索一种崭新的预防、治疗动脉粥样硬化性疾病的途径.方法以正常人肝组织中抽提的RNA为模板,用逆转录聚合酶链反应获得人载脂蛋白AⅠ cDNA,点突变制备载脂蛋白AⅠ Mihno cDNA.分别将载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅠ Milano的cDNA插入重组2型腺相关病毒载体质粒,并与辅助质粒共转染包装细胞293T获得编码人载脂蛋白AⅠ和载脂蛋白AⅠ Milano的重组腺相关病毒载体,粗提后以冰乙醇法进行浓缩.斑点杂交检测重组2型腺相关病毒载体滴度,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度.分别用含载脂蛋白AⅠ或载脂蛋白AⅠ MihnocDNA的编码人载脂蛋白AⅠ和载脂蛋白AⅠ Milano的重组腺相关病毒对小鼠肌源性细胞C2C12进行感染,酶联免疫吸附法检测蛋白表达情况.结果聚合酶链反应产物序列正确,点突变成功.编码人载脂蛋白AⅠ和载脂蛋白AⅠ Milano的重组腺相关病毒的滴度均在2×1014个/L左右.重组2型腺相关病毒纯度良好.载脂蛋白AⅠ及载脂蛋白AⅠ Milano分别获得0.39±0.04 mg/L和0.31±0.03mg/L的表达水平.结论成功制备表达载脂蛋白AⅠ或载脂蛋白AⅠ Mfiano的重组腺相关病毒载体,并在C2C12细胞中获得有效表达,为进一步探索方便、安全的预防和治疗动脉粥样硬化性疾病的方法打下了基础.
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骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达
目的体外诱导兔骨髓间充质干细胞向肌源性细胞分化,并观察血管内皮生长因子AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)后的表达.方法将20只兔随机分为对照组和实验组,从骨髓液中分离MSCs,对照组以低糖DMEM培养,实验组加用5-氮胞苷(10 mmol/L)诱导培养,第28天进行肌钙蛋白Ⅰ免疫组化染色.另构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒,通过脂质体转染对照组MSCs,用Northernblotting 和Western blotting鉴定血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并用ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度.结果成功分离培养出兔MSCs,实验组经5-氮胞苷诱导后MSCs向肌源性细胞分化,肌钙蛋白Ⅰ免疫组化染色阳性.成功构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒并通过脂质体转染MSCs,Northern blotting示转染的MSCs VEGF165表达信号明显强于未转染细胞,Western blotting示转染VEGF165基因的MSC表达VEGF,ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度在转染后第3天(1 011pg/ml)和第5天(1 027pg/m1)达高峰,此后逐渐下降,但至第13天(349pg/m1)仍显著高于空白对照(116pg/ml)和pAdTrackCMV组(125 pg/m1),P＜0.01.结论兔骨髓间充质干细胞可在体外向肌源性细胞分化,转染VEGF基因可表达VEGF,有望将干细胞移植和基因治疗结合以治疗缺血性心脏病.
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Ad-hBMP-2基因修饰对兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的影响
2001年,Zuk等[1]首次报告从人体脂肪组织提取物(processed lipoaspirate, PLA)中发现有一群具有向多种组织分化潜能的多能干细胞,称之为脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs);并成功地在体外增殖、分化.目前已证实,ADSCs在外来生长因子的诱导下可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌源性细胞等多种组织细胞[1-4];骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是间充质细胞向骨细胞系分化的初始因子,也是成骨细胞有丝分裂与增殖起至关重要作用的因子[5,6].笔者观察了转染hBMP-2基因的脂肪干细胞向成骨细胞分化、增殖的能力变化,从而为其治疗骨缺损提供理论依据.
