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大黄素减轻胰腺腺泡AR42J细胞内质网应激的研究
目的:探讨大黄素对胰腺腺泡AR42J细胞内质网应激的影响.方法:AR42J细胞以1×105个/mL接种于6孔培养板中,分为正常对照组、模型组(雨蛙素终浓度为1×10-7 mol·L-1,脂多糖终浓度为10 mg·L-1)、大黄素组(终浓度为10,20,40 μmol·L-1),每组设3个复孔,培养24h待细胞贴壁后弃上清,对照组加入单培、模型组加入用单培配置的造模液、治疗组在加入造模液前15 ～ 20 min分别加入不同浓度大黄素.37℃,5％ C02条件下继续培养3h后,试剂盒检测细胞内蛋白酶、脂肪酶表达水平;光学显微镜观察细胞形态;激光共聚焦显微镜检测内质网钙离子水平;Western blot方法分析内质网应激相关信号分子的蛋白表达情况.结果:大黄素能显著抑制AR42J细胞合成蛋白酶、脂肪酶,减少细胞内钙离子水平,抑制内质网应激.结论:大黄素能够减轻雨蛙素联合脂多糖导致的胰腺腺泡细胞损伤,其作用机制与抑制细胞内钙超载及内质网应激有关.
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Ang 1-7对雨蛙素刺激的胰腺腺泡AR42 J细胞p38 MAPK/NF-κB信号通路的影响
目的：探讨血管紧张素1-7（Ang 1-7）干预雨蛙素（caerulein，CAE）刺激的胰腺腺泡细胞AR42J后，p38 MAPK/NF-κB信号蛋白的表达变化。方法将AR42J细胞随机分为3组：对照组、雨蛙素组（10 nmol/L，CAE组）、Ang 1-7组（10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L Ang 1-7＋10 nmol/L雨蛙素）。对照组为正常生长的AR42J细胞，CAE组用10 nmol/L的雨蛙素刺激AR42J于2 h、6 h、12 h、24 h及48 h收集细胞，Ang 1-7组为不同浓度Ang 1-7作用30 min后再用雨蛙素刺激24 h收集细胞，Western blot技术检测各组细胞中ACE2、Mas受体、p38 MAPK、p-p38 MAPK及NF-κB的蛋白表达。结果 AR42J细胞中可见ACE2-Ang 1-7-Mas受体轴表达；与对照组相比，CAE组ACE2和Mas受体的表达呈先增多后减少的趋势，均于24 h达高峰（ P ＜0.05）；p38 MAPK、p-p38 MAPK及NF-κB的表达亦是24 h达峰值（ P ＜0.05）；Ang 1-7（10-7 mol/L、10-6 mol/L及10-5 mol/L）上调Mas受体的表达，下调p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB蛋白的表达，Ang 1-7的浓度为10-5 mol/L时，后三者的表达水平与CAE组比较，差异均具有统计学意义（ P ＜0.05）。结论雨蛙素刺激的AR42J细胞中，Ang 1-7可通过Mas受体抑制p38MAPK/NF-κB信号通路的活性。
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TLR9在脂多糖诱导的急性胰腺炎体外细胞模型中的作用
目的:探讨Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)在急性胰腺炎发病机制中的作用.方法:不同浓度脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(0、1、10、100 mg/L)刺激AR42J细胞后,RT-PCR法与Western blot法分别检测TLR9、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)P65 mRNA和蛋白质表达的变化,并分析TLR9、P65的相关性;ELISA法检测培养上清液白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)含量.结果:与空白对照组相比,LPS刺激后TLR9、P65 mRNA与蛋白质表达升高,呈浓度依赖性,各组间有显著性差异(mRNA∶F=21.594,F=24.449;蛋白质:F=23.193,F=24.891,均P＜0.01),相关性分析:r=0.942,r=0.900,均P=0.000,TLR9、P65呈正相关.上清液IL-1β、IL-6含量随LPS浓度增加而上升,组间差异有统计学意义(F=45.459,F=62.493,均P＜0.01).结论:LPS刺激AR42J细胞诱导的炎症效应中,TLR9表达上调,可能通过激活NF-κB,从而促进炎症因子合成与分泌,参与急生胰腺炎发病机制.
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不同胆汁酸诱导AR42J细胞凋亡与坏死的作用
目的:探讨7种不同胆汁酸对AR42J胰腺腺泡细胞的损伤作用,检测在各种胆汁酸作用下胰腺腺泡细胞的存活率和凋亡/坏死的改变.方法:以大鼠AR42J胰腺腺泡细胞系为研究对象,应用MTT法检测7种不同胆汁酸对细胞存活率的影响和剂量与时间依赖性,采用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学改变与凋亡/坏死的变化,流式细胞术AV/PI双染法检测细胞的凋亡/坏死卒.结果:CA,GCA和GDCA在0.1-1.0 mmol/L内对AR42J细胞不具有损伤作用;而DCA,CDCA和LCA分别从0.3 mmol/L开始,TDCA从0.4 mmol/L开始,呈剂量依赖性对AR42J细胞产生损伤作用.0.8 mmol/L CA组细胞凋亡率与坏死率同CON组无明显区别(1.2%VS'0.9%;1.0%VS 1.0%,均P>0.05);0.4 mmol/LDCA组细胞凋亡率和坏死率分别为45.2%和8.9%:0.8 mmol/L DCA组细胞凋亡率和坏死率分别为18.6%和45.4%.结论:7种胆汁酸对AR42J细胞的损伤作用不同,主要表现为凋亡或/和坏死,同剂量相关.
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稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系的建立
目的 建立稳定表达增强型GFP (EGFP)-LC3的AR42J细胞.方法 利用慢病毒过表达载体Lentiviral-EGFP-LC3包装成慢病毒,感染大鼠胰腺腺泡细胞AR42J.以Lentiviral-EGFP感染作为阴性对照.通过倒置荧光显微镜观察及流式细胞分析仪检测病毒感染效率,蛋白质印迹法检测稳定传代细胞株的LC3蛋白表达.用毒胡萝卜素处理细胞建立内质网应激模型,采用蛋白质印迹法检测应激的AR42J细胞的LC3、PERK蛋白表达.结果 AR42J细胞的Lentiviral-EGFP-LC3感染效率＞85％,并能稳定传代.Lentiviral-EGFP-LC3感染的AR42J细胞的LC3 mRNA表达量为未感染细胞的(9.14±0.32)倍;LC3蛋白阳性表达并有EGFP-LC3融合蛋白的表达.Lentiviral-EGFP感染的AR42J细胞的LC3 mRNA表达量为未感染细胞的(1.08 ±0.07)倍,无LC3蛋白表达,仅有GFP表达.与未感染组比较,EGFP-LC3组的LC3 mRNA表达显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),而EGFP组的差异无统计学意义.结论 成功构建了稳定表达EGFP-LC3的大鼠胰腺外分泌细胞AR42J,为进一步研究急性胰腺炎与自噬的关系提供了新的细胞模型.
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核因子-κB在脂多糖诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J炎性效应中的作用
目的 探讨核因子-κB(NF-κB)在急性胰腺炎体外模型中的作用.方法 以10 mg/L脂多糖刺激AR42J细胞构建急性胰腺炎的体外模型,设2 h、6 h、12 h、18 h和24 h共5个时间点,每时间点设3个复孔,逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)半定量法观察细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和NF-κB p65亚单位mRNA表达的改变;链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC)检测p65蛋白在AR42J细胞中的表达;人工碘比色法观察培养液上清中淀粉酶的改变.结果 脂多糖刺激后,AR42J细胞以时间依赖方式上调ICAM-1 mRNA和p65 mRNA的表达,24 h达高值;二者之间具有直线相关性(P＜0.01),同时p65蛋白亦呈时间依赖方式表达增强,24 h表达强;各组间淀粉酶无明显改变(P＞0.05).结论 在脂多糖诱导的胰腺腺泡细胞AR42J炎性效应中,NF-κB调控致炎细胞因子ICAM-1的表达.
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脂多糖对AR42J细胞Toll样受体7、9表达的影响
目的 探讨Toll样受体(TLR)7、9在急性胰腺炎(AP)发病机制中的作用.方法 用含1、10、100 mg/L脂多糖的培养基处理正常大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J,构建AP体外细胞模型,以不加脂多糖处理的细胞作为对照组.培养24h后收集细胞及培养上清液.采用RT-PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞TLR7、TLR9 mRNA及蛋白的表达,ELISA法检测培养上清液中TNF-α、IL-10含量.结果 对照组及1、10、100 mg/L脂多糖处理组细胞TLR7 mRNA表达量分别为0.12 ±0.09、0.28 ±0.06、0.49±0.04、0.78 ±0.04;TLR9 mRNA表达量为0.06±0.02、0.32 ±0.03、0.56±0.14、0.84 ±0.12;TLR7蛋白表达量为0.04±0.01、0.26±0.05、0.49 ±0.04、0.77 ±0.16; TLR9蛋白表达量为0.10±0.14、0.62±0.23、1.21 ±0.26、1.75±0.13.培养上清液中TNF-α含量分别为(8.01±5.32)、(25.64±8.71)、(49.06±10.23)、(75.83±6.65) ng/L; IL-10含量分别为(155.54±25.47)、(105.16±10.49)、(69.36±8.19)、(14.07±9.06) ng/L.细胞TLR7和TLR9的mRNA及蛋白表达量、培养上清液中TNF-α含量均随脂多糖浓度升高而逐渐升高,而培养上清液中IL-10含量随脂多糖浓度增加逐渐下降,各组间的差异均具有统计学意义(P值均＜0.01).结论 脂多糖处理AR42J细胞后细胞的TLR7、TLR9基因表达明显上调,提示两者在AP疾病发展中可能发挥重要作用.
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吡格列酮预处理对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎细胞凋亡的影响
目的 研究吡格列酮预处理对雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞(AR42J细胞)凋亡的影响.方法 AR42J细胞分为空白对照组(常规培养)、吡格列酮组(40 μmol/L)、雨蛙肽组(1×10-8 mol/L)、吡格列酮+雨蛙肽组(40 μmol/L吡格列酮+1×10-8 mol/L雨蛙肽)、吡格列酮+GW9662+雨蛙肽组(40 μmol/L吡格列酮+5 μmol/L GW9662+1×10-8 mol/L雨蛙肽).吡格列酮、GW9662早于雨蛙肽30 min加入.在实验的3、6、12和24 h采用MTT法检测各组细胞的增殖率,采用异硫氰酸荧光素Ⅴ/碘化丙啶染色流式细胞术检测细胞凋亡率,脱氧核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,检测各组半胱天冬酶(caspase)-3、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的活性,采用JC-1染色流式细胞术检测细胞的线粒体膜电位.采用单因素方差分析和LSD检验分析数据.结果 作用6、12、24 h时吡格列酮组和吡格列酮+雨蛙肽组细胞的增殖活性分别为0.19±0.02、0.22±0.02、0.36±0.02和0.20±0.04、0.23±0.02、0.38±0.02,分别明显低于空白对照组(0.25±0.04、0.28±0.03、0.46±0.02,t=-3.16、-4.61、-6.25)和雨蛙肽组(0.23±0.02、0.29±0.01、0.46±0.05,t=-1.58、-4.61、-6.15,P均＜0.05),吡格列酮+GW9662+雨蛙肽组细胞增殖活性(0.23±0.02、0.27±0.02、0.45±0.01)高于吡格列酮+雨蛙肽组(t=2.25、3.87、4.56,P均＜0.05).作用6、12、24 h后,异硫氰酸荧光素Ⅴ/碘化丙啶染色流式细胞术发现吡格列酮组和吡格列酮+雨蛙肽组细胞的凋亡率分别为(11.80±0.47)％、(9.62±2.63)％、(14.92±2.52)％和(8.78±0.47)％、(11.89±2.80)％、(14.25±2.67)％,两组间差异均无统计学意义(P均＞0.05),但这两组分别明显高于空白对照组的(5.52±0.64)％、(5.30±0.97)％、(5.47±0.88)％和雨蛙肽组的(5.98±1.21)％、(7.47±0.58)％、(8.11±1.32)％,差异均有统计学意义(t照组=9.81、4.45、10.74,t蛙肽组=4.38、7.62、6.98,P均＜0.05);吡格列酮+GW9662+雨蛙肽组细胞的凋亡率[(5.82±0.26)％、(6.05±0.83)％、(9.23±0.90)％]与雨蛙肽组无明显差异,与吡格列酮+雨蛙肽组相比明显降低(t=-4.63、-10.07、-5.70,P均＜0.05).作用12h时TUNEL染色发现,吡格列酮组的凋亡率[(3.93±0.40)％]明显高于空白对照组[(2.73±0.68)％],吡格列酮+雨蛙肽组细胞凋亡率[(8.43±1.65)％]明显高于雨蛙肽组[(2.80±0.56)％],吡格列酮+GW9662+雨蛙肽组细胞凋亡率[(3.87±0.35)％]低于吡格列酮+雨蛙肽组(t=7.93、8.92、-5.35,P均＜0.05).作用24 h时吡格列酮+雨蛙肽组细胞的半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9活性(1.28±0.05、1.38±0.04、1.53±0.09)与雨蛙肽组(1.12±0.88、1.22±0.02、0.53±0.07)相比显著升高(t=3.20、8.62、1.29,P均＜0.05),经GW9662干预后,半胱天冬酶类的活性部分恢复.吡格列酮组、吡格列酮+雨蛙肽组线粒体膜电位改变细胞数目明显多于雨蛙肽处理组[(28.50±0.91)％、(28.20±2.56)％比(15.00±3.67)％,t=8.10、10.02,P均＜0.05],而加入GW9662可使膜电位部分恢复[(20.67±2.20)％].结论 吡格列酮可能通过激活半胱天冬酶的活性,改变细胞膜电位促进AR42J细胞的凋亡,而其拮抗剂GW9662能部分抑制吡格列酮的促凋亡功能.
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抑制Janus激酶/信号转导和转录激活子通路对胰腺腺泡细胞核因子-κB的影响
目的 旨在观察Janus激酶(JAK)/信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)信号转导抑制剂对构建的急性胰腺炎体外模型中核因子(NF)-kB变化及与炎性反应的影响,为急性胰腺炎的治疗提供理论依据.方法 AR42J细胞随机分为4组,对照组、雨蛙素处理组、雷帕霉素(RPM)+雨蛙素处理组、AG490+雨蛙素处理组,于24 h收集细胞,EMSA测定NF-κB活性,免疫荧光及Western印迹法测定NF-κB亚基表达,此外.RT-PCR及Western印迹测定肿瘤坏死因子(TNF)α,白细胞介素(IL)-1β和IL-6蛋白及基因表达.结果 雨蛙素处理组于24 h NF-κB活性表达增加,NF-κB抑制蛋白激酶(IkK)β,NF-κB P50及NF-κB P65蛋白水平增高.免疫荧光示NF-κB P65核转位.此外TNFα、IL-1β和IL-6蛋白及mRNA表达于24 h后明显升高(与对照组比较,P<0.05).RPM或AG490治疗组与雨蛙素处理组比较则明显降低NF-κB活性,抑制IkKβ、NF-κB P50及NF-κB表达,减少NF-κB P65核转位.进而使TNFα、IL-1β和IL-6 mRNA和蛋白表达下调(P<0.05).结论 JAK/STAT信号通路可能早期参与胰腺损伤中促炎性细胞因子释放,机制涉及NF-κB通路.关闭JAK/STAT信号通路可作为控制急性胰腺炎中炎性反应的手段之一.
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棕榈酸对大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞凋亡的影响
目的 探讨棕榈酸(palmitic acid,PA)对大鼠胰腺腺泡细胞AR42J的凋亡率的改变及凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3mRNA表达的影响.方法 PA浓度分别为0 mmol/L(正常对照组)、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L刺激AR42J细胞后,应用流式细胞术AV/PI双染法检测细胞的凋亡率,荧光定量PCR法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3 mRNA的表达水平.结果 与正常对照组(0 mmol/L)相比,PA在0.1 mmol/L低浓度时对AR42J细胞不具损伤作用,从0.5 mmol/L开始,PA对AR42J细胞的凋亡率呈浓度、时间依赖性增强,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).荧光定量PCR结果显示PA下调抗凋亡基因bcl-2 mRNA的表达,同时上调促凋亡基因bax、caspase-3 mRNA的表达.结论 不同浓度PA对AR42J细胞的损伤作用不同,主要表现为凋亡与剂量、时间相关,其机制可能是抑制bcl-2 mRNA的表达及促进bax、caspase-3 mRNA的表达.
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雨蛙肽联合脂多糖诱导重度急性胰腺炎体外细胞模型钙通道的变化
目的 应用雨蛙肽联合脂多糖诱导AR42J细胞构建重度急性胰腺炎体外细胞模型,研究该模型构建前后细胞内钙通道的变化.方法 体外培养大鼠AR42J细胞,实验分组设对照组、雨蛙肽处理组、雨蛙肽+脂多糖处理组.采用RT-PCR检测细胞Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Car3.1、Cav3.2 mRNA表达;Western blotting检测细胞Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1蛋白表达水平;以荧光探针Fluo-4-AM标记细胞内游离钙,激光共聚焦扫描显微镜观察[Ca2+]i的变化.结果 药物处理组Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均明显增高(mRNA:F =23.392,46.85,61.338;蛋白:F=33.798,43.588,79.467;P ＜0.01),雨蛙肽+脂多糖处理组与雨蛙肽处理组相比较上述检测指标的mRNA表达量也显著增高(P＜0.01);药物处理组与对照组Cav2.2、Cav3.2mRNA表达水平无明显差异(F=0.175、0.316;P ＞0.05);激光共聚焦显微镜观察结果显示药物处理组比对照组[Ca2+]i升高(F =638.984,P＜0.01),雨蛙肽+脂多糖处理组较雨蛙肽处理组[Ca2+]i也显著升高(P＜0.01).结论 胰腺腺泡细胞内钙超载在雨蛙肽联合脂多糖诱导的重度AP细胞模型发生发展的机制中具有重要作用.
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p38MAPK信号通路在雨蛙素诱导的胰腺AR42J细胞炎症反应中的作用
目的:探讨p38 MAPK信号通路在急性胰腺炎体外模型中的作用.方法:AR42J细胞随机分为3组:正常对照组、雨蛙素组(10-8mol/L雨蛙素)和SB203580组(10 μmol/L SB203580+10-8mol/L雨蛙素).于3 h收集细胞,检测淀粉酶分泌率;免疫荧光染色观察p-p38 MAPK核移位;Western blotting印迹检测p-p38 MAPK和TNF-α蛋白表达;EMSA检测NF-κB活性.结果:与正常对照组比较,雨蛙素组淀粉酶分泌率和TNF-α蛋白水平增高(P<0.01),p-p38 MAPK表达及NF-κB活性表达增加(P<0.01);免疫荧光示雨蛙素组p-p38 MAPK发生了核移位.而与雨蛙素组相比,SB203580组明显降低淀粉酶分泌率和TNF-α蛋白表达(P<0.01),p-p38 MAPK和NF-κB的活性表达也下降(P<0.05);SB203580还抑制了p-p38 MAPK核移位.结论:p38 MAPK通路参与了胰腺细胞内的炎症反应,其机制可能涉及NF-κB通路的活化.
