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肝癌患者血清和癌组织中锌指蛋白216表达增加
目的 寻找肝癌相关抗原.方法 应用SEREX技术对肝癌组织cDNA文库进行血清学筛选,获得人类锌指蛋白ZNF216.利用原核表达和亲和层析技术获得ZNF216的6*His融合蛋白,建立间接ELISA方法,检测血清中产生的ZNF216抗体水平;利用RT-PCR技术检测肝癌患者肝癌组织及癌旁组织内ZNF216 mRNA的水平.结果 肝癌患者血清中产生的抗ZNF216抗体水平高于正常个体,ZNF216 mRNA在肝癌组织内的表达明显高于癌旁组织.结论 ZNF216在肝癌病人血清及癌组织内的过表达可能参与肝癌的发生,但还需要进一步研究证明.
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急性单核细胞白血病新抗原MLAA-22的生物信息学分析及相关鉴定
本研究采用生物信息学方法对SEREX法筛库获得的急性单核细胞白血病抗原新基因MLAA-22进行分析,并进一步做基因表达鉴定.通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索MLAA-22基因的相关信息,分析MLAA-22抗原CTL表位,制备其多克隆抗体;利用荧光定量PcR及免疫印迹鉴定的方法,在转录翻译水平检测该基因的表达.结果表明:肿瘤抗原新基因MLAA-22 cDNA全长为2.0 kbb,定位于染色体17q11.2,编码631个氨基酸,蛋白分子量约72.4 kD,非分泌型,亚细胞定位在胞浆,属于不稳定蛋白,但具有一定的亲水和热稳定性,无信号肽.MLAA-22有多个基序(motif),可能在细胞的生长、增殖、分化和凋亡中具有重要作用.应用Protean等软件分析选取了序列543-556位作为MLAA-22的抗原表位,采用多通道同步固相全自动合成系统合成15肽,将纯化后的MLAA-22预测抗原多肽通过C末端Cys的-SH与KLH偶联,免疫兔子,制备相应的多抗,ELISA法检测抗体效价1:8000.Real-time PCR和Western blot检测结果显示MLAA-22在M,患者中有不同程度的表达,且表达量高于正常人,在其他血液肿瘤细胞中低表达,但在胃、肾和前列腺癌等组织中不表达.结论:mlaa-22是一个新的急性单核细胞白血病相关抗原新基因,有进一步研究的价值.
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多发性骨髓瘤相关抗原的免疫学筛选及生物信息学分析
本研究采用"cDNA表达文库的血清学分析(serological analysis of cDNA expression library,SEREX)"技术筛选骨髓瘤HMy2细胞cDNA表达文库.将得到的30个阳性克隆全部进行测序,并进行BLAST同源序列比对分析.结果表明:获得已知基因6条,骨髓瘤相关肿瘤抗原新基因12条.经部分序列EST拼接,已知基因6条如环指蛋白167、KLF10因子、TPT1蛋白、p02蛋白、cDNA FLJ46859 fis、DNMT1甲基转移酶等,它们与其他肿瘤的形成、发展与预后有一定的关系.利用生物信息学对新基因结构和功能初步分析和预测显示,其中MMSA-3、MMSA-8和MMSA-11有完整的编码区,编码的蛋白长度分别为215、160和122个氨基酸;除MMSA-1可能定位于性染色体,其余均可能定位于常染色体;MMSA-4和控制转录的肿瘤蛋白高度相似,MMSA-5可能参与细胞的吞噬作用,MMSA-7可能使NF-κB失活,MMSA-12可能为淋巴细胞的胞质蛋白.CrELISA初步分析表明,MMSA-3和MMSA-7等新基因特异性较高.结论:本项研究所筛选和鉴定的肿瘤抗原可用于多发性骨髓瘤的早期免疫学诊断、残留病灶监测、判断预后及肿瘤疫苗制备等多种研究.
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用SEREX方法筛选HCC抗原及hcct-19表达谱的检测
目的:用SEREX方法鉴定HCC表达的肿瘤抗原,检测hcct-19的表达谱.方法:将HCC表达文库铺板,IPTG诱导蛋白质表达,BSA封闭.同1:1 000稀释的预吸收HCC患者血清反应后,与1:5 000稀释的羊抗人抗体反应,在BCIP/NBT的作用下显色,挑取阳性克隆噬菌斑块,重复筛选和铺板3次,直至得到一致的单克隆免疫阳性重组噬菌体.挑取阳性克隆噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,PCR产物纯化测序,序列结果用BLAST软件同GenBank中的已知基因进行对比分析.检测阳性克隆抗原基因hcct-19在部分正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞株中的表达,半定量RT-PCR方法检测阳性克隆抗原基因在肝癌及癌旁组织中的表达.结果:共得到31个阳性克隆,代表14个不同的cDNA序列,其中10个为已知功能的基因,4个为未知功能的基因.在已知功能的基因中,RFC2、NDUFA4及MCART1首次被发现与HCC有关.hcct-19在部分正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞株中表达,在肝癌组织中的表达强度明显高于癌旁组织(13.2±2.7 vs 2.9±0.3,P＜0.05).结论:本实验筛选出的HCC抗原有助于进一步阐明HCC的形成过程.hcct-19可能作为一个过量表达的基因参与了HCC的发病过程.
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SEREX方法鉴定CTCL细胞肿瘤抗原
目的 分离纯化皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞系SeAx细胞膜蛋白并制备多克隆抗体.利用SEREX法从SeAx cDNA噬菌体表达文库中筛选肿瘤抗原.方法 培养SeAx细胞至2×1010个,用组织匀浆器匀浆后差速离心法分离细胞各组分,富集细胞膜抗原.用细胞器特异性抗体对纯化步骤中的各组分进行检测.用膜蛋白组分免疫家兔4次,每次免疫后用ELISA法测定血清抗体滴度.4次免疫后用Western blot方法测定多抗与SeAx细胞各组分蛋白反应的特异性.重组噬菌体感染大肠杆菌,将表达的重组蛋白转印到硝酸纤维素膜上,与SeAx细胞膜蛋白免疫的兔血清进行反应,阳性的克隆测定核苷酸序列,通过数据库搜索比较确定基因.结果 用差速离心法得到SeAx细胞膜蛋白,免疫家兔4次后获得了效价为1×10-5的多克隆抗体.共筛选了1×106个噬菌体克隆,得到25个阳性克隆,经核苷酸序列测定和数据库分析,其中4个cDNA片段为膜蛋白成分,分别为integrin alpha 4,ligatin,matrix metalloproteinase 24和MHC-I molecule HLA-A.结论 分离并纯化了CTCL细胞系SeAx细胞膜蛋白,成功制备了多克隆抗体,用SEREX方法从SeAx mRNA建立的cDNA噬菌体表达文库中筛选到4个肿瘤细胞膜蛋白基因,它们可以引起机体产生体液免疫反应,并可能成为潜在的免疫治疗靶点.
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从大肠癌组织cDNA表达文库筛选肿瘤抗原基因
目的利用肿瘤患者血清筛选大肠癌cDNA噬菌体表达文库,寻找肿瘤特异性抗原基因.方法采用SMART技术构建中国人大肠癌cDNA噬菌体表达文库.用SEREX方法筛选中国人大肠癌组织cDNA噬菌体表达文库.对获得的阳性克隆片段进行测序、鉴定和BLAST同源性比较,并对其生物信息进行分析.结果成功地构建了大肠癌cDNA噬菌体表达文库,原始文库含2.39×106个重组子,重组率达到97.5%,文库扩增后滴度达到4.1×1010pfu/ml.插入外源性cDNA片段的大小为0.5～4.0kb.SEREX筛选共获得16个阳性克隆,代表12个不同抗原基因,其中10个基因片段为已知抗原基因,如IFITM1、CD24、Survivin、KLK6等,2个为未知 EST片段.根据序列分析,筛选出的抗原基因有结构基因、调节基因、代谢相关基因等.结论利用SEREX方法筛选出大肠肿瘤相关抗原基因并获得2个肿瘤抗原候选基因.
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SEREX技术分析筛选乳腺癌自身抗体标志物的研究
目的:自身抗体是目前受关注的一类肿瘤标志物候选分子,有助于提高乳腺癌检测的敏感性和特异性.鉴于单一一个乳腺癌文库的丰度有限,而且乳腺癌和肺癌发生来源相近,本研究从肺癌文库筛选乳腺癌特异性自身抗体标志物.方法:重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)联合生物淘洗富集技术从肺癌cDNAT7噬菌体文库中筛选乳腺癌相关蛋白,测序鉴定得到噬菌体表达蛋白信息.免疫印迹和酶联免疫吸附(ELISA)分析每一个开放阅读框架内的噬菌体表达蛋白的自身抗体水平.逻辑回归模型和留一交叉验证评估诊断价值.结果:筛选得到2个开放阅读框架内蛋白序列信息.通过免疫印迹和ELISA分析,这2个噬菌体表达蛋白能显著区分出病人和正常人.逻辑回归模型联合检测的敏感性达到82.4％,特异性达到88.2％;留一交叉验证两者联合的预测值敏感性和特异性分别达到78.5％和82.1％.结论:SEREX是有效的肿瘤自身抗体标志物筛选技术,从肺癌文库筛选乳腺癌特性抗原的方法是可行的,同时HSPA4L和RINT-1蛋白的血清白身抗体联合对乳腺癌的检测准确率要好于其中任何一种标志物.
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从卵巢癌cDNA文库中筛选新的肿瘤标志物
采用SEREX法筛选了自行构建的中国人卵巢癌cDNA表达文库,得到27个阳性克隆,其中3个为全长cDNA.序列分析和同源性比对结果表明所获得的27个克隆分属于分化抗原、细胞结构蛋白及功能未知三类.选择其中一个全长cDNAMY-OVA-13(该基因编码的蛋白是MAD2),利用基因工程方法克隆、表达和纯化得到目的蛋白,采用点杂交方法检测了MY-OVA-13目的蛋白与正常人和肿瘤患者中的血清学反应.MY-OVA-13抗体只在肿瘤组中检测到(5/74),在正常组中均为阴性;间接ELISA测定结果显示,MY-OVA-13抗体的水平在肿瘤组中均高于正常组,其中肝癌和前列腺癌组与正常组相比,在统计学上有显著差异,P值分别＜0.01和＜0.05.我们的初步结果表明MY-OVA-13及其抗体具有一定的肿瘤特异性,有可能作为肿瘤诊断的标志物.
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SEREX筛选肿瘤抗原进展
肿瘤抗原的鉴定是肿瘤免疫学的重要任务之一,也是肿瘤免疫治疗发展的必然途径.重组cDNA表达文库的血清学分析法(serological analysis of re-combinant cDNA expression library,SEREX)是一种重要的筛选肿瘤抗原的方法,为临床肿瘤标志物的筛选、鉴定及肿瘤疫苗的研制提供了重要的技术手段.
关键词： SEREX 重组cDNA表达文库 血清 肿瘤抗原 -
应用SEREX技术筛选肿瘤抗原的研究进展
SEREX(serological identification of antigen by recombi-nant cDNA expression libraries)技术,即重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术,是由德国血清学家Sahin等[1]建立的从分子水平鉴定肿瘤抗原的方法.其理论基础是肿瘤能刺激机体产生免疫反应,人体B淋巴细胞可以识别自身肿瘤抗原,产生高价抗体,引起强烈的IgG反应.
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SEREX在肿瘤抗原分析中的研究进展
重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)为一种新的寻找抗原的方法,即利用患者自体血清对重组表达的cDNA克隆进行筛选,以获得相关抗原基因.这类抗原在荷瘤患者体内能诱导出多重免疫反应,且其核苷酸序列和蛋白质结构较易在分子水平确定,这一方法的运用,为发现新的肿瘤抗原开辟了一个崭新的领域,为肿瘤的免疫治疗的发展提供了一个现实的基础.
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SEREX技术筛选及鉴定食管癌肿瘤抗原
背景与目的:正常细胞向癌细胞转化过程中,突变的基因或各种异常表达的蛋白可以成为肿瘤抗原诱导机体的免疫反应,因此肿瘤患者的血清中存在着与肿瘤相关的自身抗体.重组cDNA表达文库血清学分析法(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX)是利用肿瘤患者血清中的自身抗体筛选、鉴定肿瘤抗原的技术.本研究拟采用SEREX的方法寻找食管癌自身抗体的相关肿瘤抗原,鉴定与食管癌发生、发展相关的基因和免疫治疗分子靶点,并为食管癌的诊断提供候选血清标志物.方法:用食管癌组织建立库容量达1.6×106 pfu的cDNA表达文库,SEREX筛选获得21个不同cDNA序列的阳性克隆,进一步使用SADA法分析其中4个抗原在10例食管癌及10例正常人血清中的反应.结果:在Homosapiens desmin(DES)等21个阳性克隆中,4个克隆与已知EST序列明显无同源性,另外17个克隆与已知基因高度同源.Ribosomal protein S4等4个抗原与食管癌患者和正常人血清反应阳性率分别为40%和0%、60%和10%、70%和20%、30%和20%.结论:Ribosomal protein S4等4个抗原普遍参与了食管癌患者的体液免疫反应,与食管癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清.本研究发现的21个食管癌抗原可作为食管癌治疗的潜在分子靶点和食管癌诊断新的候选血清学标志物.
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大肠癌抗原基因的筛选与初步分析
目的筛选鉴定大肠癌抗原基因,并进行生物信息学的初步分析.方法采用自体或异体大肠癌患者血清,应用SEREX方法对大肠癌cDNA噬菌体表达文库进行免疫筛选.阳性克隆噬菌体在扩增、提取、纯化DNA后,用PCR方法和EcoR Ⅰ、HindⅢ双酶切鉴定cDNA片段的大小.阳性克隆cDNA插入pUCm-T载体测序.序列生物信息学分析采用NCBI的All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequences Database进行BLAST基因比对分析.结果筛选出11个阳性克隆,cDNA片段大小分别为1100、1300、1000、2000、1200、1200、700、900、600、1200和1000 bp,代表9个抗原基因,7个与已知基因同源.有3个阳性克隆为同1个基因片段,与干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因同源,具有抗增殖作用;另6个阳性克隆分别与不同的基因同源,分别是:BAC clone RP11-453E17"肿瘤解剖计划"基因,功能尚不清楚;软骨-毛发发育不良区基因,发生软骨-毛发发育不良综合征;人5号染色体克隆的序列,有插入突变,功能尚不清楚;类似抗肿瘤坏死因子α抗体的轻链Fab段基因,与IgG1抗体的γ链(重链)和κ链(轻链)的编码和调控其生物功能有关,可能与肿瘤的生长有关;β2微球蛋白的mRNA,与肿瘤细胞的增殖有关;醛缩酶A基因,异常表达可能促进肿瘤细胞的增殖;尚有2个阳性克隆的cDNA序列没有同源性,功能有待进一步研究.结论用SEREX方法筛选大肠癌cDNA表达文库,可直接获得有价值的大肠癌抗原基因,对大肠癌发病机制的研究以及探讨早期诊断方法有重要意义.
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SEREX技术及其在自身免疫疾病研究中的应用
SEREX是一种将基因克隆技术与血清筛选技术相结合的抗原蛋白组学研究方法.它初用于筛选肿瘤相关抗原,之后逐渐被应用于自身免疫性疾病自身抗原的筛选.本文主要综述SEREX的实验流程、 优缺点以及在自身免疫研究方面的应用.
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应用SEREX技术筛选和鉴定肺癌相关抗原的研究进展
目前已从分子水平筛选和鉴定出多种人类肿瘤抗原,这不仅有助于阐明肿瘤免疫的分子机制,而且促进了新的肿瘤免疫治疗方法 的发展.应用SEREX 技术筛选肺癌相关抗原,将为肺癌的早期诊断、免疫治疗和预后监测奠定基础,并为鉴定肺癌相关分子标志物提供候选抗原.
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卵巢上皮性癌SEREX抗原基因TM4SF1、C1D、TIZ原核表达载体的构建及表达
目的:克隆并构建卵巢上皮性癌SEREX抗原基因:TM4SF1、C1D、TIZ的原核表达载体.方法:用PCR从含SEREX抗原基因序列的重组pBK-CMV质粒中扩增TM4SF1、C1D、TIZ的编码序列(coding sequence,CDS),双酶切后插入原核表达质粒pET-30b(+),经酶切及测序鉴定,阳性质粒转化表达菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达目的蛋白,用SDS-PAGE分析表达产物.结果:成功扩增了TM4SF1、C1D、TIZ的CDS,并构建了原核表达质粒pET-30b(+)/TM4SF1、pET-30b(+)/C1D、 pET-30b(+)/TIZ,经测序与Genbank中的相应序列一致.并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达目的蛋白.结论:成功构建了原核表达质粒pET-30b(+)/TM4SF1、pET-30b(+)/C1D、 pET-30b(+)/TIZ,并在大肠杆菌中表达了重组融合目的蛋白,为进一步研究奠定了基础.
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卵巢癌相关抗原cDNA表达文库的筛选
目的:从卵巢癌腹腔积液肿瘤细胞cDNA表达文库中筛选卵巢癌相关抗原.方法:采用SEREX方法从卵巢癌腹腔积液肿瘤细胞构建的cDNA表达文库中筛选阳性克隆.血清学筛选出的阳性克隆与SSH所得的差异表达基因探针进行杂交,终得到特异性较高的阳性克隆.对这些克隆进行酶切鉴定、测序分析.结果:经二轮血清学筛选和Dot Blot杂交,终得到55个在血清中有相应IgG和(或)IgM自身抗体的卵巢癌差异表达的候选肿瘤抗原克隆.经核苷酸测序、序列分析和相似性比对,结果表明这55个EST片段代表45个基因,可分为6类:①3个与已知卵巢癌相关基因相似的基因,如BARD1等;②15个与其它肿瘤相关基因相似的基因,如TM4SF1等;③6个在一些特殊组织中表达的基因,如FXR1(fragile X-related genel,脆性X染色体相关基因1)等;④8个与一些特殊功能蛋白基因相似的基因,如TIZ;⑤5个与胚胎来源的基因相似的基因,如PKHDl等;⑥8个在GenBank中无相似序列的新基因,如OV-189等.结论:SEREX方法与SSH方法相结合筛选肿瘤抗原的技术路线是一种行之有效的、能筛选具有较高特异性肿瘤抗原的策略.本研究为进一步研究这些抗原在卵巢癌的发生、发展及诊断方面的应用奠定了基础.
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NPC相关抗原的血清学分析
目的:对重组克隆表达抗原血清学分析(SEREX)法筛选出的鼻咽癌(NPC)系列肿瘤抗原进行特异性检测,判断新检测出的NPC抗原的相应抗体在NPC病人血清及正常人血清中的阳性率,为NPC抗原对NPC的免疫诊断、免疫治疗积累基础资料.方法:运用噬菌体转染-蛋白印迹、免疫组织化学技术,检测3种NPC肿瘤抗原(GX-NPC-1, GX-NPC-2,GX-NPC-4)在20个NPC病人及15个正常人血清中的阳性表达率.结果:3种NPC肿瘤抗原在NPC病人血清中的阳性表达率分别为55%(11/20)、55%(11/20)、50%(10/20);正常人各为33.3%(5/15)、26.7%(4/15)、6.7%(1/15),经统计学分析,前两种肿瘤抗原在NPC及正常人血清中的表达差异无统计学意义,而GX-NPC-4在两种血清中的表达差异有统计学意义(P<0.01).结论:3种NPC肿瘤抗原中GX-NPC-4抗原在NPC患者的血清中的表达率明显增高,可能为NPC特异性抗原,值得进一步研究.
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应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原
目的:应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原,为鼻咽癌的早期诊断、免疫治疗和预后监测提供候选的生物学指标和理论基础.方法:从鼻咽癌新鲜活检组织中提取mRNA,构建cDNA表达文库.用鼻咽癌患者的血清筛选所构建的cDNA表达文库,获得的阳性克隆经扩增后提取噬菌粒DNA进行测序.所得序列与GenBank数据库中已知基因进行同源比较,分析其生物学特性.结果:所构建的cDNA原始文库含1×106个重组体,蓝白斑试验显示重组率为93%.用鼻咽癌血清对表达文库进行筛选,共获得21个阳性克隆,分别代表14个不同的cDNA插入片段.12个插入片段的DNA序列分别与基因库上的基因有不同程度的同源性,其中6个基因与鼻咽癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另6个基因的生理功能未见文献报道.2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因.结论:SEREX技术是目前筛选肿瘤抗原简便、有效的手段之一.本文研究发现的抗原将为鼻咽癌的研究提供进一步的理论基础.
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鼻咽癌相关抗原的血清学筛选与鉴定
目的有关鼻咽癌肿瘤抗原的研究还仍然集中于研究EB病毒与鼻咽癌的相互关系上,而有关鼻咽癌细胞本身的肿瘤抗原的研究到目前为止还几乎是空白.采用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关肿瘤抗原.方法从鼻咽癌肿瘤组织中提取mRNA;构建鼻咽癌cDNA表达文库;*"利用SEREX技术筛选鼻咽癌cDNA表达文库;对阳性克隆进行测序、生物信息学分析.结果①构建的鼻咽癌cDNA表达文库大小为1.9×108个重组子.②筛选出10个阳性克隆.③测序:有8个阳性结果.④生物信息学分析:除了一些已知的抗原如MAGE外,发现一个热休克蛋白基因家族的新成员,其在染色体水平上与HSPCB有84%的同源性,在氨基酸水平上有97%的同源性.结论结果显示热休克蛋白新成员可能为鼻咽癌的一个新的肿瘤标记物和鼻咽癌疫苗的候选靶分子.
